生豬養(yǎng)殖場仔豬白痢大腸桿菌分離、鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)

■ 楊作豐 宋淑英 高 鋒 劉耀川* 鄧文超 張皓淳

（1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽110164；2.遼寧省重大動物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽110161；3.遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽111000）

大腸桿菌為一種人獸共患的環(huán)境常在菌，目前已確定170多種不同血清型的大腸桿菌[1-2]。其中致病性大腸桿菌能夠產(chǎn)生毒素及黏附因子，引起多種疾病。大腸桿菌為仔豬白痢的主要病原菌，該病多發(fā)于10～30日齡的仔豬中，病豬多排白色糞便[3]。該病在仔豬間快速傳播、連續(xù)發(fā)病，發(fā)病時(shí)間較長的仔豬易形成僵豬。未及時(shí)治療的病豬最終因嚴(yán)重腹瀉，導(dǎo)致其他繼發(fā)性疾病而死亡[4-6]。仔豬白痢為仔豬常發(fā)疾病，耐過仔豬生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率下降，給生豬養(yǎng)殖業(yè)打來巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。

目前，抗菌藥物治療仍是臨床仔豬白痢的首選治療方案。但隨著抗菌藥物，特別是廣譜類抗菌藥物的大量使用，使許多病原菌對抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，特別當(dāng)人獸共患病原菌獲得高水平耐藥性后，不僅對養(yǎng)殖業(yè)造成危害，更給人類健康及公共衛(wèi)生安全造成挑戰(zhàn)[8]。本試驗(yàn)對沈陽某規(guī)?；i養(yǎng)殖場白痢仔豬進(jìn)行致病性大腸桿菌分離、鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，為該場仔豬白痢治療篩選敏感治療藥物，并為病原菌耐藥性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 受試仔豬

于沈陽某規(guī)?；i養(yǎng)殖場，選取該場仔豬白痢臨床癥狀明顯的病豬63頭。病豬均為2～3周齡仔豬，體溫表現(xiàn)正常，排白色或灰白色糞便，糞便多為粥樣稀便。

1.2 試劑

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基粉、營養(yǎng)肉湯（NB）、營養(yǎng)瓊脂粉等購買于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定管購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 抗菌藥物紙片

氨芐西林藥物敏感紙片（10 μg/片）、硫酸安普霉素藥物敏感紙片（10 μg/片）、磺胺甲基異惡唑藥物敏感紙片（300 μg/片）、新霉素藥物敏感紙片（30 μg/片）、磺胺異惡唑（300 μg/片）、氟苯尼考藥物敏感紙片（30 μg/片）、青霉素藥物敏感紙片（10 IU/片）、慶大霉素藥物敏感紙片（10 μg/片）、頭孢噻呋藥物敏感紙片（10 μg/片）購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 試驗(yàn)儀器

無菌潔凈工作臺、手提式高壓滅菌器、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈、離心管、無菌棉拭子、接種環(huán)、玻璃培養(yǎng)皿等由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心提供。

2 方法

2.1 病料采集

用溫水和脫脂棉清洗白痢仔豬肛門部位，再用75%的酒精棉球和碘酊進(jìn)行消毒。徹底清潔、消毒后，將無菌棉拭子插入肛門內(nèi)，采集直腸糞便病料。并將樣品棉拭子放入無菌的10 ml離心管中，密封保存于4℃冰盒中，快速送至實(shí)驗(yàn)室。

2.2 病原菌初步分離

按照麥康凱瓊脂培養(yǎng)基粉說明書要求，制備麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，于37℃過夜檢菌后使用。將采集的糞便棉拭子涂布于合格的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，倒置37℃培養(yǎng)18～24 h。觀察培養(yǎng)基中的典型菌落，挑取紅色金屬光澤的圓形菌落為初步分離的大腸桿菌分離株。將初步分離的菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，于37℃振蕩培養(yǎng)器中，180 r/min培養(yǎng)8 h后，于30%滅菌甘油中-80℃保存、備用。

2.3 大腸桿菌生化反應(yīng)鑒定

按照腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定管說明書要求，對初步分離的仔豬白痢大腸桿菌進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。將初步分離的大腸桿菌分離株接種于生化常規(guī)鑒定管中，37℃過夜培養(yǎng)，觀察分離株對葡萄糖、鳥氨酸、硫化氫、蛋白胨、賴氨酸、苯丙氨酸、衛(wèi)矛醇、乳糖、尿素、氨基酸對照及枸櫞酸鈉11項(xiàng)生化反應(yīng)結(jié)果。根據(jù)生化反應(yīng)管變化及編碼鑒定表，對大腸桿菌分離株進(jìn)行生化鑒定。

2.4 大腸桿菌分離株藥物敏感性試驗(yàn)

將經(jīng)生化反應(yīng)鑒定管確定的大腸桿菌分離株接種于3 ml的營養(yǎng)肉湯中，于37℃、180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。在潔凈工作臺中，用微量移液器取大腸桿菌培養(yǎng)液100 μl，涂布于檢菌合格的普通瓊脂培養(yǎng)基中，用滅菌的三角玻璃棒將菌液涂抹均勻，正置待菌液完全吸收干燥后，用無菌鑷子取藥物敏感測試紙片，均勻平貼于平皿中，藥物敏感紙片間相隔一定距離，等待1～2 min，待藥敏片與培養(yǎng)基貼牢后，倒置37℃過夜培養(yǎng)。用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑，判斷大腸桿菌分離株對受試藥物的敏感性。藥敏紙片抑菌環(huán)直徑范圍評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藥敏紙片抑菌環(huán)直徑范圍評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)果

