酵母菌富集有機硒和有機鍺的條件篩選

■韓東魁 高 凱 張 敏* 陳石婷 國傳福

（1.延邊大學，吉林延吉133000；2.琿春市龍裕農業(yè)發(fā)展集團有限公司，吉林琿春133300）

1886年，鍺元素被德國化學家發(fā)現(xiàn)。一百多年來，科研工作者對鍺元素進行了大量探索性的研究，合成的主要化合物類有鍺的氧化物、硫化物、鹵代物等，為鍺在醫(yī)藥、食品、工業(yè)等方面的廣泛應用奠定了基礎[1]。鍺有兩種存在形式即有機鍺和無機鍺。無機鍺被動物和人類攝入之后是有毒的，并且會在體內蓄積，對動物和人體是有害的。有機鍺最顯著的功能是抗癌作用。有機鍺對多種癌細胞都有抑制作用，并且可以增強動物和人類的免疫功能；對于人類而言，有機鍺具有美容養(yǎng)顏，延緩衰老，對預防感冒，骨質松軟，促進血液循環(huán)都有著很好的療效[2]。

硒元素于1973年被正式列入人體必需微量元素。它與動物體和人體的各種生理機能有著密切的聯(lián)系。硒元素與鍺元素相同，分為有無機硒和有機硒二種。無機硒以氧化態(tài)的形式存在，它的毒性高于有機硒，而吸收率和利用率明顯低于有機硒。有機硒以Se2-或者結合態(tài)形式存在。結合態(tài)存在的硒可以在體內存儲，當機體缺硒時則通過生理代謝而得到補充。有機硒與多種疾病的發(fā)生有著密切的關系，也可以預防糖尿病、心血管病，以及在某種程度上抑制艾滋病的進一步發(fā)展[3]。

米糠安全、綠色、價格便宜，并且具有降低膽固醇含量，通便，減少尿結石等諸多營養(yǎng)學作用[4]。本試驗以有機米糠作為富硒富鍺酵母的發(fā)酵底物，不僅可以發(fā)揮出有機硒和有機鍺的生物學特性，而且發(fā)揮了米糠的最大價值。富硒富鍺有機米糠作為飼料添加劑，它為動物提供了優(yōu)質的蛋白質的同時還可以提高飼料的利用率和適口性[5]。在申小云等[6]的硒鍺對耗?？寡趸δ艿挠绊懼醒芯勘砻鳎斘N同時作為添加劑添加到飼料中的效果明顯高于單一元素作用的效果。本試驗使酵母菌同時富集2種微量元素，這一酵母“雙富”產品開辟了一種新的生物礦物質資源，并在養(yǎng)殖業(yè)上具有一定的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金屬耐受性高的酵母菌由本實驗室保存；

固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（含氯霉素）；

液體酵母菌種子合成基；

米糠發(fā)酵培養(yǎng)基∶營養(yǎng)液（葡萄糖∶淀粉∶蒸餾水=1∶1∶50）；

有機米糠由吉林省琿春市龍裕農業(yè)發(fā)展集團有限公司提供。

1.2 儀器

高壓滅菌鍋、超凈工作臺、菌體恒溫培養(yǎng)箱、恒溫干燥箱、紫外可見分光光度計、電子精密天平、電爐子、計數(shù)器、分液漏斗、搖床、250 ml錐形瓶（若干）。

1.3 主要試劑

分析純亞硒酸鈉、GeO2純度99%、硝酸、高氯酸、硫酸、雙氧水、甲苯、0.9%NaCl、40%氫氧化鈉溶液、5%氫氧化鈉溶液、2 mol/l甲酸溶液、0.5%3,3-二氨基聯(lián)苯胺溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）、5%EDTA-2Na溶液、1 mol/l NaOH溶液、1 mol/l HCl。

1.4 擴大培養(yǎng)液的制作

從實驗室保存的高耐受金屬菌種中，用接菌環(huán)取一環(huán)接種在含有5 ml液體酵母菌種子合成培養(yǎng)基的試管中，30℃、培養(yǎng)18 h。取1 ml上述液體于含有100 ml液體酵母菌種子合成培養(yǎng)基的錐形瓶中，并在錐形瓶的瓶口處蓋上透氣性良好的棉花塞，30℃、200 r/min于搖床中振蕩24 h，作為擴大培養(yǎng)液。在米糠發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Na2SeO3和GeO2作為硒源和鍺源，探究不同因素對酵母菌生成有機硒和有機鍺水平的影響。

