Pyk2、Twist及MMP—7在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

左凱　薛棟　孔麗　夏修良

【摘要】 目的：檢測(cè)肝癌組織中富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）、Twist和基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）的表達(dá)，并分析它們相互之間的關(guān)系及其臨床意義。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)80例肝癌組織及癌旁肝組織中Pyk2、Twist及MMP-7蛋白的表達(dá)情況，分析其與臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果：Pyk2在肝癌組織及癌旁肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.3%、12.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Twist在肝癌組織及癌旁肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.3%、6.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MMP-7在肝癌組織及癌旁肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.8%、8.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pyk2陽(yáng)性表達(dá)與肝癌病理分級(jí)、分化程度、血管侵犯及TNM分期明顯相關(guān)（P<0.05），Twist陽(yáng)性表達(dá)與肝癌病理分級(jí)、分化程度、血管侵犯及TNM分期明顯相關(guān)（P<0.05），MMP-7陽(yáng)性表達(dá)與肝癌病理分級(jí)、分化程度、血管侵犯及TNM分期明顯相關(guān)（P<0.05）。肝癌組織中，Pyk2與Twist表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），Pyk2和MMP-7表達(dá)亦呈正相關(guān)（P<0.05），Twist和MMP-7表達(dá)亦呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：Pyk2、Twist和MMP-7蛋白的表達(dá)水平在肝癌組織中與腫瘤組織的分化程度、病理分級(jí)、血管侵犯及臨床TNM分期等均有關(guān)。因此，臨床聯(lián)合檢測(cè)Pyk2、Twist和MMP-7對(duì)肝癌患者的預(yù)后判斷具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 肝細(xì)胞癌； 富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2； Twist； 基質(zhì)金屬蛋白酶-7； 免疫組織化學(xué)

Expression and Signifance of Pyk2，Twist and MMP-7 in Hepatocellular Carcinoma/ZUO Kai，XUE Dong，KONG Li，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：045-048

【Abstract】 Objective：To study the expressions and their clinical significance of Pyk2，Twist and MMP-7 in hepatocellular carcinoma.Method：The expressions of Pyk2，Twist and MMP-7 proteins were tested by immunohistochemistry in 80 cases of hepatocellular carcinomas and adjacent paracancerous tissues.Result：The positive rate of Pyk2 in hepatocellular carcinomas was significantly higher than that of adjacent paracancerous tissues（71.3% vs 12.0%，P<0.05）.Significant differences were also observed in the expression rate of Twist between the patients with hepatocellular carcinomas and paracancerous tissues（66.3% vs 6.0%，P<0.05）.The positive rate of MMP-7 in hepatocellular carcinomas was significantly higher than that of adjacent paracancerous tissues（68.8% vs 8.0%，P<0.05）.The differences of the expression of Pyk2 in hepatocellular carcinoma of pathological grading，tumor differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage were significant（P<0.05）.The differences of the expression of Twist in hepatocellular carcinoma of pathological grading，differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage were also significant（P<0.05）.The differences of the expression of MMP-7 in hepatocellular carcinoma of pathological grading，differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage were also significant（P<0.05）.Significantly positive correlation was found between Pyk2 and Twist by using spearman correlation analysis（P<0.05）.There was positive correlation between Pyk2 and MMP-7 （P<0.05）.There was positive correlation between Twist and MMP-7（P<0.05）.Conclusion：The expressions of Pyk2，Twist and MMP-7 are related to the pathological grading，differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage，and their combined detection can help estimate the outcomes of the patients.

【Key words】 Hepatocellular carcinoma； Proline-rich tyrosine kinase-2； Twist； MMP-7； Immunohischemistry

First-authors address：The Peoples Hospital of Binzhou City，Binzhou 256610，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.012

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)較常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。近年來(lái)，盡管肝癌的治療方法和技術(shù)取得了很大的進(jìn)步，但其總的5年生存率沒(méi)有顯著提高，局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其主要原因[1]。因此，尋找有效的分子靶點(diǎn)一直都是肝癌靶向治療的研究熱點(diǎn)。富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，是粘著斑激酶 （focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）家族的一個(gè)新成員，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)，Pyk2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、膀胱癌[5]等腫瘤組織中高表達(dá)，并且與腫瘤分期及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Twist基因是堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix loop helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)重要成員，Twist與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的一類蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7]。本研究采用免疫組織化學(xué)（EnVision）方法觀察Pyk2、Twist及MMP-7在肝癌中的表達(dá)并探討其臨床腫瘤學(xué)意義，為臨床判定肝癌惡性程度、選擇治療方式及評(píng)價(jià)預(yù)后提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究通過(guò)濱州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取2006年2月-2012年2月濱州市人民醫(yī)院肝細(xì)胞癌手術(shù)切除臨床標(biāo)本，共80例，其中配對(duì)癌旁組織（距離癌組織邊緣<3 cm）50例。男56 例，女24例，年齡33～79歲；53例腫瘤直徑<5 cm，27例腫瘤直徑≥5 cm。所有標(biāo)本病理診斷均為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，術(shù)前未接受過(guò)放、化療等抗腫瘤治療，依據(jù)2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ、Ⅱ期共51例，Ⅲ、Ⅳ期共29例。

