• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蚯蚓活性組分對四氯化碳誘導小鼠內質網(wǎng)應激所致急性肝損傷的保護作用

    2017-04-05 13:45趙亞飛高楊吳欣芳王建剛段冷昕
    中國中藥雜志 2017年6期
    關鍵詞:肝損傷

    趙亞飛+高楊+吳欣芳+王建剛+段冷昕

    [摘要]該研究旨在探討蚯蚓活性組分(EWAs)對四氯化碳(CCl4)誘導小鼠內質網(wǎng)應激(ERS)所致急性肝損傷的保護作用。腹腔注射10%CCl4制備內質網(wǎng)應激所致急性肝損傷模型;血清生化指標檢測ALT,AST,SOD,GSHPX酶活性及MDA含量變化;計算肝、脾指數(shù);HE染色觀察肝臟病理學變化;TUNEL法檢測肝組織細胞凋亡情況;免疫組織化學法檢測ERS標志性蛋白GRP78和CHOP表達情況;Western blot法檢測ERS相關蛋白的表達水平。結果顯示,與模型組小鼠相比,EWAs的高、中、低劑量組血清學各項指標均有顯著改善(P<005或P<001),肝臟病變范圍減小,且損傷程度明顯減輕,小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均有明顯變化(P<005或P<001);各劑量給藥組的肝組織細胞凋亡指數(shù)明顯下降(P<005或P<001);肝組織中ERS相關蛋白GRP78和CHOP表達水平顯著降低(P<005或P<001),各劑量給藥組均能顯著下調GRP78和CHOP以及CHOP上游信號通路PERKeIF2αATF4的蛋白表達(P<005或P<001)。綜上,EWAs對ERS所致的小鼠急性肝損傷具有顯著保護作用,其機制可能通過抑制氧化應激和ERS,從而減輕肝臟損傷,并可下調ERS標志性凋亡蛋白CHOP表達,抑制細胞凋亡實現(xiàn)的。

    [關鍵詞]蚯蚓活性組分; 內質網(wǎng)應激; 肝損傷; GRP78; CHOP

    [Abstract]To study the protective effect of earthworm active ingredients(EWAs) against endoplasmic reticulum stress(ERS)induced acute liver injury in mice. The model of liver injury was induced through intraperitoneal injection of 10%CCl4. Serum glutamicpyruvic transaminase(ALT), glutamicoxaloacetic transaminase(AST), superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSHPX) activity and malondialdehyde(MDA) concentration were detected by colorimetric method. Histological examination was performed through hematoxylineosin staining and light microscopy, and apoptosis was detected using terminal transferase dUTP nick end labeling. The expressions of ERS related proteins, including glucose regulated protein 78(GRP78), protein kinase Rlike ER kinase(PERK), eukaryotic transcription initiation factor 2α(eIF2α), active transcription factor4(ATF4) and CCAAT/enhancer binding homologous protein(CHOP), were measured by immunohistochemistry and Western blot. According to the results, compared with the model group,serological indexes in the high, middle and low doses of EWAs were significantly improved (P<0.05 or P<0.01), the extent of liver lesion was decreased and the degree of injury was significantly reduced, and that the liver index and the spleen index of mice were significantly changed(P<0.05 or P<0.01). In liver tissue, the expressions of GRP78 and CHOP were significantly decreased(P<0.05 or P<0.01). The protein expressions of GRP78, CHOP and its upstream signaling pathway PERKeIF2ATF4 were significantly decreased in each dose group(P<0.05 or P<0.01). In summary, EWAs has a significant protective effect on ERSinduced acute liver injury, and its mechanism may be correlated with the inhibition of oxidative stress and ERS, and downregulation of ERS marker protein CHOP expression, andinhibition of apoptosis.

