人IL-37b在大腸埃希菌中的表達(dá)、純化及活性鑒定

李夢(mèng)媛，韋榮飛，徐大模，楊星九，高 苒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100121)

研究報(bào)告

人IL-37b在大腸埃希菌中的表達(dá)、純化及活性鑒定

李夢(mèng)媛，韋榮飛，徐大模，楊星九，高 苒*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100121)

目的 表達(dá)重組IL-37b蛋白并去除內(nèi)毒素，鑒定其活性。方法 構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28/IL-37b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白由Ni2+-NTA凝膠進(jìn)行變性條件下的親和層析純化；用SDS-PAGE分析、考馬斯亮藍(lán)染色鑒定重組蛋白是否為目的蛋白；去除蛋白中原核表達(dá)所產(chǎn)生的內(nèi)毒素；將蛋白作用于受LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)IL-6的表達(dá)水平，鑒定蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果 表達(dá)了純度較好的重組IL-37b蛋白，降低了其中原核表達(dá)所產(chǎn)生的內(nèi)毒素，經(jīng)鑒定其具備良好的生物學(xué)活性。結(jié)論 成功表達(dá)了具備良好生物學(xué)活性的IL-37b蛋白。

IL-37b；表達(dá)；純化；生物學(xué)活性

IL-37是IL-1家族細(xì)胞因子，最初被發(fā)現(xiàn)時(shí)被命名為IL-1F7[1]，目前是IL-1家族中唯一一個(gè)沒有在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有同類分子的細(xì)胞因子[2]。IL-37的基因包含6個(gè)外顯子，其編碼產(chǎn)物有a、b、c、d、e共5種亞型，其中，外顯子1～3編碼IL-37前體蛋白的N末端，外顯子4～6編碼C末端IL-1樣細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)[3]。IL-37b是五種亞型中序列最長(zhǎng)的一個(gè)，共有218個(gè)氨基酸，含有外顯子1、2、4、5、6；其序列在N端有一段前導(dǎo)序列，其中存在一個(gè)caspase-1切割位點(diǎn)，IL-37b前體分子經(jīng)caspase-1切割修飾后成為成熟分子移入細(xì)胞核[4,5]。近年來(lái)，大量研究已證實(shí)IL-37b具有生物學(xué)活性，其能夠作為炎癥抑制因子抑制多種免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答，IL-37b對(duì)外源性刺激誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎、胰腺炎等多種炎癥性疾病中都能夠發(fā)揮抗炎作用[6-11]。

目前，國(guó)外已有商品化的IL-37b蛋白，但價(jià)格比較昂貴，商品包裝量較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)成本較低廉、操作較便捷的技術(shù)手段大量表達(dá)IL-37b蛋白，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了鑒定，為進(jìn)一步研究IL-37b在相關(guān)炎癥性疾病中的機(jī)制提供了條件。

1 材料和方法

1.1 材料

含有全長(zhǎng)IL-37b編碼區(qū)基因的質(zhì)粒pGEM-T-IL-37b以及表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5α購(gòu)自天根生物公司，Taq聚合酶、限制性內(nèi)切酶、pET28a(+)質(zhì)粒等購(gòu)自Takara公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。Ni2+-NTA凝膠購(gòu)自Novagen公司，透析袋購(gòu)北京自亮藍(lán)生物公司，尿素、Tris-Cl、NaH2PO4、考馬斯亮藍(lán)等化學(xué)試劑購(gòu)自Amresco公司。內(nèi)毒素去除和檢測(cè)試劑盒購(gòu)自金斯瑞生物公司，IL-37抗體購(gòu)自Abcam公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自中杉金橋生物公司。RAW 264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，LPS(Lipopolysaccharide)購(gòu)自Sigma公司，ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司，96孔酶標(biāo)板購(gòu)自COSTAR公司，預(yù)染蛋白分子量marker與BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo公司。引物合成服務(wù)由英濰捷基(上海)公司提供，DNA序列測(cè)定服務(wù)由北京美吉生物提供。

