CDX2基因干擾對人結(jié)腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響

李孝彬，鄭見寶，孫學(xué)軍，崔飛博，余鈞輝，王訓(xùn)凱，韓陽，王愷

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 普通外科，陜西 西安 710061）

結(jié)腸癌（colon cancer）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，位居癌癥發(fā)病率的第3位和癌癥相關(guān)病死率的第4位[1-2]，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[3]。尾型同源盒基因2（caudal-related homeobox 2，CDX2）屬于同源盒基因（homeobox genes）家族中的一員，是腸道特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對胚胎期消化道特別是結(jié)腸和小腸上皮的發(fā)育起著關(guān)鍵的作用，而且在成人結(jié)直腸上皮組織的分化和增殖調(diào)控中起著重要的作用[4-5]。結(jié)腸癌中存在著不同程度的CDX2表達(dá)缺失，惡性程度越高缺失就越嚴(yán)重，提示CDX2可能是一種抑癌基因[6]。目前干擾結(jié)腸癌細(xì)胞系中CDX2基因表達(dá)促進(jìn)增殖的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚未見報(bào)道，本研究擬通過構(gòu)建好的穩(wěn)定CDX2基因干擾的結(jié)腸癌細(xì)胞株和對照細(xì)胞株種植于裸鼠皮下，構(gòu)建人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型，在體內(nèi)水平初步探討CDX2對結(jié)腸癌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒與實(shí)驗(yàn)動物 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和HT29均為本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。慢病毒載體GV248-CDX2（CDX2-shRNA）、陰性病毒載體（NT-shRNA）由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成。36只4周齡雌性BALB/c裸鼠，平均質(zhì)量13～16 g，購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，動物合格證號為SCXK（京）2012-0001，在西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清為美國Gibco公司生產(chǎn)，RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Corning公司產(chǎn)品，CDX2兔抗人一抗（D11D10）購自美國CST，Ki-67兔抗人一抗（PB0065）購自武漢博士德生物。二抗試劑盒多聚體抗兔IgG-HRP（SV0002）購自武漢博士德生物。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)定CDX2基因干擾的結(jié)腸癌細(xì)胞株建立及Western blot鑒定 在無菌24孔培養(yǎng)板中接種處于對數(shù)生長期的SW480、HT29細(xì)胞（5×104/孔），置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)按轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI）=10進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為3組，只加轉(zhuǎn)染試劑組（空白對照組）、轉(zhuǎn)染GV248-CDX2組（轉(zhuǎn)染組）、轉(zhuǎn)染陰性對照組（陰性對照組）。12 h后用含10%血清的的新鮮培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后用嘌呤霉素進(jìn)行篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒載體的細(xì)胞株。將SW480、HT29細(xì)胞接種于12孔板，收集各組細(xì)胞各5×106個，使用細(xì)胞裂解液提取蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白含量測定。取 40 μg蛋白行 10% SDSPAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶TBST溶液37 ℃封閉 1 h，加入兔抗人 CDX2 抗體（1:1 000），于 4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次；加入二抗羊抗兔抗體1:5 000稀釋液，常溫孵育1 h，TBST洗膜8 min×4次，置入ECL顯影劑中1 min，在凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.2.2 結(jié)腸癌細(xì)胞株單細(xì)胞懸液制備 取對數(shù)生長期的各結(jié)腸癌細(xì)胞株，用0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化1 min，含培養(yǎng)基血清終止消化，180×g離心5 min；棄上清，無血清培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2～3次（除去培養(yǎng)液中所含蛋白質(zhì)），PBS溶液混懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，制成終濃度為107個/mL的單細(xì)胞懸液備用。

