進(jìn)展期胃癌SOX新輔助化療敏感性相關(guān)基因及信號(hào)通路的生物信息學(xué)分析

馮道夫，何向輝，章志翔

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 普通外科，天津 300052）

胃癌是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在2015年中國(guó)的癌癥發(fā)病率與致死率統(tǒng)計(jì)中高居第2位[1]。在亞洲，進(jìn)展期胃癌的治療方案主要是根治性手術(shù)聯(lián)合輔助化療。多樣的聯(lián)合化療方案已被證實(shí)具備有效性[2-3]。在日本，替吉奧聯(lián)合順鉑新輔助化療方案已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于III期胃癌患者[4]。盡管胃癌患者的總體生存率在聯(lián)合治療下有所提高，但化療未緩解者常常無(wú)法及時(shí)接受更為敏感的化療藥物治療[5]。因此，通過(guò)差異基因表達(dá)譜來(lái)判斷新輔助化療藥物的敏感性顯得尤為重要。本研究主要關(guān)注替吉奧聯(lián)合奧沙利鉑（SOX）新輔助化療不同療效所引起的差異基因表達(dá)情況。以術(shù)后大體標(biāo)本作為研究對(duì)象，分為緩解組、未緩解組及未行新輔助化療者3組進(jìn)行兩兩比較。對(duì)于SOX方案而言，替吉奧與奧沙利鉑的耐藥性主要與葉酸代謝及DNA損傷修復(fù)有密切關(guān)系。本研究以DNA損傷修復(fù)和葉酸代謝為重點(diǎn)，分析基因表達(dá)譜與胃癌化療藥物的耐藥性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

按照TNM分期[6]，所有患者均被臨床診斷為局部進(jìn)展期胃癌（T3/T4，N+，M0）。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)基于筆者之前的研究結(jié)果[7]?；颊咝杞邮?個(gè)周期的新輔助化療方案。D2根治術(shù)是以日本胃癌研究學(xué)會(huì)指南作為標(biāo)準(zhǔn)[8]。依據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)[9]及大體組織標(biāo)本判斷腫瘤療效，6例緩解者組織樣本作為緩解組；6例未緩解者組織樣本為未緩解組；3例未行新輔助化療者組織樣本為未化療組。

1.2 高通量基因芯片技術(shù)

按TRIzol方法抽提胃癌組織R N A，采用RNeasy Mini Kit進(jìn)一步純化RNA，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳判斷28S和18S的核糖體峰值比來(lái)評(píng)價(jià)RNA的質(zhì)量。利用Affymetrix公司的GeneChip PrimeView人類基因表達(dá)列陣對(duì)15例手術(shù)組織標(biāo)本進(jìn)行分析。采用表達(dá)譜芯片配套試劑盒GeneChip 3'IVT Express Kit說(shuō)明和標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)樣品RNA進(jìn)行進(jìn)一步放大、標(biāo)記和純化。采用基因芯片掃描儀3000進(jìn)行信號(hào)收集。通過(guò)信號(hào)直方圖、相對(duì)信號(hào)箱圖、皮爾森相關(guān)性及主成分分析來(lái)保障基因芯片的質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Gene Math 2.0軟件進(jìn)行聚類分析，對(duì)緩解組、未緩解組及未化療組的上調(diào)或下調(diào)基因進(jìn)行比較。應(yīng)用Gene Ontology（GO）分析對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行分類[10]。根據(jù)美國(guó)生物技術(shù)信息國(guó)立中心的重要功能分類，可以把GO分為分子功能、生物學(xué)途徑及細(xì)胞組件3部分?；赟OX方案的耐藥機(jī)制，DNA損傷修復(fù)（GO：0006281）和葉酸代謝（GO：0006766）作為重點(diǎn)的分析對(duì)象，篩選出相關(guān)的差異基因。在確定差異基因基礎(chǔ)上，通過(guò)KEGG來(lái)解釋每個(gè)差異表達(dá)基因所在通路[11]。以P＜0.05判斷通路顯著性，篩選有意義的目標(biāo)通路。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件及Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用ANONA和χ2檢驗(yàn)對(duì)緩解組、未緩解組及未化療組之間進(jìn)行多重比較。Fisher檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)主要針對(duì)GO分類進(jìn)行研究。差異倍數(shù)（FC）為待比較兩個(gè)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后信號(hào)的比值，本研究差異基因篩選的閾值設(shè)定為FC＞1.5。