    [Key words]EWAs; ERS; liver injury; GRP78; CHOP

    肝臟疾病是影響人類健康最為常見的疾病之一,從傳統(tǒng)中藥或食物中尋找有效部位或有效成分治療肝臟疾病已成為目前研究的熱點[1]。蚯蚓是一種平肝潛陽的傳統(tǒng)中藥,《神農本草經(jīng)》上記載該藥性味咸、寒,歸肝、脾、膀胱經(jīng)?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓具有調節(jié)免疫系統(tǒng)、肝臟和腎臟功能、心血管系統(tǒng)、抗腫瘤和抗氧化作用等[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),蚯蚓活性組分(earthworm active ingredients,EWAs)對衣霉素誘導的內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)所致的L02細胞(人正常肝細胞系)損傷具有顯著的保護作用,可以促進受損細胞的增殖,減輕ERS,抑制ERS所介導的細胞凋亡[3]。本研究旨在探討EWAs對四氯化碳(CCl4)誘導小鼠ERS所致急性肝損傷是否有保護作用及其可能作用機制。

    1材料

    11藥品與試劑EWAs是本實驗室由新鮮冰凍蚯蚓(赤子愛勝蚯蚓)獲得[4],儲存于-20 ℃,黃白色絮狀物,易溶于水,含多肽(75%),多糖(17%),維生素D和無機鹽(如鈣和磷);谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所;TUNEL試劑盒(美國Roche公司);兔IgG免疫組化試劑盒(博士德生物工程有限公司);雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶(protein kinase Rlike ER kinase,PERK)、活化轉錄因子 4(active transcription factor4,ATF4)抗體(美國Santa Cruz公司);真核轉錄起始因子2α(eukaryotic transcription initiation factor 2α,eIF2α),CCAAT/增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding homologousprotein,CHOP)抗體(美國Proteintech Group公司);葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)抗體(美國Abcam公司)。

    12動物清潔級健康昆明種小鼠,雄性,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供,許可證號SCXK(鄂)20100007。

    2方法

    21急性肝損傷模型建立及給藥方案將50只健康雄性小鼠隨機分為5組,正常組、模型組、EWAs低劑量組(EWAsL,3 mg·kg-1·d-1)、EWAs中劑量組(EWAsM,6 mg·kg-1·d-1)、EWAs高劑量組(EWAsH,12 mg·kg-1·d-1)。實驗前適應性喂養(yǎng)1周。正常組和模型組每天皮下注射等體積生理鹽水,給藥組皮下注射不同劑量EWAs,連續(xù)10 d。末次給藥8 h后,除正常組外,其余組腹腔注射10%CCl4[5]大豆油溶液(001 mL·g-1),禁食不禁水,24 h后,摘眼球取血,脫臼處死,摘取肝臟及脾臟,稱重。

    22生化指標檢測摘眼球取血,離心(3 000 r·min-110 min),取血清,按照相關試劑盒說明測定ALT,AST,MDA,GSHPX和SOD含量。

    23肝臟、脾臟指數(shù)計算肝臟指數(shù)(mg·g-1)=肝臟質量(mg)/體重(g),脾臟指數(shù)(mg·g-1)=脾臟質量(mg)/體重(g)。

    24HE及免疫組織化學染色取肝臟組織相同部位固定于10%甲醛溶液中,石蠟包埋,4 μm切片,HE染色后,光學顯微鏡下觀察組織病理變化。免疫組織化學染色程序:脫蠟,水化,3%H2O2室溫孵育10 min,熱抗原修復每次10 min(重復3次),5%BSA封閉30 min(37 ℃恒溫箱),一抗4 ℃過夜孵育:GRP78(1∶250),CHOP(1∶50),PBS洗3遍(每次5 min),二抗孵育30 min(37 ℃恒溫箱),PBS洗,DAB顯色,蘇木精復染45 s,脫水,透明,封片,拍照。利用Image Pro Plus 60軟件對染色結果進行分析處理。

    25肝組織細胞凋亡檢測采用TUNEL法檢測肝臟細胞的凋亡情況,以細胞核呈棕褐色為陽性染色。肝組織切片厚度4 μm,脫蠟、水化;蛋白酶K通透30 min(37 ℃恒溫箱);PBS漂洗3次,加TUNEL反應混合液(TdT熒光素標記的dUTP 1∶9)進行標記反應,37 ℃恒溫箱中孵育30 min;DAB顯色,脫水,透明,封片。結果處理:在光學顯微鏡(×400)下隨機選取5個不同的視野,分別計數(shù)其中的總的細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù),然后計算凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

    26Western blot法檢測肝組織GRP78和CHOP 及其上游通路PERKeIF2αATF4表達情況稱取肝臟組織1 g,加入1 mL細胞裂解液,研磨提取總蛋白,冰浴30 min,4 ℃離心(12 000 r·min-110 min)取上清,測定蛋白含量(BCA法)。取100 μg蛋白樣品進行SDSPAGE電泳,轉膜(400 mA,90 min),5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗4 ℃過夜孵育:GRP78(1∶1 000),CHOP(1∶500),PERK(1∶200),eIF2α(1∶200)和ATF4(1∶200),二抗孵育1 h(室溫),暗室中ECL發(fā)光液顯色,掃描結果。用GelPro Analyzer分析其灰度值,經(jīng)βactin結果校正后,比較各組相對灰度值。