1.2.3 裸鼠移植瘤模型的建立 取36只雌性裸鼠，隨機(jī)分成6組，每組6只，分別于左腋下皮下注射各組腫瘤細(xì)胞100 μL（細(xì)胞密度均為1×107個/mL）。細(xì)胞種植完成后，每日觀察并記錄腫瘤出現(xiàn)時(shí)間，于 6、9、12、15、18、21、24、27 d 測量腫瘤的最長徑和最短徑，根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積，計(jì)算公式V=πab2/6（V：體積，a：腫瘤長徑，b：腫瘤短徑），繪制裸鼠腫瘤體積-時(shí)間曲線，橫向比較3組情況。28 d后處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織，電子天平稱量腫瘤質(zhì)量，取下的腫瘤組織一部分福爾馬林固定，另一部分液氮中凍存，用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測各組移植瘤中Ki-67蛋白表達(dá)情況 按常規(guī)方法制作病理組織切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)。用免疫組化SABC法染色，一抗Ki-67稀釋比例為1:400，嚴(yán)格按照二抗試劑盒多聚體抗兔IgG-HRP（SV0002）說明書進(jìn)行操作。用已知結(jié)腸癌組織切片做陽性對照，以PBS代替一抗做陰性對照。光鏡下觀察細(xì)胞著色情況。

1.2.5 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 由2位病理科醫(yī)師雙盲閱片，參照Berry等[7]提出的基于3個參數(shù)的半定量計(jì)數(shù)方法，按細(xì)胞中Ki-67陽性細(xì)胞所占百分率和著色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分，每張組織切片隨機(jī)選取10個高倍視野，計(jì)數(shù)300個細(xì)胞。首先對陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分，不表達(dá)記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；然后對陽性細(xì)胞率計(jì)分，陽性細(xì)胞比率＜25%記1分，陽性細(xì)胞占比26%～50%記2分，陽性細(xì)胞占比51%～75%記3分，陽性細(xì)胞占比＞76%記4分。兩者積分乘積為最后得分，定義為0～1分為陰性,2～3分為弱陽性（+），4～5分為陽性（++），＞6分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.2.6 Western blot檢測移植瘤CDX2表達(dá)水平將移植瘤標(biāo)本從液氮中取出，稱量40 mg置于標(biāo)記好的玻璃勻漿器內(nèi)，快速研磨，提取組織蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白含量測定，Western blot檢測移植瘤CDX2表達(dá)水平（步驟如上）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用ANOVA方差分析，等級資料用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定干擾CDX2表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞株篩選及鑒定

慢病毒載體轉(zhuǎn)染人SW480、HT29結(jié)腸癌細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察到90%以上細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白。用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HT29和SW480細(xì)胞株，2周后熒光顯微鏡下觀察幾乎每個細(xì)胞中表均達(dá)綠色熒光蛋白（圖1）。Western blot結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組SW480和HT29細(xì)胞CDX2呈高表達(dá)，干擾組SW480和HT29細(xì)胞CDX2表達(dá)水平較空白對照組低70%以上（圖2）。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株 A、C：嘌呤霉素篩選2周后光鏡下觀察（×200）；B、D：嘌呤霉素篩選2周后熒光顯微鏡下觀察（×200）Figure 1 Infection of colon cancer cells with lentivirus A, C: Microscopic observation at 2 weeks after puromycin screening (×200);B, D: Fluorescence microscopic observation at 2 weeks after puromycin screening (×200)

圖2 Western blot分析CDX2表達(dá) A：SW480；B：HT29Figure 2 Western blot analysis of CDX2 protein expression A: SW480; B: HT29

2.2 穩(wěn)定干擾CDX2基因表達(dá)促進(jìn)移植瘤的生長

各組細(xì)胞接種裸鼠皮下4～6 d后均可觸及腫瘤，于第6天開始每天測量腫瘤長徑、短徑，繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果顯示兩種細(xì)胞干擾組的移植瘤生長速度均明顯快于各自的空白對照組和陰性對照組（均P＜0.05），空白對照組和陰性對照組生長速度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）（圖3）。各組皮下移植瘤從第20天開始均出現(xiàn)不同程度的腫瘤破潰，28 d后處死裸鼠，完整剝離腫瘤并稱重，不同組腫瘤大小和質(zhì)量如圖4所示，SW480干擾組質(zhì)量明顯高于SW480空白對照組和SW480陰性對照組[（679.11±102.07）mgvs.（379.36±82.32）mg；（679.11±102.07）mgvs.（362.58±88.89）mg]；HT29干擾組組質(zhì)量明顯高于空白對照組和HT29陰性對照組[（715.78±103.50）mgvs.（427.07±77.30）mg；（715.78±103.50）mgvs.（420.99±78.00）mg]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），兩種細(xì)胞空白對照組和陰性對照組腫瘤質(zhì)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.3 兩種細(xì)胞不同處理組皮下移植瘤的病理學(xué)觀察

