• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    多重?zé)晒舛縋CR測定瘧原蟲方法建立

    2016-11-15 02:41:43何曉翔雷永良王曉光傅圣勇劉敏
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2016年23期
    關(guān)鍵詞:瘧原蟲瘧疾

    何曉翔+雷永良+王曉光+傅圣勇++劉敏

    [摘要] 目的 建立可同時(shí)檢測四種瘧原蟲的多重?zé)晒舛縋CR方法。 方法 PCR擴(kuò)增四種瘧原蟲目的片段,克隆并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,進(jìn)行梯度稀釋。體系按濃度加入五重引物探針,對(duì)臨床四種瘧原蟲陽性血樣及單一腺病毒和肺炎支原體陽性血樣、人基因組進(jìn)行特異性檢測。將本地區(qū)優(yōu)勢蟲種惡性瘧及間日瘧陽性血樣混合并檢測。每個(gè)反應(yīng)做一式三份驗(yàn)證重復(fù)性。檢測標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度,獲得體系最低檢測限。 結(jié)果 成功構(gòu)建四種瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。對(duì)20份樣本進(jìn)行檢測,其中15份惡性瘧,3份間日瘧,1份三日瘧,1份卵形瘧,與原有確證結(jié)果一致。對(duì)單一腺病毒及肺炎支原體陽性血樣、人基因組檢測結(jié)果均為陰性。惡性瘧及間日瘧陽性血樣混合檢測顯示3條特異性擴(kuò)增曲線。三個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)在0.17~4.96之間。惡性瘧可檢測到102 copies/mL,間日瘧、三日瘧、卵形瘧可檢測到103 copies/mL。 結(jié)論 建立五重?zé)晒舛縋CR檢測四種瘧原蟲特異性及重復(fù)性均較好,靈敏度高,可用于瘧原蟲快速篩選及分型鑒定。

    [關(guān)鍵詞] 多重?zé)晒舛縋CR;瘧原蟲;蚊傳染?。化懠?/p>

    [中圖分類號(hào)] R440 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2016)23-0004-03

    [Abstract] Objective To establish the multiple fluorescence quantitative PCR measure to detect four types of plasmodium at the same time. Methods Target fragments of four types of plasmodium were extended by PCR, the standard plasmid was cloned, constructed and diluted by gradient. Five primers and probes were added into the system according to the concentration and the clinical four plasmodium positive blood sample, single adenovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample as well as human gene was detected specifically. The falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample caused by the local superior plasmodium were mixed and detected. Each experiment was performed for three times to validate the repetitiveness. The gradient concentration of the sample was detected and the lowest detection limitation was achieved. Results The standard plasmids of four plasmodiums were successfully constructed and 20 samples were detected. 15 samples were falciparum malaria and 3 samples were tertian malaria, 1 sample was quartan malaria and 1 sample was ovale malaria, which was in accordance with the original validated results. The results of detection of single adnovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample and human gene were negative. 3 specifically extended curves were presented by the mixed detection of falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample. The variable coefficients of the three duplication holes were within 0.17-4.96. Falciparum malaria was detected to be 102 copies/mL and tertian malaria, quartan malaria as well as ovale malaria was detected to be 103 copies/mL. Conclusion The established five fluorescence quantitative-PCR in the detection of four types of plasmodium has good specificity and repetitiveness as well as high sensitivity, which can be used in the quick screening and type identification of plasmodium.

    [Key words] Multiple fluorescence quantitative-PCR; Plasmodium; Mosquito-borne diseases; Malaria

    瘧疾是由蚊子傳播的一種寄生蟲病,由帶有瘧原蟲的雌性按蚊叮咬人體而傳染,其已經(jīng)成為全球熱帶、亞熱帶最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1]。瘧疾主要有四種致病瘧原蟲:惡性瘧(falciparum)、間日瘧(vivax)、卵形瘧(ovale)、三日瘧(malariae)。隨著我國對(duì)外開放程度的不斷擴(kuò)大,從瘧疾流行區(qū)歸來后引起瘧疾爆發(fā)的報(bào)道次數(shù)逐漸增多,且近年來輸入性病例所占比例不斷增加[2],各個(gè)省份均有報(bào)道,故對(duì)瘧疾的控制計(jì)劃是巨大的挑戰(zhàn)。