    27統(tǒng)計學分析采用SPSS 170統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,結果用±s表示,不同組間采用單因素方差分析,P<005為有統(tǒng)計學意義。

    3結果

    31EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠血清學指標影響與正常組相比,模型組小鼠血清中ALT和AST水平及其MDA含量顯著升高(P<001),SOD和GSHPX活性顯著降低(P<001)。與模型組相比,EWAs低、中、高各劑量組小鼠血清中ALT和AST水平及其MDA含量均明顯降低(P<005或P<001),SOD和GSHPX活性顯著升高(P<001),且具有劑量依賴性,見表1。

    32EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)影響模型組較正常組肝臟指數(shù)明顯增高(P<001),脾臟指數(shù)顯著減?。≒<001),與模型組相比,高、中、低劑量組各項指標均有顯著改善,具有統(tǒng)計學意義(P<005或P<001),見表2。

    33EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織病理學變化影響正常組小鼠肝組織中肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列,肝小葉結構正常,模型組小鼠肝臟腫大,胞質疏松,出現(xiàn)明顯的片狀壞死和氣球樣變,高、中、低給藥組小鼠肝臟病變范圍減小,且損傷程度隨著藥物濃度的增大而逐步減輕,見圖1。

    34EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝臟細胞凋亡情況的影響正常組小鼠肝臟細胞無明顯凋亡,而模型組小鼠肝臟細胞大量凋亡,凋亡指數(shù)明顯增高(P<001)。與模型組相比,各給藥組小鼠肝臟細胞凋亡指數(shù)均顯著降低(P<005或P<001),見圖2。

    35EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織中GRP78和CHOP表達情況影響模型組ERS標志性蛋白GRP78和CHOP表達水平顯著升高(P<001),中、高劑量組中GRP78蛋白顯著降低(P<001),見圖3,CHOP表達顯著下調(P<001),見圖4。

    36EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織中ERS相關蛋白表達水平影響模型組ERS標志性蛋白GRP78,CHOP及上游信號通路PERKeIF2αATF4表達水平顯著升高(P<001),各給藥組的ERS相關蛋白因子PERK,GRP78和eIF2α表達水

    A正常組;B模型組;CEWAsL;DEWAsM;EEWAsH(圖2~5同)。

    與正常組相比1)P<005,2)P<001;與模型組相比3)P<005,4)P<001(圖3~5同)。

    平均降低,呈一定劑量依賴性,具有統(tǒng)計學意義(P<005或P<001),中、高劑量組中ATF4和CHOP蛋白表達顯著降低(P<001),見圖5。

    4討論

    研究發(fā)現(xiàn)EWAs作為一種新型的保肝藥物,其主要成分是相對分子質量在20 kDa以下的小肽類物質,因此選擇皮下注射的給藥方式。根據(jù)EWAs的急性毒性實驗結果確定該給藥方式下的高、中、低給藥劑量。預先給EWAs 10 d,腹腔注射CCl4建立內質網(wǎng)應激所致急性肝損傷模型,繼續(xù)給藥1 d,24 h處死小鼠,取樣。病理學結果顯示高劑量組未使肝臟損傷恢復到正常水平,可能是損傷后給藥時間過短。

    CCl4是一種誘導肝臟損傷的經(jīng)典化學物質,所致的肝細胞損傷使細胞膜結構和功能發(fā)生改變,產生活性氧攻擊內質網(wǎng)[6],導致過氧化和錯誤折疊蛋白質在內質網(wǎng)腔中堆積,誘導ERS[7],降低抗氧化

    能力,導致自由基增加,從而破壞細胞結構和功能,最終導致細胞死亡[8]。本實驗中,模型組小鼠血清中 ALT,AST,MDA含量均顯著升高,而SOD,GSHPX酶活性明顯降低,提示小鼠體內抗氧化能力明顯下降,可能發(fā)生了氧化應激,出現(xiàn)了急性的肝組織損傷。而給予EWAs治療的小鼠各項指標均有了顯著改善,這也提示EWAs在動物體內具有顯著的抗氧化作用,可能通過減輕氧化應激損傷發(fā)揮其保護作用。

