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    山奈酚延緩db/db小鼠腎損傷研究

    2017-03-27 19:43吳巧敏倪海祥盧笑袁曉駱陽陽金雅
    心腦血管病防治 2017年1期
    關(guān)鍵詞:糖尿病腎病

    吳巧敏 倪海祥 盧笑 袁曉 駱陽陽 金雅美

    【摘 要】:目的 觀察山奈酚(KPF)干預(yù)自發(fā)肥胖2型糖尿病小鼠(db/db鼠)早期糖尿病腎病,并探討相關(guān)機制。方法 24只健康雄性10周齡db/db鼠隨機分為4組:不同劑量KPF給藥組(50、200 mg/kg)、db/db對照組和二甲雙胍(0.2 g/kg)陽性對照組,并設(shè)db/m對照組。連續(xù)灌胃給藥10 周,檢測小鼠血清肌酐(SCr)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α),24小時尿白蛋白排泄率(UAER);留取腎組織,作病理形態(tài)學(xué)檢查、實時定量PCR檢測腎組織TNF-α、IL-6的mRNA表達、Western blot檢測磷酸化核因子κB p65( p-NF-κBp65)、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IκBα)、核因子κB抑制蛋白α激酶(IKKα)蛋白的表達水平。結(jié)果 不同劑量KPF干預(yù)10周,都能使db/db小鼠24小時UAER、SCr、IL-6、TNF-α水平下降,腎組織IL-6、TNF-α基因表達水平明顯降低(P<0.01、0.05),p-NF-κBp65、IKKα和p-IκBα蛋白表達水平下降(P<0.01)。結(jié)論 KPF可通過抑制核因子κB(NF-κB)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),對自發(fā)2型糖尿病小鼠早期的腎臟損害起到保護作用。

    關(guān)鍵詞:山奈酚;糖尿病腎??;抗炎作用

    中圖分類號:R34 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1009_816x(2017)0?_?_0?

    [Abstract] Objective To explore the effects of kaempferol(KPF)on renal tissues and to elucidate its underlying inflammatory molecular mechanism in db/db mice.Methods Twenty-four male db/db mice were randomly divided into four groups:Two groups were orally administered a low or high dose of KPF (50 or 200 mg/kg, respectively), one control group and one positive control (metformin hydrochloride 0.2 g/kg) group. Six male db/m mice were set as normal control group. After 10 weeks treatment, 24 hour urinary albumin excretion (UAER)、SCr were detected; the gene expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α),and interleukin-6(IL-6) were measured by real time PCR; the protein expression of IKKα、phospho-IκBα、phospho-NF-κBp65 were evaluated by Western blotting.Results After 10 weeks of KPF treatment,the urinary albumin excretion and the SCr were reduced,the gene expressions of TNF-α and IL-6 were inhibited.Importantly, the protein expression level of IKKα、phospho-IκBα、phospho-NF-κBp65 in renal tissue was significantly decreased(P<0.01、0.05). Conclusion : Kaempferol has protective effects on renal tissues through inhibiting NF-κB pathway and related inflammation in db/db mice.

    Key words: kaempferol; diabetic kidney disease ; anti-inflammation

    糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,其進展為終末期腎?。╡nd-stage renal disease, ESRD)的速度較一般腎臟疾病更為迅速[1],已成為血液透析治療的最主要的原因。山奈酚(Kaempferol,KPF),是廣泛存在于食物、中草藥中的一種類黃酮化合物,已經(jīng)有多項研究發(fā)現(xiàn)它具有防癌、抗癌、抗氧化、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫等功效[2]。近年來多項體外試驗及動物研究還表明它有抑制β細胞凋亡、改善胰島素敏感性、抑制醛糖還原酶的活性、降低炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等作用,在糖尿病及并發(fā)癥的防治中有很大的應(yīng)用前景[3~5]。然而,有關(guān)KPF防治DKD的動物研究報道很少。先天自發(fā)性肥胖2型糖尿病模型小鼠db/db鼠的糖尿病及DKD進程與人類2型糖尿病及腎病的早期表現(xiàn)極為相似,因此本研究選用該小鼠模型作為研究對象,觀察KPF對2型糖尿病早期DKD的作用,并初步探討可能的分子學(xué)機制,為篩選治療DKD的藥物提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物:無特定病原體級健康雄性10周齡C57BL/KsJ db/db小鼠24只,對照db/m小鼠6只 (南京大學(xué)動物模式所),分別為39~44 g及19~22 g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21~23℃,分籠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng),自由攝水,12 h交替照明。動物實驗符合國家《實驗動物管理條例》和《浙江省實驗動物管理實施辦法》要求。