2 結(jié) 果

2.1 基因表達(dá)分析

6例緩解者、6例未緩解者與3例未行化療樣本3組進(jìn)行差異基因識(shí)別。為了證實(shí)3組直接的關(guān)系，對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。在緩解組與未緩解組中，共識(shí)別458個(gè)上調(diào)基因和241個(gè)下調(diào)基因。緩解組與未化療組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)108個(gè)上調(diào)基因和283個(gè)下調(diào)基因。而未緩解組與未化療組比較時(shí)，共有172個(gè)上調(diào)基因和85個(gè)下調(diào)基因。為了能夠更好地理解SOX新輔助化療耐藥性的分子機(jī)制，利用GO分類和KEGG進(jìn)行功能和通路分析。

2.2 功能分析

在新輔助化療中，主要GO分子功能與生物學(xué)途徑進(jìn)行基因表達(dá)分析。緩解組與未緩解組中，GO生物學(xué)途徑的分析結(jié)果主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育、生物代謝過(guò)程、RNA代謝過(guò)程及蛋白代謝過(guò)程。GO分子功能主要是受體活性、跨膜受體活性、低密度脂蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（表1）。由此可知，SOX方案的耐藥性與受體相互作用、信號(hào)通路、細(xì)胞代謝、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等有所關(guān)聯(lián)。

緩解組與未化療組進(jìn)行比較時(shí)，GO生物學(xué)途徑主要是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育及細(xì)胞大分子代謝過(guò)程。GO分子功能是酶調(diào)節(jié)活性、激酶活性、蛋白激酶活性及受體結(jié)合。該結(jié)果表明，新輔助化療腫瘤組織的敏感性與化療所致藥理作用可能會(huì)使兩者間存在差異。對(duì)未緩解組與未化療組進(jìn)行比較，但GO生物學(xué)途徑和分子功能均沒(méi)有得到有意義的數(shù)據(jù)。

表1 緩解組與未緩解組GO分子功能與生物學(xué)途徑的基因表達(dá)分析Table 1 Analysis of gene expressions related to the GO ontologies of molecular function and biological process of the responder group and non-responder group

2.3 通路分析

以KEGG公共Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，分析SOX新輔助藥物耐藥性的差異基因所在通路及某個(gè)Pathway中基因富集度的顯著性水平。在緩解組與未緩解組中，差異基因主要與NK細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子配體受體相互作用有關(guān)。其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的目標(biāo)通路主要涉及受體相互作用與信號(hào)通路等方面。而緩解組與未化療組比較時(shí)，表達(dá)基因主要與MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡及Toll樣受體信號(hào)通路有關(guān)。

2.4 SOX方案耐藥相關(guān)生物標(biāo)記物

在緩解組和未緩解組中，HUS1、RECQL5及XRCC4可能與該類藥物耐藥性有關(guān)（表2）。緩解組與未緩解組比較，GADD45G下調(diào)顯著；而在緩解組與未化療組中，該基因上調(diào)顯著。BTG2僅在緩解組與未化療組對(duì)比中出現(xiàn)下調(diào)。在未緩解組與未化療組比較中，DDB2明顯下調(diào)。對(duì)于葉酸代謝而言，在3組比較中，本研究未找到任何差異基因。

表2 DNA損傷修復(fù)相關(guān)的差異基因Table 2 Differentially expressed genes associated with DNA damage repair