3.1 大腸桿菌分離、鑒定結(jié)果

經(jīng)麥康凱瓊脂鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，從63份仔豬白痢病料中共初步分離到大腸桿菌分離株61株。初篩株經(jīng)腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定管鑒定，最終確定大腸桿菌分離株55株。其余6株菌經(jīng)鑒定為陰溝腸桿菌（E.cloacae）2株、產(chǎn)氣腸桿菌（E.serogenes）1株、聚團(tuán)腸桿菌（E.agglomerans）1株、奇異變形桿菌（P.mirabilis）1株、紅色沙雷氏菌（S.rubidaen）1株。具體病原菌分離、鑒定結(jié)果見表2。

表2 仔豬白痢病原菌分離、鑒定結(jié)果

3.2 大腸桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，55株仔豬白痢大腸桿菌分離株中，24株對氨芐西林耐藥、21株對硫酸安普霉素耐藥、42株對磺胺甲基異惡唑耐藥、32株對新霉素耐藥、38株對磺胺異惡唑耐藥、29株對氟苯尼考耐藥、40株對青霉素耐藥、22株對慶大霉素耐藥、16株對頭孢噻呋耐藥。具體大腸桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表3。大腸桿菌分離株耐藥情況見圖1。

表3 仔豬白痢大腸桿菌藥物敏感性結(jié)果

圖1 大腸桿菌分離株對受試藥物耐藥情況

3.3 大腸桿菌分離株多藥耐藥情況

55株仔豬白痢大腸桿菌分離株對受試的9種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的多藥耐藥現(xiàn)象。分離株最少耐受2種藥物，最多耐受8種藥物。耐受2～8種藥物的菌株數(shù)分別為3株（5.5%）、8株（14.5%）、12株（21.8%）、15株（27.3%）、10株（18.2%）、5株（9.1%）及2株（3.6%）。其中耐受5種藥物的菌株數(shù)最多，為15株。分離株多藥耐藥情況見圖2。

圖2 大腸桿菌分離株多藥耐藥情況

4 討論

腹瀉病對生豬養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，仔豬尤為嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，70%的仔豬死亡病例中均伴有腹瀉現(xiàn)象，且多種仔豬疾病多由腹瀉造成機(jī)體抵抗能力下降而引起[9]。因此，及時(shí)、有效的仔豬腹瀉防治措施對保障養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展及食品安全均具有重要意義。

大腸桿菌作為環(huán)境常在菌，是仔豬紅痢及仔豬白痢的主要病原菌。本試驗(yàn)于沈陽某生豬養(yǎng)殖場63頭仔豬白痢病豬中分離、鑒定大腸桿菌55株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，55株仔豬白痢大腸桿菌分離株對受試的9種抗菌藥物均產(chǎn)生不同的耐藥性。耐藥性由高至低分別為磺胺甲基異惡唑、青霉素、磺胺異惡唑、新霉素、氟苯尼考、氨芐西林、慶大霉素、硫酸安普霉素、頭孢噻呋，耐藥率分別為76.4%、72.7%、69.1%、58.2%、52.7%、43.6%、40.0%、38.2%、29.1%。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道其他地區(qū)的耐藥性有一定差異，如吳燕燕等報(bào)道，上海地區(qū)豬源大腸桿菌分離株對青霉素、氨芐西林和頭孢噻呋耐藥性較高，對氟苯尼考和慶大霉素敏感[10]；黎滿香等報(bào)道，湖南地區(qū)豬源大腸桿菌對青霉素及磺胺甲基異惡唑耐藥，對頭孢噻呋及氨芐西林敏感[4]；鐘雯等報(bào)道，吉林地區(qū)豬源大腸桿菌分離株對氨芐西林、磺胺類藥物中度敏感，對慶大霉素高度耐藥[11-12]。不同地區(qū)耐藥性調(diào)查結(jié)果差異較大，可能與該地區(qū)長期的用藥習(xí)慣有關(guān)。因此應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選取敏感性較高的藥物，對受試養(yǎng)殖場仔豬白痢進(jìn)行治療。

多藥耐藥分析結(jié)果表明，55株仔豬白痢大腸桿菌分離株均表現(xiàn)出不同程度的多藥耐藥情況。分離株最少耐受2種藥物，最多耐受8種。其中耐受5種藥物的分離株最多，占27.3%。多藥耐藥菌株由于能夠同時(shí)對多種抗菌藥物產(chǎn)生高水平耐受，給臨床疾病治療造成嚴(yán)重挑戰(zhàn)。受試養(yǎng)殖場，大部分仔豬白痢大腸桿菌分離株已經(jīng)同時(shí)耐受5種抗菌藥物，多藥耐藥情況較為嚴(yán)重。其中2株分離株為同時(shí)耐受8種抗菌藥物，雖然菌株占比較?。?.6%），但由于其多藥耐藥水平較高，由其引起的疾病治療難度也相對較大。建議該養(yǎng)殖場根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，適當(dāng)調(diào)整治療方案，在保證治療效果的同時(shí)避免高耐藥菌株的出現(xiàn)。