    1.1.2 主要試劑:KPF(HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%,批號96353,美國Sigma);二甲雙胍(Metformin,上海信宜制藥);血生化測定試劑盒(德賽診斷系統(tǒng)上海有限公司);尿蛋白測定試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)測定ELISA試劑盒購自武漢貝茵萊;Trizol、PCR試劑盒、引物(美國,Thermo);核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB),IKKα(美國,abcam),p-IκBα、p-NF-κB p65、GAPDH兔多抗(美國Cell Signal Technology),二抗羊抗兔等標(biāo)記二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 實驗分組::24只10周齡db/db小鼠,經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,應(yīng)用葡萄糖氧化酶法檢測小鼠血糖(BG),超過11.1 mmol/L的按照數(shù)字表法隨機分為4組:實驗對照組、兩個不同劑量(50mg/kg、200 mg/kg)KPF實驗組及二甲雙胍(200mg/kg)陽性對照組,6只10周齡db/m小鼠作為空白對照組;KPF以植物油將其配成20mg/ml,二甲雙胍用生理鹽水配成20mg/ml;實驗組小鼠每日17:00以相應(yīng)藥物及劑量灌胃1次,空白對照組和實驗對照組則以相同的方式給予等量的植物油。持續(xù)用藥10周。

    1.2.2 標(biāo)本的收集及檢測:10周后,用代謝籠收集大鼠24 h尿液采用酶聯(lián)免疫法測定尿白蛋白排泄率(UAER);經(jīng)心臟穿刺采血,采用日立全自動生化分析儀測定BG、SCr、甘油三酯(TG) 、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),應(yīng)用ELISA法測定血清IL-6和TNF-α水平,由小鼠體重及右腎臟重量得出腎臟指數(shù)(KI,KI=右腎臟重量/小鼠體重)(mg/g)。用10%水合氯醛按0.04 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,取腎組織用4%甲醛固定,用于病理學(xué)檢測。

    1.2.3 采用HPIAS-2000高清晰度彩色圖文病理分析系統(tǒng)軟件進行病理圖像分析:在PAS染色中,每組選8個樣本,每份樣本均在40倍顯微鏡下,視野上、下、左、右、中各取2個腎小球(共10個), 數(shù)碼攝像頭采集腎小球圖像,在高倍鏡下進行病理分析,每個切片隨機選擇10個正切的腎小球,測定腎小球平均截面積(MGA),取其平均值作為每個標(biāo)本的MGA,采用Raij L[6]的半定量評分系統(tǒng)評價腎小球的損傷程度,計算腎小球硬化指數(shù)(GSI)。

    1.2.4 實時定量PCR檢測TNF-α、IL-6的mRNA表達:Trizol提取腎組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR技術(shù)檢測TNF-α、IL-6基因轉(zhuǎn)錄水平,GAPDH作為內(nèi)參,數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析:ABI Prism 7300 SDS Software進行各組間基因轉(zhuǎn)錄水平的比較。1.2.5 Western blot檢測IKKα、p-IκBα及p-NF-κB p65蛋白的表達水平:以GAPDH作為內(nèi)對照,進行各組間蛋白表達的比較,應(yīng)用Image J分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白灰度值,計算相對灰度值,進行組間比較。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    統(tǒng)計軟件用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量數(shù)據(jù)采用 (?X±S)表示,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間比較采用LSD法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組小鼠生化及炎癥指標(biāo)比較: 與db/m組比較,db/db對照組小鼠BG與血脂、KI、SCr、UAER、血清IL-6和TNF-α水平都明顯升高(P<0.01);與db/db對照組相比,不同劑量KPF及二甲雙胍的處理使小鼠BG及SCr、UAER、IL-6、TNF-α水平都有明顯下降(P<0.01),但TG僅在二甲雙胍組及大劑量KPF組有下降(P<0.05), KI僅在二甲雙胍組有下降(P<0.05),TC、LDL-C、HDL-C水平都沒有下降(P>0.05),見表1和表2。

    2.2 腎臟組織學(xué)觀察 光鏡下PAS染色結(jié)果顯示,db/m組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常,毛細血管清晰;db/db對照組腎小球肥大變形,內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯增多,可見部分腎小管上皮細胞空泡變性、排列不整齊;與db/db對照組相比,不同劑量KPF治療組、及二甲雙胍陽性對照組腎小管和腎小球損害明顯減輕,腎組織細胞數(shù)量減少,

    2.3 腎小球截面積(GMA)和硬化指數(shù)(GSI)比較: 與db/m組比較,db/db對照組小鼠GMA和GSI都明顯升高(P<0.01);與db/db對照組小鼠比較,不同劑量KPF或二甲雙胍處理都未能使GMA和GSI發(fā)生明顯變化(P>0.05),見表2