1.2 試劑與方法 選取病理科存檔的腫瘤組織蠟塊，病理科醫(yī)師重新切片診斷，進(jìn)一步行病理學(xué)分級(jí)，分別實(shí)施Pyk2、Twist和MMP-7免疫組織化學(xué)染色，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)Pyk2、Twist和MMP-7蛋白的表達(dá)。兔抗人Pyk2單克隆抗體、兔抗人Twist多克隆抗體及兔抗人MMP-7多克隆抗體（均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司），工作濃度均為1∶200。EnVision試劑盒（購(gòu)自丹麥Dako公司），操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照為試劑公司提供的強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本切片，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) Pyk2蛋白陽(yáng)性：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒；Twist蛋白陽(yáng)性：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒；MMP-7蛋白陽(yáng)性：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在不知任何背景資料的情形下，由兩位病理專家采用雙盲法進(jìn)行閱片。首先依據(jù)染色強(qiáng)度打分：無(wú)染色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分（染色需與背景著色相比較）。再將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行打分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記為0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比（1%～25%）記為1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比（26%～50%）記為2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比（51%～75%）記為3分；陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比（76%～100%）記為4分。最后將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比乘積打分，≥4分記為免疫反應(yīng)陽(yáng)性，<4分記為免疫反應(yīng)陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)采用Spearman。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中Pyk2、Twist、MMP-7表達(dá)的比較 Pyk2陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核未見(jiàn)明顯染色，染色為棕黃色或棕褐色，小片狀或彌漫性分布。兩者Pyk2陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。Twist蛋白的陽(yáng)性著色位于細(xì)胞質(zhì)，染色為棕黃色顆粒。兩者Twist陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。MMP-7蛋白的陽(yáng)性著色主要位于細(xì)胞質(zhì)，染色呈棕黃色或棕褐色顆粒。兩組MMP-7陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表1。

2.2 Pyk2、Twist和MMP-7蛋白表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系 肝癌中Pyk2陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及AFP等均無(wú)關(guān)（P>0.05）。Pyk2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵犯及臨床TNM分期均有關(guān)（P<0.05）。肝癌組織中Twist陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及AFP等均無(wú)關(guān)（P>0.05）。Twist蛋白陽(yáng)性表達(dá)與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵犯及臨床分期均有關(guān)（P<0.05）。肝癌組織中MMP-7陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及AFP等均無(wú)關(guān)（P>0.05）。MMP-7蛋白陽(yáng)性表達(dá)與病理分級(jí)、腫瘤分化程度、血管侵犯及臨床分期均有關(guān)（P<0.05）。Pyk2、Twist及MMP-7共同高表達(dá)伴隨肝癌組織分化程度降低、病理分級(jí)差及血管侵襲。見(jiàn)表2。

2.3 Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌組織中表達(dá)的關(guān)系 Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中Pyk2與Twist蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.425，P=0.032），Pyk2與MMP-7的表達(dá)亦呈正相關(guān)（r=0.498，P=0.026）；Twist與MMP-7的表達(dá)亦呈正相關(guān)（r=0.302，P=0.041）。

3 討論

Pyk2（proline-rich tyrosine kinase 2）是一種富含脯氨酸的非受體酪氨酸蛋白激酶，定位于人第8號(hào)染色體 （ 8p21.1），基因全長(zhǎng)4.048 kbp，在腦、腸、脾及腎等多種組織中有表達(dá)。Pyk2依賴于鈣離子濃度的變化而被激活，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及侵襲[8-10]。Pyk2能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，Pyk2在肝癌組織中高表達(dá)，Pyk2在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁肝組織（P<0.05），提示Pyk2基因與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)Pyk2陽(yáng)性表達(dá)還與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵襲及臨床分期密切均相關(guān)，提示Pyk2能在肝癌細(xì)胞分化、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

Twist是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，不僅在胚胎形態(tài)發(fā)生中起關(guān)鍵作用，還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程[12]。胰腺癌中Twist高表達(dá)，并且與腫瘤分期、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。沉默Twist基因后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及遷移力顯著下降[14]。本研究結(jié)果表明，Twist在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁肝組織（P<0.05）；并且Twist陽(yáng)性表達(dá)還與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵襲及臨床TNM分期均有關(guān)（P<0.05），提示Twist在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Twist在低分化、中晚期的肝癌中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步支持了Twist參與了肝癌惡性進(jìn)展，這與車娜等[15]研究報(bào)道相一致。相關(guān)性分析表明，Pyk2與Twist在肝癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），提示Pyk2與Twist共同參與了肝癌惡性侵襲，推測(cè)Pyk2可能通過(guò)上調(diào)Twist促進(jìn)了肝癌侵襲及轉(zhuǎn)移。

