延齡草與吉林延齡草根莖及須根中3種皂苷成分的含量測(cè)定

楊印軍+孫欣光+楊杰+李齊+張潔+趙陽(yáng)+馬百平+郭寶林

[摘要]比較延齡草與吉林延齡草藥材根莖與須根間主要成分的含量差異，利用HPLCCAD同時(shí)測(cè)定了3種主要成分重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ的含量。色譜條件：TSK gel ODS（46 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱，乙腈水（43∶57）等度洗脫，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。電霧式檢測(cè)器（CAD）：工作氣壓為35 psi（1 psi=6895 kPa），霧化器溫度為35 ℃。3種甾體皂苷良好分離，線性關(guān)系、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)均符合中藥質(zhì)量分析要求。運(yùn)用IBM SPSS Statistics 20分析軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示，頭頂一顆珠的來(lái)源包含了2種延齡草屬植物，且吉林延齡草為主要資源；7批延齡草樣品和9批吉林延齡草的根莖之間3種皂苷成分的含量存在不顯著差異；但是根莖與須根之間3種皂苷成分的含量存在顯著的差異。

[關(guān)鍵詞]HPLCCAD； 延齡草與吉林延齡草； 根莖與須根； 甾體皂苷； 含量測(cè)定； 主成分分析

[Abstract]To compare the differences of main components between in rhizoma and fibrous root of Trillium tschonoskii and T kamtschaticum， a simple， accurate and reliable high performance liquid chromatography coupled with the charged aerosol detector （HPLCCAD） method was developed and then successfully applied for simultaneous quantitative analysis of three compounds， including polyphyllin Ⅶ （T1），pennogenin 3OαLrhamnopyranosyl（1→2） [αLrhamnopyranosyl（1→4）]βDglucopyranoside （T2），polyphyllin Ⅵ （T3）， in 16 batches of rhizome and 14 batches of fibrous root The analytes were well separated from other constituents on TSK gel ODS （46 mm×250 mm， 5 μm） with acetonitrilewater （43∶57） at a flow rate of 10 mL·min-1 The injection volume was 20 μL The nitrogen inlet pressure for the CAD system was 35 psi and the nebulizer chamber temperature was 35 ℃The method was validated for linearity （r>0999 0）， intra and interday precision （029%30%）， repeatability （045%14%）， stability （19%26%）， recovery （1001%1002%， 12%18%）， limits of detection （0002 g·L-1）， and limits of quantification （0005 g·L-1）The obtained datasets were processed by principal component analysis （PCA） and it showed that there was almost no difference in rhizoma of T tschonoskii and T kamtschaticum from different areas of China However， the 3 major compounds existed in rhizoma were different from those in fibrous root of T tschonoskii and T kamtschaticum

[Key words]HPLCCAD； Trillium tschonoskii and Trillium kamtschaticum； rhizoma and fibrous root； steroid saponin； determination； principal component analysis （PCA）

延齡草為百合科延齡草屬植物，全世界共有約50種，我國(guó)有3種，即延齡草Trillium tschonoskii Maxim、吉林延齡草T kamtschaticum Pall，分布于吉林、西藏延齡草T govanianum Wall（僅見于西藏卡馬河下游）[1]。其中，延齡草T tschonoskii被《湖北省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收錄，藥材名頭頂一顆珠，又名芋兒七、佛手七、獅兒七等，藥用部位為根及根莖。其味甘、性平、有小毒，有延年益壽的功效，主治頭暈?zāi)垦?、跌打損傷、神經(jīng)衰弱、高血壓病和腦震蕩后遺癥等疾病，為土家族常用藥材[23]。本課題組在進(jìn)行頭頂一顆珠的產(chǎn)地和市場(chǎng)資源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，目前河北安國(guó)、安徽亳州、四川成都和廣西玉林等藥材市場(chǎng)流通的頭頂一顆珠藥材均為來(lái)自吉林的吉林延齡草，安徽亳州市場(chǎng)的藥材也以黑龍江產(chǎn)為主，中藥材天地網(wǎng)誠(chéng)實(shí)通平臺(tái)銷售的頭頂一顆珠也是吉林延齡草，表明頭頂一顆珠藥材的來(lái)源值得研究。

延齡草中主要的化學(xué)成分為甾體皂苷，黃酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷等[4]，目前已有延齡草藥材中總皂苷及主要甾體皂苷成分含量測(cè)定的研究報(bào)道[56]，但迄今為止尚未有吉林延齡草的質(zhì)量研究和相關(guān)報(bào)道。本研究利用HPLCCAD測(cè)定2種延齡草藥用部位（根狀莖和須根）中重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ等3種主要皂苷的含量，其中重樓皂苷Ⅶ和重樓皂苷Ⅵ也是重樓中的重要活性成分[78]。同時(shí)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析幾個(gè)重要產(chǎn)區(qū)的延齡草與吉林延齡草之間及根莖與須根之間化學(xué)成分的差異，為延齡草屬藥材合理利用及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