1.2 方法

1.2.1 IL-37b基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

IL-37b基因模板來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室制備的含IL-37b全長(zhǎng)編碼區(qū)基因的質(zhì)粒pGEM-T-IL-37b。以質(zhì)粒pGEM-T-IL-37b為模板，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)IL-37b編碼區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物F1：5’-GGAATTCCA TATGTCCTTTGTGGGGGAGAAC-3’(下劃線為NdeI酶切位點(diǎn))；下游引物F2：5’-CGGAATTCCTA ATCGCTGACCTCACTGGGGCTC-3’(下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行膠回收，收集擴(kuò)增的目的基因片段，用于連接構(gòu)建表達(dá)載體。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NdeI分別對(duì)目的基因的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET28a(+)進(jìn)行雙酶切，再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)膠回收純化收集酶切產(chǎn)物，于室溫過(guò)夜連接，構(gòu)建表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，取100 μL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。次日，挑選菌落進(jìn)行PCR，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果后，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，檢測(cè)IL-37b基因片段是否正確插入，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pET28/IL37b。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化

轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET28/IL-37b進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，將其均勻涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板上，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單個(gè)菌落接種至3～4 mL LB液體液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行少量培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液按1∶500的體積比接種到更多LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行37℃，200 r/min振搖培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間檢測(cè)菌液OD600值。培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)蛋白，繼續(xù)37℃振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)16～18 h后，以4℃，4000 r/min條件離心30 min，收集菌體沉淀。用PBS重懸沉淀，經(jīng)超聲破碎，12000 r/min再次離心20 min，分別取細(xì)菌裂解產(chǎn)物的上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的表達(dá)形式[12]。電泳結(jié)果顯示細(xì)菌裂解產(chǎn)物的上清和沉淀中都有外源性重組蛋白表達(dá)的條帶，表明重組IL-37b具有可溶性和包涵體兩種表達(dá)形式。由于沉淀中的目的重組蛋白較多，故再次實(shí)驗(yàn)時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)1 L菌液，離心并超聲破碎菌體后，收集其沉淀進(jìn)行純化。重組IL-37b蛋白帶有6個(gè)His標(biāo)簽，采用Ni2+-NTA凝膠進(jìn)行變性條件下的親和層析純化，變性結(jié)合緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 8.0；變性漂洗緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 6.3；變性洗脫緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 4.5；具體步驟按Merck的His Tag蛋白純化操作手冊(cè)進(jìn)行。純化完成后，通過(guò)PBS對(duì)重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，除去其中的尿素，于4℃環(huán)境透析24 h，每2～3 h更換一次透析液。

1.2.3 SDS-PAGE電泳與Western blot

配制12～15%的分離膠，將純化蛋白過(guò)程中收集的各組溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)對(duì)電泳膠染色，至能明顯觀察到marker與蛋白條帶后，用乙酸脫色液洗滌至條帶清晰，于紫外顯影儀下觀察蛋白條帶。另外對(duì)一塊膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，按1∶1000的比例用IL-37抗體4 ℃孵育過(guò)夜。次日，用0.1%的PBST洗膜去除非特異性結(jié)合，加入1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，洗膜后加顯影液，觀測(cè)蛋白條帶。

1.2.4 去除重組蛋白內(nèi)毒素并鑒定內(nèi)毒素殘留量

使用金斯瑞生物的內(nèi)毒素去除試劑盒與內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒，通過(guò)凝膠吸附法除去重組蛋白溶液中的內(nèi)毒素，并檢測(cè)去除內(nèi)毒素后蛋白中內(nèi)毒素殘留量。

去除內(nèi)毒素前調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至6.0～9.0之間，以達(dá)到更好的去除效果。首先使用3～4倍柱體積的再生緩沖液活化柱中的內(nèi)毒素吸附樹脂，控制流速在0.25 mL/min，確保體系內(nèi)無(wú)熱原；隨后用3～4倍柱體積的平衡緩沖液平衡樹脂，流速控制在0.5 mL/min；開始去除內(nèi)毒素，加入樣品，流速控制在0.25 mL/min，用無(wú)熱原接收管收集流出液；柱子經(jīng)再生后可重復(fù)使用或4 ℃保存。

用試劑盒中的無(wú)熱源水溶解鱟變形細(xì)胞溶解物(limulus amebocyte lysate，LAL)檢測(cè)蛋白溶液中的內(nèi)毒素含量。按1∶50～1∶3200梯度稀釋重組蛋白樣品；分別將0.1 mL的LAL溶液與同體積的蛋白樣品混勻，37℃孵育1 h，觀察LAL與蛋白樣品是否凝固成膠狀物質(zhì)。按樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算內(nèi)毒素含量，若其含量達(dá)不到預(yù)期要求，可對(duì)柱中樹脂進(jìn)行再生，再次去除內(nèi)毒素。