1.5 酵母菌的計數(shù)

取發(fā)酵培養(yǎng)后的固液混合物1 g（約1 ml）于10 ml試管中，加入9 ml生理鹽水。并且依次做10倍梯次稀釋，直至生成濃度為10-4g/ml液體，用移液槍吸取50 μl，滴在PDA培養(yǎng)基中，用涂菌棒均勻涂滿整個培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后準確查出酵母菌個數(shù)。

1.6 有機硒、有機鍺生產水平的測定

目前，有機微量元素的測定方法主要通過微量元素的總量與無機微量元素含量的差值求出[7]。本試驗通過分光光度法來間接測得有機硒和有機鍺的含量。

1.6.1 有機硒含量的測定

發(fā)酵試驗完成后，從培養(yǎng)箱中取出錐形瓶，將其放在無菌操作臺上，用去離子水反復洗滌錐形中的沉淀，將濾液置于105℃烘箱中烘干12 h，所得沉淀物反復研磨成粉末狀，即為酵母干粉，并且準確記錄所得酵母干粉的重量。

總硒的測定：取上述所得酵母干粉0.2 g置于燒杯中，加入10 ml消化液（高氯酸∶濃硫酸∶雙氧水=2∶2∶1），加熱至其由淺黃色到透明狀為止，待其冷卻后，用甲酸和NaOH調節(jié)其pH值至強酸性，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待測。

無機硒的測定：取上述所得酵母干粉0.5 g置于燒杯中，加入蒸餾水25 ml，小火微沸。待其充分溶解后，反復抽濾燒杯中液體，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待測。

樣品的測定：分別將上述處理的樣品分別取10 ml至于分液漏斗中，用甲酸調節(jié)其至強酸性，加入5 ml 0.2%的EDTA-2Na防止其他離子的干擾，再加入10 ml甲苯萃取分層，將所得混合物搖勻，于避光條件下靜置3 h至分層。將所得有機層用脫脂棉過濾至比色皿中，在波長為420 mm下，使用分光光度計測定其吸光度，代入標準曲線，即可得總硒含量和無機硒含量，二者差值即為有機硒含量[8]。

1.6.2 有機鍺含量的測定

總鍺的測定：取上述所得酵母干粉0.2 g于坩堝中，加入5 ml濃硫酸，在通風櫥內碳化至無煙為止，碳化完成后小心加入足量的H2O2，將其小火煮至呈透明狀，加入10 ml NaOH溶液，加熱充分溶解上述溶液，再用1 mol/l的硫酸調節(jié)pH值至微酸性，此時溶液為透明狀，將所得溶液，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待測。

無機鍺的測定：取上述所得酵母干粉0.5 g置于燒杯中，加入蒸餾水25 ml，小火微沸。待其充分溶解后，反復抽濾燒杯中液體，定容與50 ml容量瓶中待測。

樣品的測定：分別移取上述液體置于比色皿中在，505 mm波長下采用苯芴酮分光光度法測定吸光值，代入標準曲線，可得其總鍺和無機鍺含量，差值為有機鍺含量[9]。

有機微量元素生產水平（mg/l）=酵母菌體有機微量元素含量（mg/g）×發(fā)酵米糠酵母菌生物量（g/l）。

2 影響酵母菌生產有機硒和有機鍺的因素

2.1 酵母菌的培養(yǎng)時間對富硒、富鍺酵母含量的影響

不同的培養(yǎng)時間對酵母菌的生長有著不同的影響。本試驗分為6個不同培養(yǎng)時間梯度，每個組中做3個平行處理，培養(yǎng)時間依次為24、36、48、60、70 h以及80 h。其它條件各組均為：溫度30.4℃、裝液量60 ml、米糠添加量32 g、接種量8%?？刂茊我蛔兞?，分析不同的酵母菌培養(yǎng)時間對其含量的影響，從而優(yōu)化其培養(yǎng)條件。