    正常生理情況下,GRP78作為一種重要分子伴侶結合蛋白,與內質網(wǎng)膜上感受態(tài)蛋白PERK、激活作用轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、肌醇酶1α(inositolrequiring enzyme1α,IRE1α)相結合,形成復合物,使感受態(tài)蛋白處于未活化狀態(tài)。致病因子作用下,GRP78從感受態(tài)蛋白上解離,識別和結合內質網(wǎng)腔積累的未折疊蛋白,啟動一系列細胞內信號轉導反應,誘導ERS[9]。強烈

    或長時間的ERS,使機體內GRP78高度表達,因此GRP78的表達水平可以作為ERS發(fā)生的標志之一[10]。ERS發(fā)生時,GRP78從感受態(tài)蛋白上解離,從而使PERK,ATF6和IRE1這3個膜感受態(tài)蛋白活化,進而激活由這3個蛋白介導的信號通路,啟動下游凋亡因子CHOP的表達[11],其中PERKeIF2αATF4途徑是啟動CHOP表達所必須的[12],且活性強于其他通路[13]。本實驗中,重點探討了CCl4誘導的小鼠肝細胞ERS時,GRP78和CHOP[14]以及其上游的PERKeIF2αATF4通路蛋白表達情況,結果發(fā)現(xiàn),模型組小鼠肝組織中GRP78和CHOP蛋白水平明顯升高,且CHOP上游的PERKeIF2αATF4通路蛋白表達也均顯著上調,提示模型組小鼠肝組織可能發(fā)生了ERS時CHOP介導的細胞凋亡,TUNEL實驗結果也證明有大量肝臟組織細胞凋亡。而EWAs給藥組的各項指標均有了明顯的改善,且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性,因此,EWAs對CCl4誘導小鼠ERS所致急性肝損傷的保護作用可能與其下調PERKeIF2αATF4通路蛋白表達,繼而減少CHOP表達,抑制CHOP介導的細胞凋亡,減輕ERS有關。

    綜上,本研究初步探討了蚯蚓活性組分對CCl4誘導小鼠ERS所致急性肝損傷的保護作用及可能作用機制,為深入研究急性肝損傷發(fā)生機制提供了新的參考,也為蚯蚓活性組分最終作為一類保肝藥物在臨床上應用奠定了實驗基礎。

    [參考文獻]

    [1]Chen Wei,He Ying,Jiang Dingwen,et alProtective effect of Fomes fomentarius extracts on CCl4induced acute liver injury in mice[J]Lishizhen Med Mater Med Res,2013,24(3):605

    [2]祝未名中藥地龍的活性成分與藥理作用研究[J]海峽藥學, 2013,25(4):25

    [3]Wang Q, Duan L X, Xu Z S,et alThe protective effect of the earthworm active ingredients on hepatocellular injury induced by endoplasmic reticulum stress[J]Biomed Pharmacother, 2016,82:304

    [4]河南科技大學 一種蚯蚓提取物及其提取方法和應用:中國, 2012100146536[P] 20120116

    [5]黎永華,陶力內質網(wǎng)應激在小鼠急性肝損傷中的作用機制[J]廣東醫(yī)學,2015,36(1):35

    [6]Marumoto Y,Terai S, Urata Y,et al Continuous high expression of XBP1 and GRP78 is important for the survial of bone marrow cells in CCl4treated cirrhotic liver[J]Biochem Biophys Res Commun, 2008, 367(3):546

    [7]Ryusuke Akihara,Takujiro Homma, Jaeyong Lee, et alAblation of aldehyde reductase aggravates carbon tetrachlorideinduced acute hepatic injury involving oxidative stress and endoplasmic reticulum stress[J]Biochem Biophy Res Commun,2016,478(2): 765

    [8]Afzal M,Khan R,KazmiI,et alHepatoprotective potential of new steroid against carbon tetrachlorideinduced hepatic injury[J].Mol Cell Biochem,2013, 2: 355

    [9]Parmar V M, Schroder M Sensing endoplasmic reticulum stress[J]Adv Exp Med Biol, 2012, 738:153

    [10]Schnthal A H Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stresssignaling incancer[J]Biochem Pharmacol, 2013,85: 653

    [11]Rozpdek W, Pytel D,Mucha B The role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP signaling pathway in tumor progression during endoplasmic reticulum stress[J]Author Manuscript, 2016,16(6): 533