基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）是一種膠原蛋白酶，當(dāng)MMP-7表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞間的黏附力下降，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[16-18]。MMP-7在食管癌及乳腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示，MMP-7在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁肝組織（P<0.05）。MMP-7陽(yáng)性表達(dá)還與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵襲及臨床TNM分期均有關(guān)（P<0.05）。以上結(jié)果表明MMP-7與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌組織中異常表達(dá)，并且三者密切相關(guān)，提示Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了協(xié)同作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Pyk2、Twist和MMP-7表達(dá)均與腫瘤病理分級(jí)、臨床分期、腫瘤分化程度及血管侵襲密切相關(guān)，提示Pyk2、Twist和MMP-7與肝癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，聯(lián)合檢測(cè)Pyk2、Twist和MMP-7有助于預(yù)測(cè)肝癌的局部侵襲及轉(zhuǎn)移，同時(shí)也可以作為評(píng)估肝癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1] Hsieh C H，Wei C K，Yin W V，et al.Vascular invasion affects survival in early hepatocellular carcinoma[J].Molecular Clinical Oncology，2015，3（1）：252-256.

[2] Lim S T，Miller N L，Nam J O，et al.Pyk2 inhibition of p53 as an adaptive and intrinsic mechanism facilitating cell proliferation and survival[J].J Biol Chem，2010，285（3）：1743-1753.

[3] Gutenberg A，Bruck W，Buchfelder M，et al.Expression of tyrosine kinases FAK and Pyk2 in 331 human astrocytomas[J].Acta Neuropathol，2004，108（3）：224-230.

[4] Zhang S，Qiu X，Gu Y，et al.Up-regulation of proline-rich tyrosine kinase 2 in non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer，2008，62（3）：295-301.

[5] Marco Genua，Shi-Qiong Xu，Simone Buraschi，et al.Proline-Rich Tyrosine Kinase 2（Pyk2） Regulates IGF-I-Induced Cell Motility and Invasion of Urothelial Carcinoma Cells[J].PLoS One，2012，7（6）：e40 148.

[6]平金良，顧棟樺，徐煒，等.喉鱗狀細(xì)胞癌組織Twist表達(dá)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)性分析[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22（18）：1451-1455.

[7] Gao F，Zhang Y，Yang F，et al.Survivin promotes the invasion of human colon carcinoma cells by regulating the expression of MMP7[J].Mol Med Rep，2014，9（3）：825-830.

[8] Kimberly D.Fisher，Juan Codina，Snezana Petrovic，et al.

Pyk2 regulates H+-ATPase-mediated proton secretion in the outer medullary collecting duct via an ERK1/2 signaling pathway[J].Am J Physiol Renal Physiol，2012，303（9）：F1353-F1362.

[9] Selitrennik M，Lev S.PYK2 integrates growth factor and cytokine receptors signaling and potentiates breast cancerinvasion via a positive feedback loop[J].Oncotarget，2015，6（26）：22 214-

22 226.

[10] Cao J，Chen Y，F(xiàn)u J，et al.High Expression of Proline-Rich Tyrosine Kinase2 is associated with poor survival of hepatocellular carcinoma via regulating phosphatidylinositol 3-Kinase/AKT pathway[J].Ann Surg Oncol，2012，20（Suppl 3）：S312-323.

[11] Verma N，Keinan O，Selitrennik M，et al.PYK2 sustains endosomal-derived receptor signalling and enhances epithelial-to-mesenchymal transition[J].Nature Communications，2015，4（6）：6064.

[12]楊丞，饒翔，張弦，等.Twist基因轉(zhuǎn)染對(duì)人宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2013，20（3）：185-190.

[13]張同軍，薛棟，劉敏，等.轉(zhuǎn)錄因子Twist在胰腺癌中的表達(dá)及在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用[J].國(guó)際外科學(xué)雜志，2014，41（6）：382-386.

[14]王琳.Twist蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及其促進(jìn)癌癥發(fā)展的機(jī)制研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2016，26（8）：28-32.

[15]車娜，趙秀蘭，古強(qiáng)，等.Twist、E-cadherin和β-catenin在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J].中國(guó)腫瘤臨床，2010，37（6）：305-308.

[16] Ahmed Haji Omar A，Haglund C，Virolainen S，et al.MMP-7，MMP-8，and MMP-9 in oral and cutaneous squamous cell carcinomas[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol，2015，119（4）：459-467.

[17] Long Z W，Wang J L，Wang Y N.Matrix metalloproteinase-7 mRNA and protein expression in gastric carcinoma： a meta-analysis[J].Tumour Biol，2014，35（11）：11 415-11 426.

[18] Xiao X Y，Lang X P.Correlation Between MMP-7 and bFGF Expressions in Non-small Cell Lung Cancer Tissue and Clinicopathologic Features[J].Cell Biochem Biophys，2015，73（2）：427-432.

[19] Miao S，Zhou S Y，Han C S，et al.Clinicopathological significance of matrix metalloproteinase-7 protein expression in esophageal cancer：a meta-analysis[J].Drug Des Devel Ther，2015，9：3729-3740.

[20]蘇書娟.MMP-7和Col Ⅳ在乳腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)及其相關(guān)性[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（35）：1-2.

（收稿日期：2016-11-16） （本文編輯：程旭然）