2.2 不同的酵母菌的接種量對富硒、富鍺酵母含量的影響

本試驗設置6個不同酵母菌的接種量梯度，每組做3個平行處理，接種量依次為：7%、8%、9%、10%、11%、12%。其它試驗條件為：培養(yǎng)時間60 h、溫度30.4℃、裝液量60 ml、米糠添加量32 g?？刂茊我蛔兞?，分析不同的酵母菌接種量對富硒、富鍺含量的影響，從而得到最適酵母菌接種量。

2.3 不同培養(yǎng)溫度對富硒、富鍺酵母含量的影響

溫度影響著微生物的新陳代謝以及很多重要的生化反應，這對微生物的發(fā)酵以及酵母菌對硒和鍺的富集能力起著重要的作用。本試驗更深一步探究溫度對富硒富鍺酵母的影響，設置6個不同酵母菌溫度梯度，依次為：29.6、29.8、30.0、30.2、30.4、30.6℃。其它試驗條件為：培養(yǎng)時間60 h，接種量10%，裝液量60 ml，米糠添加量32 g?？刂茊我粶囟茸兞浚治霾煌囵B(yǎng)溫度對富硒富鍺酵母菌含量的影響。

2.4 不同米糠添加量對富硒、富鍺酵母含量的影響

本試驗設置6個不同米糠的添加量的梯度，每組做3個平行處理，米糠添加量依次為：24、28、32、36、40、44 g。其它試驗條件為：培養(yǎng)時間60 h，接種量10%，溫度30.2℃，裝液量60 ml?？刂茊我幻卓诽砑恿繛樽兞?，分析不同米糠添加量對富硒富鍺酵母菌含量的影響，從而確定本試驗最佳米糠添加量。

2.5 不同裝液量對富硒、富鍺酵母含量的影響

裝液量的多少直接與發(fā)酵提供的營養(yǎng)物質有關。本試驗設置6個不同梯度的裝液量，每組3個平行處理，裝液量依次為：60、65、70、75、80、85 ml。其它試驗條件為：培養(yǎng)時間60 h，接種量10%，溫度30.2℃，米糠添加量為36 g。控制單一裝液量變量，分析不同裝液量對富硒富鍺酵母含量的影響。

2.6 不同濃度Na2SeO3對富硒、富鍺酵母含量及生產水平的影響

本試驗設置6個不同Na2SeO3含量的添加梯度，依次為：6、8、10、12、14、16 mg/l。其它試驗條件均為：培養(yǎng)時間60 h、接種量10%、溫度30.2℃、米糠添加量為36 g、裝液量 80 ml/250 mg、GeO2添加量 100 mg/l。探究不同濃度Na2SeO3對富硒、富鍺酵母含量及有機硒生產水平的影響。

2.7 不同濃度GeO2對富硒、富鍺酵母含量及生產水平的影響

本試驗設置6個不同GeO2含量的添加梯度，依次為：60、80、100、120、140、160 mg/l。其它試驗條件均為：培養(yǎng)時間60 h、接種量10%、溫度30.2℃、米糠添加量為 36 g、裝液量 80 ml/250 mg、Na2SeO3添加量10 mg/l。探究不同濃度GeO2對富硒鍺酵母含量及有機鍺生產水平的影響。

3 實驗結果及分析

3.1 酵母菌的培養(yǎng)時間對富硒、富鍺酵母含量的影響

從圖1中可以看出，培養(yǎng)時間在60 h之前，酵母菌的含量逐漸升高，在60 h出現(xiàn)最大值為4.65×105個。隨著培養(yǎng)時間的增加，酵母菌生長呈下降趨勢，可能是酵母菌的自溶現(xiàn)象、營養(yǎng)物質不足以及酵母菌的生長曲線有關。綜上可見，富硒、富鍺酵母菌的最佳培養(yǎng)時間為60 h。

圖1 培養(yǎng)時間對富硒、富鍺酵母含量的影響

3.2 不同的酵母菌的接種量對富硒、富鍺酵母含量的影響

圖2 不同接種量對富硒、富鍺酵母菌含量的影響

由圖2可知，當酵母菌的接種量在7%～10%時，富硒、富鍺酵母菌的含量與接種量呈正相關。當接種量為10%，出現(xiàn)最大值為3.43×105個。在此之后，隨著酵母菌接種量的增大，富硒、富鍺酵母菌含量呈下降趨勢。這可能是因為酵母菌之間互相爭奪生存空間以及營養(yǎng)物質所致[10]。因此，酵母菌的接種量為10%時，為富硒、富鍺酵母最佳接種量。