    臨床瘧疾診斷和最常規(guī)的方法以鏡檢瘧原蟲、臨床體征觀察、抗原檢測為主。但其準(zhǔn)確性、靈敏度均有待提高。PCR檢測外周血寄生蟲的敏感性和特異性較好,且PCR方法在分型鑒定中有特殊優(yōu)勢。目前,PCR鑒定瘧原蟲方法大致有:巢氏PCR[3,4]、一步法單管多重PCR[5]、熒光PCR(SYBR Green)[6]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增PCR(LAMP)。其中巢氏PCR擴(kuò)增樣本之后需要核酸膠鑒定[7],溶解曲線判斷要求不同種瘧原蟲的溶解溫度差異要大。本研究旨在開發(fā)操作更簡單、單步驟的多重PCR體系,在單管中能同時(shí)鑒定幾種瘧原蟲的方法,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1儀器與試劑

    四種瘧原蟲陽性血樣來自臨床患者,病例收集時(shí)間為2014年3月1日~2016年3月1日,由本地疾控中心經(jīng)金標(biāo)、鏡檢、核酸檢測等方式確診[8];腺病毒、肺炎支原體臨床陽性血樣,人基因組DNA由本實(shí)驗(yàn)室保存。7500熒光定量PCR儀購自ABI公司,QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國qiagen)購自杭州怡丹生物技術(shù)有限公司,NanoDrop分光光度計(jì)購自賽默飛世爾科技。Premix Ex Taq、T載體購自takara。割膠回收試劑盒購自Promega公司。Taq酶購自全式金公司。TG1菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 四種瘧原蟲陽性血樣提核酸DNA,使用通用上下游引物(表1),Taq酶PCR擴(kuò)增見試劑說明書,溫度:94℃ 2 min。94°C 30 s,61°C 30 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),72°C 10 min。使用試劑盒純化PCR產(chǎn)物,克隆到pMD19-T載體。轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞,在藍(lán)白斑上挑取白斑。提質(zhì)粒DNA[9],測序驗(yàn)證,使用分光光度計(jì)測定濃度并按公式計(jì)算拷貝數(shù)[10],進(jìn)行梯度倍比稀釋。

    1.2.2 特異性及重復(fù)性檢測 ①對(duì)四種瘧原蟲陽性血樣共20份樣本進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR檢測,體系引物探針用量見表1。25 μL總體積,10 μL混合液,模板4 μL。95℃ 30 s,1個(gè)循環(huán);95℃ 5 s,58℃ 34 s,40個(gè)循環(huán);60℃搜集熒光信號(hào)。質(zhì)量控制:加入腺病毒、肺炎支原體陽性血樣DNA,人基因組DNA。②將惡性瘧與間日瘧陽性血樣混合在一管中,使用自建體系檢測,比較特異性。對(duì)同一反應(yīng)做三個(gè)復(fù)孔,計(jì)算均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù),比較重復(fù)性。

    1.2.3 靈敏度檢測 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度梯度為10、102、103、104、105、106、107 copies/mL,檢測最低檢測限[11]。

    2結(jié)果

    2.1特異性

    PCR結(jié)果顯示40條特異擴(kuò)增的S型曲線,通用FAM熒光標(biāo)記20條典型S型曲線,15份樣本HEX熒光基團(tuán)標(biāo)記為惡性瘧,3份CY5標(biāo)記為間日瘧,1份ROX三日瘧,1份CY3卵形瘧,腺病毒及肺炎支原體陽性血樣、人基因組樣本檢測均未見特異性擴(kuò)增。以上所有樣本均與預(yù)期結(jié)果符合?;旌涎獦訕颖緳z測顯示FAM、HEX、CY5

    2.2重復(fù)性

    2.3 靈敏度

    經(jīng)測序,成功構(gòu)建四種瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均>0.993,各稀釋度曲線相關(guān)性好,惡性瘧的為最低檢測限為102 copies/mL,間日瘧、三日瘧、卵形瘧均為103 copies/mL。

    3討論

    多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)由實(shí)時(shí)熒光PCR發(fā)展而來,通過幾種不同的探針熒光報(bào)告基團(tuán)混合,能同時(shí)檢測基因序列不同的病原體,在國內(nèi)外蓬勃發(fā)展[12-14]。傳統(tǒng)PCR技術(shù)檢測瘧原蟲需要經(jīng)過多輪擴(kuò)增或使用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增才能鑒別,凝膠電泳費(fèi)時(shí)且難以自動(dòng)化。本實(shí)驗(yàn)旨在單管一步反應(yīng)獲得直觀結(jié)果,簡化實(shí)驗(yàn)步驟。