1.2.5 重組蛋白生物學(xué)活性的鑒定

采用0.05～200 ng/mL不同濃度梯度的重組蛋白與終濃度1 μg/mL LPS共同作用于RAW 264.7細(xì)胞，37℃培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，收集培養(yǎng)上清，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)上清中IL-6的表達(dá)量。步驟如下，提前1 d在96孔板上包被捕獲抗體，室溫過(guò)夜。次日棄去舊液，用0.05%的PBST洗滌3次，用1% BSA室溫封閉1 h。棄去舊液，洗滌后加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品與稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，室溫封閉2 h。棄去舊液，洗滌后加入檢測(cè)抗體，室溫封閉2 h。棄去舊液，洗滌后加入HRP，避光室溫孵育20 min。棄去舊液，洗滌3次，加入按體積比1∶1混合的顯色液A液與B液，避光孵育10～20 min，隨后加入終止液終止顯色反應(yīng)。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的OD值，按照OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)其方程計(jì)算樣品中IL-6表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在500 bp左右有一條符合預(yù)期結(jié)果的目的基因條帶，如圖1所示；質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、NdeI雙酶切后，在500 bp左右處也有一條與目的基因大小相符的條帶。DNA測(cè)序結(jié)果與BLAST分析顯示PCR擴(kuò)增出的片段無(wú)堿基突變；構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET28/IL-37b，通過(guò)菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增出的基因片段同樣在500 bp處，也與預(yù)期結(jié)果相符。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示IL-37b基因片段正確插入表達(dá)載體pET28a(+)質(zhì)粒中，堿基無(wú)突變，可進(jìn)一步用于目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

注：1：IL-37b基因的PCR產(chǎn)物；2：pET28a/IL-37b質(zhì)粒經(jīng)Nde I/EcoR I雙酶切的結(jié)果。圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR與酶切產(chǎn)物Note. 1: PCR Results of IL-37b gene; 2: Result of pET28/IL-37b by Nde I/EcoR I digestion.Fig.1 Identification of PCR and dual-enzyme digestion products by agarose gel electrophoresis

2.2 重組蛋白的表達(dá)與鑒定

SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌液在25 kDa左右處有一條與預(yù)期相符合的高表達(dá)外源性蛋白條帶，與預(yù)期蛋白的相對(duì)分子量相符合；純化后的蛋白中除一條目的條帶外未見其他條帶；Western Blot結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)的重組IL-37b能夠與相應(yīng)的IL-37抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，其條位置正確，大小相符[6,13]，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液裂解產(chǎn)物的Western Blot結(jié)果則沒有相應(yīng)的條帶。經(jīng)檢測(cè)從1 L大腸桿菌培養(yǎng)液的菌體沉淀中共純化得到約40 mg左右的重組IL-37b蛋白。

注：1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解液；2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解液；3：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解液沉淀；4：純化后的IL-37b；5：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白的Western blot結(jié)果；6：重組IL-37b的Western blot結(jié)果。圖2 IL-37b純化的SDS-PAGE分析以及Western blot鑒定Note. 1: Total cell lysates before IPTG induction; 2: Total cell lysates after IPTG induction; 3: IPTG-induced cell lysate precipitation; 4: Purified IL-37b protein; 5: Western blot analysis of bacterial proteins before IPTG induction; 6: Western blot for recombinant IL-37b protein. Fig.2 SDS-PAGE and Western blot analysis of the purified IL-37b

2.3 去除重組蛋白內(nèi)毒素并鑒定內(nèi)毒素殘留量?jī)?nèi)毒素檢測(cè)試劑

盒中LAL的靈敏度為0.25 EU/mL，計(jì)算公式：內(nèi)毒素含量=0.25 × 樣品稀釋倍數(shù)/樣品濃度。經(jīng)公式計(jì)算去除內(nèi)毒素后重組IL-37b的內(nèi)毒素殘留量范圍大約在0.04～0.07 EU/μg范圍內(nèi)。(見表1)

表1 重組IL-37b中的內(nèi)毒素殘留量

注：“+”：樣品凝固；“-”：樣品未凝固。

Note. “+”：The sample solidified；“-”：The sample was not solidified.