    [12]Yang ShuangYan, Wei FuLan, Hu LiHua,et alPERKeIF2αATF4 pathway mediated by endoplasmic reticulum stress response is involved in osteodifferentiation of human periodontal ligament cells under cyclic mechanical force[J]Cell Signal, 2016,28:880

    [13]Rao J, Zhang C, Wang P,et alC/EBP homologous protein (CHOP) contributes to hepatocyte death via the promotion of ERO1α signalling in acute liver failure[J]Biochem, 2015, 466(2):369

    [14]Chen L, Ren F, Zhang H, et al Inhibition of glycogen synthase kinase 3β ameliorates DGalN/LPSinduced liver injury by reducing endoplasmic reticulum stresstriggered apoptosis[J] PLoS ONE, 2012,7(9):e45202

    [責任編輯張寧寧]

    猜你喜歡
    肝損傷
    165例藥物性肝損傷臨床分析
    葵花護肝片聯(lián)合琥珀酸美托洛爾治療高血壓的臨床觀察
    異甘草酸鎂預防奧沙利鉑致肝損傷的療效觀察
    異甘草酸鎂治療重癥手足121病合并肝損傷的療效觀察
    急性胰腺炎肝損傷的發(fā)病機制與防治進展研究張琳
    熒光增強型量子點探針檢測痕量谷氨酸脫氫酶
    銀杏內酯對CCl4誘導的小鼠肝損傷的作用研究
    可以在线观看毛片的网站| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 99国产精品免费福利视频| 国产又爽黄色视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产熟女xx| av国产精品久久久久影院| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产成人欧美在线观看| 久久这里只有精品19| 男人的好看免费观看在线视频 | 在线观看免费午夜福利视频| 99riav亚洲国产免费| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲中文av在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品一区二区三卡| 黄色 视频免费看| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 黄色成人免费大全| 欧美日韩精品网址| 老司机在亚洲福利影院| 欧美日韩av久久| 在线国产一区二区在线| 精品高清国产在线一区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日日夜夜操网爽| 精品一区二区三区av网在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99久久综合精品五月天人人| 大码成人一级视频| 国产亚洲欧美精品永久| 十分钟在线观看高清视频www| 黄色女人牲交| 黄色毛片三级朝国网站| 精品高清国产在线一区| 亚洲国产欧美网| 黑人操中国人逼视频| 色播在线永久视频| 一级a爱视频在线免费观看| 手机成人av网站| 不卡av一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一本大道久久a久久精品| 无限看片的www在线观看| 超碰成人久久| 无限看片的www在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 99久久99久久久精品蜜桃| av电影中文网址| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品99久久99久久久不卡| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品1区2区在线观看.| 手机成人av网站| 女同久久另类99精品国产91| 在线观看免费视频日本深夜| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久香蕉精品热| 国产视频一区二区在线看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品91蜜桃| 动漫黄色视频在线观看| 悠悠久久av| 韩国精品一区二区三区| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久天堂一区二区三区四区| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲久久久国产精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久久久久大精品| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日本免费a在线| 精品福利永久在线观看| a级毛片在线看网站| 一区二区三区精品91| 男人操女人黄网站| 99香蕉大伊视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久国产成人精品二区 | 97碰自拍视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 最好的美女福利视频网| 亚洲国产看品久久| 欧美午夜高清在线| 国产精品二区激情视频| 91成年电影在线观看| 亚洲av电影在线进入| 日日干狠狠操夜夜爽| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 在线观看免费日韩欧美大片| 成人黄色视频免费在线看| 精品无人区乱码1区二区| 国产成人欧美在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品久久午夜乱码| netflix在线观看网站| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 不卡一级毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| 黄色女人牲交| 在线天堂中文资源库| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 高清黄色对白视频在线免费看| 色精品久久人妻99蜜桃| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美黑人精品巨大| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文字幕人妻丝袜制服| 日韩高清综合在线| 99久久国产精品久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产成人免费无遮挡视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 99久久人妻综合| 国产高清激情床上av| 国产三级黄色录像| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲专区国产一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美黑人精品巨大| 亚洲av电影在线进入| 老鸭窝网址在线观看| 成人国语在线视频| 黄片播放在线免费| netflix在线观看网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 91字幕亚洲| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲熟妇熟女久久| 淫秽高清视频在线观看| 免费看十八禁软件| 色婷婷av一区二区三区视频| 黑人猛操日本美女一级片| 中文字幕高清在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产深夜福利视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲一码二码三码区别大吗| 