1材料

11實(shí)驗(yàn)樣品

藥材來(lái)源信息見表1，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草T tschonoskii和吉林延齡草T kamtschaticum，對(duì)1份樣品中同時(shí)有根狀莖和須根的，分開2個(gè)部位測(cè)定。

12藥品及試劑

對(duì)照品重樓皂苷Ⅶ（T1），偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖（T2）、重樓皂苷Ⅵ（T3）均為本課題組從延齡草中分離得到，HPLC面積歸一化法測(cè)得純度均≥98%。

乙腈（色譜純）購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；蒸餾水購(gòu)于廣州屈臣氏有限公司。

13主要儀器

Waters 2695分析型高效液相色譜（Empower工作站），配置有Waters 2487 DAD檢測(cè)器，ELSD檢測(cè)器（2000ES，Alltech，USA），CAD檢測(cè)器（Corona Ultra，Thermo Fisher，USA）；TP 600超聲波清洗機(jī)（天鵬電子新技術(shù)有限公司）；BP 211D 1/10萬(wàn)天平（德國(guó)Sartorius公司）。

2方法與結(jié)果

21對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取3種對(duì)照品各1250 mg于5 mL量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，即得250 g·L-1的各對(duì)照品儲(chǔ)備液，并按照T1T2T3（1∶2∶2）配制成含T1，T2，T3分別為05，100，100 g·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

22供試品溶液制備

精確稱取干燥藥材粉末（過40目篩）05 g于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇溶液，稱重，浸泡30 min，常溫下超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用80%甲醇溶液補(bǔ)足失重，搖勻，022 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

23色譜條件

色譜柱TOSOH TSKgel ODS100V （46 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈水（43∶57），等度洗脫15 min；流速10 mL·min-1；電霧式檢測(cè)器（CAD）工作氣壓35 psi（1 psi=6895 kPa）、霧化器溫度35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖如下圖1。

24方法學(xué)考察

241線性關(guān)系精密吸取各混合對(duì)照品儲(chǔ)備液25，50，100，250，500，750，1 000 μL分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得各系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照23項(xiàng)下條件進(jìn)樣20 μL測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)對(duì)照品濃度（X，mg·L-1）進(jìn)行線性回歸，得各對(duì)照品回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。以信噪比S/N=3為基準(zhǔn)，測(cè)得最低檢測(cè)限，以信噪比S/N=10為基準(zhǔn)，測(cè)得最小定量限，結(jié)果見表2。

242精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液按23項(xiàng)下色譜條件，于同1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，對(duì)照品重樓皂苷Ⅶ，偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ的日內(nèi)峰面積 RSD分別為062%，041%，029%；連續(xù)3 d內(nèi)每天連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得日間峰面積RSD分別為30%，18%，21%，表明儀器精密度良好。

243重復(fù)性試驗(yàn)取樣品粉末（JR1）6份，分別按22項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按23項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，計(jì)算樣品中重樓皂苷Ⅶ，偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ含量的RSD分別為14%，045%，058%，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

244穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液（JR1），分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算重樓皂苷Ⅶ，偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ峰面積的RSD分別為26%，19%，19%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

245加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的供試品粉末（JR1）9份，每份各約 025 g，精密稱定，分別置于50 mL離心管中，精密加入含T1，T2，T3分別為15，55，62 g·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液800，1 000，1 200 μL，按照21項(xiàng)下方法平行制備，23項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，測(cè)得T1，T2，T3的平均回收率見表3，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

25樣品的含量測(cè)定

樣品測(cè)定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示延齡草及吉林延齡草根莖中重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ的量為451～1357，1228～3347，1452～4006 mg·g-1；延齡草及吉林延齡草須根中重樓皂苷Ⅶ的量為587～1825 mg·g-1，而偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖和重樓皂苷Ⅵ在本實(shí)驗(yàn)條件下僅可在部分須根樣品檢測(cè)到。