剝脫瘤體后沿腫瘤長徑切開，肉眼見各組人結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤均呈類球狀、駝峰狀或分葉狀生長，質(zhì)韌而硬，切面呈灰白色。HE染色后，在光鏡下可見皮下移植瘤細(xì)胞形狀不規(guī)則，大小不一，核大而深染，核漿比例明顯增大，核異型明顯，有病理性核分裂像，腫瘤大致呈實(shí)性團(tuán)塊或小條索狀排列，確認(rèn)為未分化或低分化腺癌（圖5）。

圖3 各組皮下移植瘤生長曲線 A：SW480；B：HT29Figure 3 The growth-curves of the subcutaneous xenografts in each group A: SW480; B: HT29

圖4 各組皮下移植瘤大體標(biāo)本及腫瘤質(zhì)量比較 A：SW480；B：HT29Figure 4 The specimens of the xenografts in each group and comparison of the tumor weights A: SW480; B: HT29

圖5 各組裸鼠皮下瘤的HE染色（×200）Figure 5 HE staining of the xenografts in each group (×200)

2.4 兩種細(xì)胞不同處理組皮下移植瘤中Ki-67表達(dá)情況

Ki-67是一種比較肯定的核增殖標(biāo)志物，其表達(dá)主要位于細(xì)胞核內(nèi)[8]，陽性表達(dá)表現(xiàn)為淡黃色、棕黃色或棕褐色。兩種細(xì)胞干擾組的移植瘤中均見Ki-67高表達(dá)，而空白對照組和陰性對照組表達(dá)較弱（圖6）。參照Berry N評分結(jié)果，SW480干擾組得分明顯高于SW480空白對照組和SW480陰性對照組[（4.00±1.10）vs.（2.83±0.43）；（4.00±1.10）vs.（2.67±0.52）]；HT29干擾組得分明顯高于HT29空白對照組和HT29陰性對照組[（4.83±2.31）vs.（2.67±0.82）；（4.83±2.31）vs.（2.50±0.55）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。Ki-67陽性細(xì)胞比率方面，SW480干擾組得分明顯高于SW480空白對照組和SW480陰性對照組[（30.17±7.14）vs.（2 1.1 7±7.7 6）；（3 0.1 7±7.1 4）v s.（19.17±4.22）]；HT29干擾組得分明顯高于HT29空白對照組和HT29陰性對照組[（40.50±11.26）vs.（19.83±9.04）；（40.50±11.26）vs.（18.67±5.61）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖6 免疫組化檢測各組移植瘤組織Ki-67表達(dá)（×200）Figure 6 Immunohistochemical staining for Ki-67 expression in the xenografts of each group (×200)

2.5 兩種細(xì)胞不同處理組皮下移植瘤中CDX2表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示兩種細(xì)胞的空白對照組和陰性對照組的瘤組織在35 kDa左右處均出現(xiàn)較強(qiáng)的特異性條帶，而干擾組則較弱（圖7）?；叶戎涤?jì)算結(jié)果顯示兩種細(xì)胞干擾組瘤組織CDX2蛋白的表達(dá)均明顯低于各自空白對照組和陰性對照組（均P＜0.05），而空白對照組和陰性對照組比較則均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；裸鼠體內(nèi)shRNA的干擾效率仍能維持在70%左右。

圖7 Western blot檢測各組移植瘤組織CDX2表達(dá) A：SW480；B：HT29Figure 7 Western blot analysis of CDX2 protein expression in the xenografts of each group A: SW480; B: HT29