一级作爱视频免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄色a级毛片大全视频| 超碰成人久久| 丝袜在线中文字幕| 亚洲片人在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品久久蜜臀av无| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日韩免费高清中文字幕av| 不卡一级毛片| 天天影视国产精品| 国产午夜精品久久久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产成年人精品一区二区 | 国产高清国产精品国产三级| 欧美日韩一级在线毛片| 夫妻午夜视频| 看黄色毛片网站| 一二三四在线观看免费中文在| 精品人妻1区二区| 亚洲第一青青草原| 欧美激情高清一区二区三区| 成人黄色视频免费在线看| 老司机福利观看| 国产激情欧美一区二区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 黄色视频不卡| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品第一国产精品| 美女国产高潮福利片在线看| 国产xxxxx性猛交| av有码第一页| 男人的好看免费观看在线视频 | 制服人妻中文乱码| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜视频精品福利| 国产一卡二卡三卡精品| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区免费| 妹子高潮喷水视频| 婷婷六月久久综合丁香| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 中文字幕人妻熟女乱码| 免费av中文字幕在线| 一本大道久久a久久精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 免费在线观看完整版高清| 最近最新中文字幕大全免费视频| 极品人妻少妇av视频| xxx96com| 国产精品98久久久久久宅男小说| 成人三级黄色视频| 露出奶头的视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品国产色婷婷电影| 老司机亚洲免费影院| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 黄片小视频在线播放| а√天堂www在线а√下载| 香蕉丝袜av| 极品人妻少妇av视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 成人特级黄色片久久久久久久| 一区福利在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 无人区码免费观看不卡| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 天堂动漫精品| 久久精品91无色码中文字幕| 99久久综合精品五月天人人| 美国免费a级毛片| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一卡二卡三卡精品| 日本a在线网址| aaaaa片日本免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产免费av片在线观看野外av| 久久99一区二区三区| 首页视频小说图片口味搜索| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品国产av在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 人妻久久中文字幕网| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产男靠女视频免费网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品国产亚洲在线| 在线永久观看黄色视频| 亚洲av熟女| 精品午夜福利视频在线观看一区| 美国免费a级毛片| 新久久久久国产一级毛片| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲熟女毛片儿| 午夜福利,免费看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜两性在线视频| 日韩欧美三级三区| 超色免费av| 国产成人av激情在线播放| 超碰97精品在线观看| 国产精品二区激情视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产成年人精品一区二区 | 国产亚洲av高清不卡| 久久天堂一区二区三区四区| 中国美女看黄片| 丰满迷人的少妇在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 深夜精品福利| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 夫妻午夜视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久九九精品影院| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 深夜精品福利| 制服诱惑二区| 国产在线精品亚洲第一网站| 999久久久精品免费观看国产| www.999成人在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲专区中文字幕在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲成a人片在线一区二区| 美国免费a级毛片| 国产xxxxx性猛交| 免费人成视频x8x8入口观看| 黑人猛操日本美女一级片| 黄色成人免费大全| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩免费av在线播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产单亲对白刺激| 9热在线视频观看99| 免费av毛片视频| 久久性视频一级片| 黄片播放在线免费| 999精品在线视频| 国产黄a三级三级三级人| x7x7x7水蜜桃| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一区福利在线观看| 国产精华一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 嫩草影院精品99| 在线av久久热| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产欧美日韩一区二区三| 日韩高清综合在线| 怎么达到女性高潮| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产伦人伦偷精品视频| 校园春色视频在线观看| 一级黄色大片毛片| 国产一区二区三区综合在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 成人永久免费在线观看视频| 午夜a级毛片| 在线观看午夜福利视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品综合久久久久久久免费 | 村上凉子中文字幕在线| 久久99一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产一区二区三区综合在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| a在线观看视频网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品久久久久久,| www.www免费av| 美女福利国产在线| 国产xxxxx性猛交| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | av中文乱码字幕在线| 69av精品久久久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品在线观看二区| 免费搜索国产男女视频| 怎么达到女性高潮| 无遮挡黄片免费观看| 免费看十八禁软件| 91精品国产国语对白视频| 亚洲第一av免费看| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产三级黄色录像| av网站在线播放免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 