    3 討論

    DKD發(fā)病機制復(fù)雜,近年來,越來越多的證據(jù)顯示炎癥機制與DKD的發(fā)展密切相關(guān),且認(rèn)為DKD是一種炎癥性疾病,阻斷炎癥反應(yīng)的治療方案,有可能成為治療糖尿病腎病的新方法[7]。

    本研究小組的前期研究發(fā)現(xiàn)[5],SD鼠經(jīng)高脂高糖飼料及鏈脲佐菌素(STZ)多次腹腔注射誘導(dǎo)制備2型糖尿病大鼠模型, 較正常對照組大鼠血清IL-6及TNF-a的水平都明顯上升;在本研究中也發(fā)現(xiàn)db/db小鼠較db/m小鼠血清IL-6及TNF-a水平的明顯上升。這些結(jié)果表明炎癥因素在糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生和進展方面都有作用。經(jīng)KPF處理10周后可明顯降低高脂及STZ誘導(dǎo)的SD大鼠血糖水平,改善胰島素抵抗,恢復(fù)血脂至正常水平,且伴有血清IL-6及TNF-a水平的明顯下降[5]。在本實驗中,以db/db小鼠為研究對象,同樣的方法KPF或二甲雙胍處理10周,血糖有明顯下降,雖不能使小鼠血脂水平有改善,但小鼠尿蛋白排泄率及血肌酐有明顯下降,也能明顯降低小鼠血清IL-6及TNF-a水平,腎組織的IL-6 mRNA及TNF-a mRNA的表達水平也明顯下降,且腎組織病理表現(xiàn)為腎小管和腎小球損害明顯減輕,腎組織細胞數(shù)量減少。這些都表明KPF可通過抑制炎癥因子的表達減輕db/db小鼠的腎臟損傷。另外,雖然同為嚙齒類動物,高脂食物和藥物誘導(dǎo)的2型糖尿病SD鼠和先天性瘦素受體基因突變的自發(fā)2型糖尿病小鼠db/db鼠對于KPF及二甲雙胍這兩種藥物血脂的反應(yīng)不同,可能同兩種動物血脂升高的機理不完全相同有關(guān),也可能與用藥時間較短,以及實驗動物數(shù)量較少導(dǎo)致的統(tǒng)計誤差。

    對于KPF抑制炎癥因子表達的分子學(xué)機制,本實驗進行了初步的探討。已知有多種信號通路參與或介導(dǎo)DKD的炎癥反應(yīng)過程。核因子κB(Nuclear Factor-kappa B,NF-κB)是廣泛存在于細胞質(zhì)中的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,可調(diào)控多種基因的表達,包括IL-6、TNF-a基因等,在DKD發(fā)病中起著重要作用[8]。越來越多的證據(jù)表明,NF-κB信號通路是許多DKD致病因素連接的細胞信號通路的核心[9],是腎小球系膜細胞表達多種免疫炎癥相關(guān)基因的調(diào)控樞紐。NF-κB的活化是一個非常復(fù)雜的過程,IkBa的磷酸化是NF-κB活化的關(guān)鍵。未活化的NF-κB存在于細胞質(zhì)中,以P65亞基與IkB-a結(jié)合,覆蓋在P50核定位信號上,在細胞中以P50-P65-IkB-IX多聚體的形式處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細胞受到細胞因子、LPS、氧自由基等刺激時,激活I(lǐng)KKa使IkB-a磷酸化為p-IKBα從NF-κB復(fù)合物上解離,導(dǎo)致NF-κB活化進入細胞核中,與相應(yīng)的靶基因相結(jié)合,從而產(chǎn)生大量炎性介質(zhì),引發(fā)炎癥反應(yīng)[10]。腎組織p-NF-κBp65、IKKα和p-IKBα升高,都提示NF-κB信號通路的激活。本研究發(fā)現(xiàn),20周齡的db/db小鼠腎組織p-NF-KBp65、IKKα和p-IKBα蛋白表達水平較同齡的db/m小鼠顯著上升;而經(jīng)過50mg/kg或200mg/kg KPF每日灌胃10周處理的db/db小鼠,出現(xiàn)血糖下降,雖血脂未明顯變化,但p-NF-KBp65、IKKα和p-IKBα蛋白的表達水平明顯下降,伴隨著腎組織IL-6及TNF-a mRNA的表達水平、血清IL-6及TNF-a水平明顯下降,提示KPF可通過抑制NF-κB信號通路的激活,進而下調(diào)TNF-α、 IL-6等炎癥因子表達起到抗炎、保護腎臟的作用。

    本研究充分說明了KPF在治療2型糖尿病早期腎臟并發(fā)癥中的療效,提示其可能成為DKD綜合治療中的一個極具潛能的藥物,也將為DKD的防治開辟一個新的途徑。

    參考文獻

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    (收稿日期:2016-11-21)

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