26結(jié)果分析

以延齡草及吉林延齡草根莖中3種甾體皂苷的含量為基礎(chǔ)，采用IBM SPSS Statistics 20分析軟件進(jìn)行主成分分析，制成散點(diǎn)圖，見圖2。同樣地，以延齡草及吉林延齡草根莖和須根中3種甾體皂苷的含量為基礎(chǔ)，采用該分析軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖3。圖2中不同產(chǎn)地延齡草及吉林延齡草根莖各樣本互相混雜分布，說明二者之間無(wú)明顯差異。其中陜西產(chǎn)一份延齡草樣品（YR5）未檢測(cè)到重樓皂苷Ⅵ，而黑龍江產(chǎn)吉林延齡草（JR4）中重樓皂苷Ⅵ含量非常高，從而與其余樣品差異較明顯。圖3結(jié)果可見，根莖樣本與須根樣本可以基本分為2類，

不同部位之間差異比較顯著。

3討論

31樣品提取條件的優(yōu)化

樣品提取過程中考察了超聲提取法和加熱回流提取法，通過比較3種待測(cè)成分的峰面積發(fā)現(xiàn)，二者提取效果相當(dāng)，故選擇操作簡(jiǎn)便、快速的超聲提取法。超聲提取法中，分別考察了提取溶劑（60%甲醇、80%甲醇、無(wú)水甲醇、60%乙醇、80%乙醇、無(wú)水乙醇）、提取物料比（1∶25，1∶50，1∶75，1∶100）、提取時(shí)間（20，40，60 min）對(duì)待測(cè)成分提取率的影響。最終優(yōu)化的提取條件為80%甲醇作提取溶劑，提取物料比為1∶100，超聲提取40 min。

32檢測(cè)器的選擇

甾體皂苷一般用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）

作為通用型檢測(cè)器，但其靈敏度較低。電霧式檢測(cè)器（CAD）同樣作為通用型檢測(cè)器，且具有較高的靈敏度正得到廣泛使用[910]。文獻(xiàn)報(bào)道[6，11]，待測(cè)3種甾體皂苷在203 nm下有紫外吸收，本實(shí)驗(yàn)考察了DAD，ELSD及CAD 3種檢測(cè)器的靈敏度，檢測(cè)限依次為032，021，004 μg，定量下限依次為056，038，010 μg。所以，本文選擇了靈敏度高的CAD檢測(cè)器。

33延齡草和吉林延齡草藥材比較

延齡草和吉林延齡草植物形態(tài)區(qū)別明顯，但藥用部位為根莖和須根的頭頂一顆珠藥材難以從形態(tài)上區(qū)分和確定來(lái)源物種，《中華本草》記錄的頭頂一顆珠也是來(lái)源于這2個(gè)物種，藥材形態(tài)也未加區(qū)分[12]。《中國(guó)植物志》記載延齡草T tschonoskii分布于云南、四川、湖北、安徽，陜西的秦嶺以南，吉林延齡草T kamtschaticum分布于吉林，地理分布上是完全不同的。為了進(jìn)一步找到區(qū)別二者的方法，本研究組嘗試了DNA條形碼鑒定方法，依據(jù)ITS2序列無(wú)法區(qū)分二者。因此本文從來(lái)源分布上初步認(rèn)定延齡草和吉林延齡草樣品（部分來(lái)自于市場(chǎng)的樣品則與銷售商認(rèn)真溝通確認(rèn)了來(lái)源的產(chǎn)地）。本文實(shí)際的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于延齡草分布局限于1 600 m以上的高海拔地區(qū)，在湖北和重慶更是要2 000 m以上才生長(zhǎng)，資源量很稀少，而吉林延齡草資源較多，所以頭頂一顆珠可能一直是以吉林延齡草為主流的。從本文測(cè)定的16份樣品中3種主要皂苷成分的含量上看，二者沒有差別，建議湖北省藥材標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)增加來(lái)源物種為2個(gè)種。

34延齡草根莖和須根的成分含量比較

2種延齡草的根莖與須根的比較結(jié)果顯示，二者存在較大差異。在15批（除YR5）根莖樣品中，所測(cè)3種成分均存在，其中偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ的含量均比重樓皂苷Ⅶ高，分別是重樓皂苷Ⅶ含量的226～412倍、289～480倍。但在14批須根樣品中均未檢測(cè)到重樓皂苷Ⅵ，僅有5批樣品同時(shí)檢測(cè)到重樓皂苷Ⅶ和偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖。并且14批須根樣品中，重樓皂苷Ⅶ的含量均最高，其中11批高于同批次根莖中的含量，是根莖中的含量145～253倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)重樓相關(guān)研究中也有報(bào)道，重樓須根中重樓皂苷Ⅶ的含量明顯高于根莖中的含量[13]。湖北省藥材標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的藥材來(lái)自于根和根莖，但是本文收集的樣品中有2份是僅有根莖而無(wú)須根的，因2個(gè)部位的成分構(gòu)成上存在差異，建議應(yīng)有所區(qū)別。

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