3.3 不同培養(yǎng)溫度對富硒、富鍺酵母含量的影響

不同培養(yǎng)溫度對富硒、富鍺酵母含量的影響，如圖3所示，溫度對富硒、富鍺酵母菌含量有著較大的影響。在29.6～30.2℃富硒、富鍺酵母菌的含量是隨著溫度的升高而增大的，在30.2℃時，酵母菌含量達最大值，為10.67×105個。但是隨著溫度高于30.2℃，富硒、富鍺酵母菌的含量呈下降趨勢，這可能是由于溫度過高影響了酵母菌細胞中酶的活性，抑制了酵母菌的代謝，導致含量降低[11]。因此，我們選擇30.2℃為最適溫度。

圖3 不同溫度對富硒、富鍺酵母菌含量的影響

3.4 不同米糠添加量對富硒、富鍺酵母含量的影響

圖4 不同米糠添加量對富硒、富鍺酵母菌含量的影響

由圖4可以看出，當米糠的添加量為24～36 g時，富硒、富鍺酵母菌的含量呈上升趨勢；這主要可能是因為隨著發(fā)酵底物的增加，發(fā)酵混合物的含水量逐漸趨于飽和狀態(tài)，增加了酵母菌有氧呼吸的接觸面積，促進了酵母菌的生長發(fā)育；當米糠添加量為36 g時，富硒、富鍺酵母菌含量達頂峰，為7.33×105個；但是，隨著米糠的添加量逐漸增加，酵母菌含量呈下降趨勢。這可能是由于米糠的含量過多，導致米糠過于干燥，抑制了酵母菌的生長。因此，選擇米糠添加量為36 g/250 ml為最適添加量。

3.5 不同裝液量對富硒、富鍺酵母含量的影響

不同裝液量對富硒、富鍺酵母含量的影響，如圖5所示，當營養(yǎng)液的含量低于80 ml/250 ml時，酵母菌的含量呈上升趨勢；在裝液量為80 ml時，酵母菌的含量達最大值，為9.47×105個；隨著營養(yǎng)液的增加，酵母菌的含量呈明顯下降趨勢。這可能是由于酵母菌無氧呼吸的比例增加，抑制了酵母的數(shù)量。因此，確定最佳裝液量為80 ml/250 ml。

圖5 不同裝液量對富硒、富鍺酵母菌含量的影響

3.6 不同Na2SeO3添加量對富硒、富鍺酵母含量及有機硒生產水平的影響

圖6 不同Na2SeO3添加量對富硒、富鍺酵母含量及有機硒生產水平的影響

由圖6可以看出，當Na2SeO3添加量在整個添加梯度中，酵母菌的生物量均有下降趨勢，這與Na2SeO3的毒性有著密切的關系，導致酵母菌含量減少[12]。但在Na2SeO3添加量在12 mg/l時，有機硒的生產水平呈最大值，為2.27 mg/kg。因此，確定Na2SeO3的添加量為10 mg/l對酵母菌富集Na2SeO3最適宜。

3.7 不同GeO2添加量對富硒、富鍺酵母含量及有機鍺生產水平的影響

圖7 不同GeO2添加量對富硒鍺酵母含量及有機鍺生產水平的影響

由圖7可以看出，隨著GeO2添加量逐漸增加，酵母菌的生物量呈下降趨勢。當GeO2添加量為120 mg/l時，有機鍺的生產水平最高達9.80 mg/kg。隨著GeO2添加量繼續(xù)增加時，有機鍺的生產水平有下降的趨勢，這可能是因為高濃度的GeO2抑制了酵母細胞的生長，導致有機鍺生產水平下降。因此，確定GeO2的添加量為120 mg/l對酵母菌的富集GeO2最適宜。

4 結論

通過本試驗可以得出，酵母菌同時富集有機硒和有機鍺的最適條件為：培養(yǎng)基初始pH值為7.0、培養(yǎng)時間60 h、接種量10%、溫度30.2℃、米糠添加量為 36 g/250 ml、裝液量 80 ml/250 ml、GeO2添加量為120 mg/l、Na2SeO3的添加量為 12 mg/l,從而獲得有機硒最佳生產水平為2.27 mg/kg，有機鍺最佳生產水平為9.80 mg/kg。