2.4 重組蛋白生物學(xué)活性的鑒定

用RAW 264.7細(xì)胞檢測(cè)重組IL-37b對(duì)LPS刺激的抑制作用。如圖3所示，重組IL-37b在0.05～200 ng/mL時(shí)均能夠抑制LPS刺激引起的IL-6的表達(dá)；且蛋白濃度在10～200 ng/mL時(shí)與LPS對(duì)照組相比差異顯著，表明以此種方式誘導(dǎo)表達(dá)的IL-37b具有良好的生物學(xué)活性。

注：與LPS對(duì)照組比較，*P < 0.05；**P < 0.01。圖3 IL-37b對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞IL-6表達(dá)量的影響Note. Compared with the LPS control group，*P < 0.05；**P < 0.01.Fig.3 Effect of IL-37b on IL-6 production on LPS stimulated RAW 264.7 cells

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原核表達(dá)的方式大量生產(chǎn)包涵體形式的IL-37b蛋白，隨后復(fù)性使其恢復(fù)生物學(xué)活性。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示經(jīng)變性純化的IL-37b中基本無(wú)其他雜蛋白條帶；Western blot結(jié)果顯示重組IL-37b能夠與相應(yīng)的IL-37抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，其條帶清晰，大小正確，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相符[6,13]。證明通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的純化方式能夠快捷、大量地得到純度較好的IL-37b。

LPS系革蘭陰性菌細(xì)胞壁外表層的內(nèi)毒素脂多糖，在細(xì)菌死亡細(xì)胞受到破壞后釋放。LPS性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫，能夠引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克等癥狀[14]。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)凝膠吸附法去除了重組IL-37b樣品中的大部分內(nèi)毒素，降低了IL-37b在發(fā)揮治療與免疫功能的過(guò)程中對(duì)細(xì)胞、機(jī)體產(chǎn)生的毒副作用，也減小了將其應(yīng)用于其他實(shí)驗(yàn)研究時(shí)產(chǎn)生的誤差。

細(xì)菌、病毒感染以及IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)正常細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，IL-6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能，如誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化、B細(xì)胞抗體表達(dá)等，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的標(biāo)志性細(xì)胞因子之一[15]。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞中IL-6的表達(dá)量，以此檢測(cè)重組蛋白對(duì)促炎性細(xì)胞因子的抑制作用。RAW 264.7細(xì)胞系小鼠來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞，自身不表達(dá)IL-37，避免了對(duì)實(shí)驗(yàn)的背景干擾[2]；重組IL-37b在0.05～200 ng/mL時(shí)均能在不同程度上抑制LPS刺激引起的IL-6的表達(dá)；且蛋白濃度低至10 ng/mL時(shí)，其IL-6的表達(dá)量與LPS對(duì)照組相比仍存在顯著差異，證明表達(dá)的IL-37b經(jīng)純化后具備良好的生物學(xué)活性。

目前，商品化IL-37蛋白包裝量較少，價(jià)格昂貴，有些不具備生物學(xué)活性，只能在某些實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照品使用。本實(shí)驗(yàn)成功制備了純度較好、內(nèi)毒素含量低并具備良好生物學(xué)活性的IL-37b，為今后進(jìn)一步研究IL-37b在人類各種疾病中發(fā)揮的機(jī)制提供條件。

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Expression, purification and activity assay of human IL-37b inE.coli

LI Meng-yuan，WEI Rong-fei，XU Da-mo，YANG Xing-jiu，GAO Ran*

(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences & Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

Objective To investigate the expression of recombinant IL-37b protein and removal of the endotoxin, and identify its biological activity. Methods The prokaryotic expression vector pET28/IL-37b was constructed and to transformEscherichiacoli(E.coli) Rosetta. After induction with IPTG, the recombinant protein was purified through Ni2+-NTA gel column and identified by SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining. Then, the endotoxin protein was removed and was treated with LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The culture supernatant was collected. The expression of IL-6 was detected by ELISA and the biological activity of the protein was identified.Results The recombinant IL-37b with high purity was expressed and the endotoxin produced by prokaryotic expression was reduced, and it was identified to have good biological activity. Conclusions In this study a recombinant IL-37b protein with high biological activity is successfully obtained.

IL-37b; Expression; Purification; Biological activity

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)。

李夢(mèng)媛(1988-)，女，研究方向：免疫學(xué)。E-mail：limengyuan767@126.com

高苒(1980-)，女，研究方向：腫瘤學(xué)、免疫學(xué)。E-mail：gaoran26@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0020-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.004

2016-08-26