3 討 論

腸上皮的發(fā)生、分化和增殖過程都是由腸道特異性基因精密調(diào)控的，這些基因包括Muc2、MOK（MAPK/MAK/MRK overlapping kinase）、LI-黏蛋白（liver-intestine cadherin）、ACAT2（acetoactyl-coenzyme aathiolase）等，這些基因的啟動子區(qū)都存在著CDX2的特異性結(jié)合位點(diǎn)，所以CDX2的表達(dá)狀況直接影響這些基因的表達(dá)，即這些基因可看作是CDX2的直接靶基因[9]。CDX2基因位于染色體13q12-13上，是一種腸特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育腸道形成中起關(guān)鍵作用，并與細(xì)胞的凋亡、黏附、侵襲和遷移有關(guān)[10-12]。CDX2高表達(dá)時(shí)，CDX2和腸道特異性基因的啟動子結(jié)合，促進(jìn)靶基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)胚胎極性的形成、器官的發(fā)生和組織的腸性分化，當(dāng)CDX2低表達(dá)或不表達(dá)時(shí)，則促進(jìn)細(xì)胞的增生和加快細(xì)胞的代謝，并進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9,13-15]。結(jié)腸腺瘤是結(jié)腸癌的癌前病變，在正常結(jié)直腸黏膜上皮-腺瘤-腺癌的發(fā)展過程中，CDX2的表達(dá)呈明顯的下降趨勢，表明CDX2的表達(dá)下調(diào)可能與正常結(jié)直腸黏膜上皮向結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)[16-17]。Chawengsaksophak等[18]研究發(fā)現(xiàn)，采用同源重組技術(shù)敲除小鼠的CDX2基因后，在12～28周內(nèi)基因型為CDX2（+/-）的小鼠大部分體內(nèi)可形成錯構(gòu)瘤性息肉和管狀腺瘤，同時(shí)基因型為CDX2（-/-）的小鼠會在胚胎期內(nèi)停止發(fā)育或死亡。CDX2在正常結(jié)腸組織中的表達(dá)顯著高于結(jié)腸癌組織，CDX2表達(dá)缺失與較高的腫瘤分級、較晚的腫瘤分期、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[6,19-21]。本課題組前期研究[22]表明CDX2蛋白癌組織中表達(dá)降低，正常結(jié)直腸黏膜組織中陽性率為95.0%，而在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)陽性率僅為69.4%，并且CDX2表達(dá)缺失與腫瘤的分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)。多項(xiàng)研究[20,23-24]表明CDX2表達(dá)的缺失還可作為結(jié)直腸癌高危因素和預(yù)后不良的評估指標(biāo)之一。在探討CDX2對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，本課題組前期通過構(gòu)建CDX2過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞系并制備皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)CDX2過表達(dá)組移植瘤質(zhì)量較空白對照組和陰性對照組明顯減輕（P＜0.05），這提示CDX2對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長有抑制作用[25]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CDX2對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和生長的影響，本研究在結(jié)腸癌細(xì)胞系中干擾CDX2表達(dá)并構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型，裸鼠皮下接種結(jié)腸癌細(xì)胞4～6 d后均可以觸及皮下腫瘤，且接種SW480干擾組細(xì)胞裸鼠的腫瘤生長速度相對其他兩組（SW480空白對照組、SW480陰性對照組）明顯增快，而SW480空白對照組與SW480陰性對照組組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29皮下移植瘤模型中也得到了同樣的結(jié)果。Ki-67是一種比較肯定的核增殖標(biāo)志物，參照Berry N評分結(jié)果各組移植瘤中Ki-67表達(dá)情況，在SW480和HT29各不同處理組中，干擾組得分均明顯大于相應(yīng)空白對照組和陰性對照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上，在體內(nèi)情況下CDX2可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和生長。CDX2基因作為一個結(jié)腸癌中重要的抑癌基因，可作為結(jié)腸癌的生物靶向治療的新靶點(diǎn)。

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