99久久国产精品久久久| 曰老女人黄片| 日韩三级视频一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 久久精品91蜜桃| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| a级毛片在线看网站| 久久 成人 亚洲| 国产xxxxx性猛交| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲第一青青草原| 最新在线观看一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 天天添夜夜摸| 正在播放国产对白刺激| 久久人人97超碰香蕉20202| 满18在线观看网站| 欧美最黄视频在线播放免费 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久久久亚洲av毛片大全| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久天堂一区二区三区四区| 免费不卡黄色视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久中文字幕一级| 91老司机精品| 国产一区在线观看成人免费| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 午夜福利影视在线免费观看| 久久中文看片网| 日本vs欧美在线观看视频| 国产99白浆流出| 69av精品久久久久久| 中文字幕av电影在线播放| 日本 av在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品久久久久久久久久免费视频 | 中文字幕人妻丝袜制服| 午夜免费鲁丝| 一区福利在线观看| 午夜老司机福利片| 国产亚洲av高清不卡| 免费观看人在逋| 99精品在免费线老司机午夜| 在线观看一区二区三区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产免费现黄频在线看| 伦理电影免费视频| 精品久久久久久,| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品免费视频内射| 日韩欧美免费精品| 一级毛片精品| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 水蜜桃什么品种好| 天天添夜夜摸| 免费在线观看日本一区| 国产av一区二区精品久久| 国产97色在线日韩免费| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 高清av免费在线| av天堂在线播放| 久9热在线精品视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 免费搜索国产男女视频| netflix在线观看网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产高清videossex| 国产野战对白在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 一本综合久久免费| 国产午夜精品久久久久久| 国产人伦9x9x在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久婷婷成人综合色麻豆| 麻豆av在线久日| 亚洲国产精品合色在线| 丝袜美腿诱惑在线| 免费观看精品视频网站| 久久精品国产清高在天天线| 成人亚洲精品av一区二区 | 精品久久久久久电影网| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 中文字幕最新亚洲高清| av在线播放免费不卡| 国产区一区二久久| 日韩精品青青久久久久久| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美亚洲日本最大视频资源| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久 成人 亚洲| 一二三四社区在线视频社区8| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 波多野结衣av一区二区av| 人人妻人人澡人人看| 悠悠久久av| 欧美日韩视频精品一区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 不卡av一区二区三区| 俄罗斯特黄特色一大片| 午夜日韩欧美国产| 黄色视频不卡| 午夜免费鲁丝| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美黑人精品巨大| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 波多野结衣av一区二区av| 性少妇av在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 老汉色∧v一级毛片| 成年人黄色毛片网站| 久久香蕉精品热| www.www免费av| 一级黄色大片毛片| 中亚洲国语对白在线视频| 成年版毛片免费区| 日韩av在线大香蕉| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 女性生殖器流出的白浆| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品二区激情视频| 黄片播放在线免费| 亚洲av美国av| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av美国av| 我的亚洲天堂| www.999成人在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久久久久免费视频了| 日韩欧美三级三区| 9色porny在线观看| 亚洲,欧美精品.| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 久久精品影院6| 窝窝影院91人妻| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区激情短视频| 成人精品一区二区免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产一区二区激情短视频| 国产成人免费无遮挡视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲少妇的诱惑av| 免费不卡黄色视频| 97碰自拍视频| 久久性视频一级片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 久热爱精品视频在线9| 超色免费av| 老司机靠b影院| 国产成人av教育| 国产三级在线视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产一区在线观看成人免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av视频免费观看在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 深夜精品福利| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久国内视频| 欧美日韩黄片免| 日韩有码中文字幕| av天堂在线播放| 精品午夜福利视频在线观看一区| 一区二区日韩欧美中文字幕| av天堂久久9| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲午夜理论影院| 精品免费久久久久久久清纯| 手机成人av网站| 超色免费av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 极品人妻少妇av视频| 丁香欧美五月| 国产精品永久免费网站| 深夜精品福利| 热re99久久国产66热| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| a级毛片黄视频| 99riav亚洲国产免费| 丝袜在线中文字幕| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 美女午夜性视频免费| 中文字幕最新亚洲高清| 国产黄a三级三级三级人| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美在线一区亚洲| 一区二区三区激情视频| bbb黄色大片| 天天影视国产精品| 正在播放国产对白刺激| 在线天堂中文资源库| 美国免费a级毛片|