3 討 論

最近幾十年中，新輔助化療成為進(jìn)展期胃癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段之一。多項(xiàng)臨床研究[12-13]表明術(shù)前化療比術(shù)后治療具有一定優(yōu)勢(shì)。在這些研究中，由于DNA損傷修復(fù)及葉酸代謝機(jī)制，某些患者對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，而無(wú)法從治療方案中獲益。因此，為了能夠提供最佳的治療方案，采用特異性的基因表達(dá)來(lái)識(shí)別緩解者與未緩解者顯得尤為重要[14]。

很少有文獻(xiàn)報(bào)道胃癌SOX方案及相關(guān)差異基因表達(dá)的情況。Omura等[15]發(fā)現(xiàn)5種特異的miRNA與替吉奧輔助化療后的胃癌復(fù)發(fā)情況有關(guān)。筆者[7]之前的研究已經(jīng)表明，SOX新輔助化療應(yīng)用于II、III期胃癌患者具有安全性與有效性。而在新輔助化療過(guò)程中，部分腫瘤并沒(méi)有變化。因此，進(jìn)展期胃癌SOX新輔助方案的藥物敏感性研究是必要的。

基于功能與通路分析，緩解組與未緩解組比較，差異基因主要高表達(dá)于細(xì)胞因子相互作用及NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路。表明SOX方案的緩解情況可能與免疫應(yīng)答有關(guān)。在緩解組與未化療組比較，基因表達(dá)也集中于NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路上。為了排除化療藥物的藥理學(xué)反應(yīng)，在未緩解組與未化療組進(jìn)行比較，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異基因表達(dá)。

有文獻(xiàn)[16-18]報(bào)道，鉑類藥物及氟尿嘧啶類藥物的耐藥性主要與DNA損傷修復(fù)與葉酸代謝通路有關(guān)。在DNA損傷修復(fù)通路中，ERCC1的表達(dá)越高與患者預(yù)后越差[19]。本研究中，緩解組與未緩解組比較中，共發(fā)現(xiàn)5種差異基因。其中，HUS1編碼的蛋白能夠形成Rad9-Rad1-Hus1復(fù)合物，其與細(xì)胞周期停滯有關(guān)。Ishikawa等[20]報(bào)道，低表達(dá)的HUS1與胃癌高惡性程度有關(guān)。緩解組HUS1的高表達(dá)結(jié)果與該結(jié)論一致。RECQL5是RecQ解旋酶其中一種，能夠維持基因組穩(wěn)定性并參與錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程。Futami等[21]研究表明喜樹(shù)堿的化療敏感性提高與RECQL5下調(diào)有關(guān)。本研究表明，RECQL5在生物代謝過(guò)程與核酸代謝過(guò)程起到重要作用。GADD45G是Gadd45家族中的重要成員，可作為功能性腫瘤抑制基因與治療靶點(diǎn)。Ying等[22]的研究表明，GADD45G的表達(dá)與腫瘤縮小有關(guān)。本研究中GADD45G的表達(dá)可能與化療效果的影響有關(guān)。BTG2與XRCC4的表達(dá)目前沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，仍需進(jìn)一步研究。最近的研究[23-24]表明，二氫嘧啶脫氫酶（DPD）的表達(dá)與胃癌術(shù)后S-1輔助化療有關(guān)，故本研究對(duì)葉酸代謝通路也進(jìn)行分析，然而沒(méi)有找到該通路的差異基因，這與筆者之前的研究結(jié)果是一致的[25]。綜上所述，生物信息學(xué)技術(shù)可應(yīng)用于局部進(jìn)展期胃癌SOX新輔助化療方案來(lái)評(píng)估化療緩解情況，并且發(fā)現(xiàn)緩解組高表達(dá)基因與免疫信號(hào)通路相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的3種差異基因仍需要大型臨床試驗(yàn)及樣本進(jìn)一步證實(shí)。

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