    我國瘧疾消除計(jì)劃初顯成效,近年來病例多為輸入性感染,大量用藥導(dǎo)致耐藥發(fā)生,檢測瘧原蟲隱蔽性及困難程度增加。鏡檢診斷瘧原蟲對(duì)技術(shù)人員專業(yè)要求高,且容易漏診。部分地區(qū)實(shí)驗(yàn)室鏡檢技術(shù)力量薄弱,一線醫(yī)技人員對(duì)疫情不能及時(shí)檢驗(yàn)[15],PCR快速檢測在出入境關(guān)口能克服顯微鏡的限制,陽性檢出率高[16,17],且不受耐藥寄生蟲影響,應(yīng)用廣泛[18]。我市患者多為惡性瘧或間日瘧感染,快速準(zhǔn)確鑒別蟲種對(duì)合理治療有重大意義。

    目前國外學(xué)者Phuong M等[19]針對(duì)地區(qū)優(yōu)勢瘧原蟲種類設(shè)計(jì)兩、三重?zé)晒馓结槪荒芡瑫r(shí)鑒定四種瘧原蟲。國內(nèi)學(xué)者黃雨婷[7]、李美等[20]檢測四種瘧原蟲,巢氏引物擴(kuò)增后經(jīng)核酸膠鑒定蟲種,曲線的Tm值集中,不易區(qū)分和鑒別蟲種。

    本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)以上方法的綜合和優(yōu)化,調(diào)整反應(yīng)條件、濃度、熒光探針,建立單管中能同時(shí)檢測四種瘧原蟲的多重PCR探針系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)方法操作簡單,從提取DNA到讀出結(jié)果在3 h內(nèi)完成,該系統(tǒng)可對(duì)除wallikeri亞種之外的瘧原蟲進(jìn)行分型,但瘧原蟲屬保守18S小亞基核糖體基因設(shè)計(jì)的通用上下游引物可檢測出所有瘧原蟲病原體,以此可應(yīng)對(duì)瘧原蟲多個(gè)基因型差異[21]。本研究的20份樣本均已確診,使用自建方法得出預(yù)期結(jié)果,通過反應(yīng)可區(qū)分出四種瘧原蟲?;旌涎獦又屑尤肴嘶蚪M,可測得通用、惡性、間日瘧特異性擴(kuò)增,應(yīng)對(duì)混合感染[22]。三個(gè)復(fù)孔檢測曲線呈高度相關(guān)性,變異系數(shù)<5。對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋的梯度濃度進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示較好的相關(guān)性。四種瘧原蟲最低檢測限均<103 copies/mL,惡性瘧可達(dá)102 copies/mL,該靈敏度優(yōu)于其他方法,且有利于混合感染的檢測,進(jìn)一步滿足日常檢測工作需要。在靈敏度與重復(fù)性檢測中,梯度濃度相關(guān)曲線系數(shù)R2>0.98,表明標(biāo)準(zhǔn)品定量可靠。PCR操作過程中需注意污染,且由于本體系引物探針眾多,需保證序列質(zhì)量及保存恰當(dāng)。為了最大限度獲得特異性擴(kuò)增,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件及體系濃度,增加特異性及敏感性。上述檢測結(jié)果顯示自建方法高靈敏度、特異性和穩(wěn)定性,適合在出入境、檢驗(yàn)檢疫等部門推廣應(yīng)用。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Lee PC,Chong E T,Anderios F,et al. Molecular detection of human Plasmodium species in Sabah using PlasmoNex multiplex PCR and hydrolysis probes real-time PCR[J]. Malar J,2015,14(11): 28-35.

    [2] 王亞麗,王煊,張彥平. 2005~2013年全國本地感染與境外輸入瘧疾流行病學(xué)特征分析[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志,2015,11(2):120-126.

    [3] 孫菲,萬向陽,李歡,等. 多重巢式PCR檢測惡性瘧和間日瘧原蟲[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志,2014,32(8):565-567.

    [4] 王真瑜,張耀光,江莉,等. 上海市1例輸血性三日瘧病例的實(shí)驗(yàn)室檢測分析與診斷[J]. 中國血吸蟲病防治雜志,2015,17(4):362-366.

    [5] 李歡,孫菲,文嵐,等. 多重PCR快速檢測惡性瘧和間日瘧的研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào),2014,23(3):288-291.

    [6] 李歡. SYBR Green實(shí)時(shí)PCR檢測惡性瘧原蟲與間日瘧原蟲方法的建立[D]. 中南大學(xué),2014.

    [7] 黃雨婷,佘丹婭,盧麗丹,等. 單管單輪多重PCR檢測4種瘧原蟲混合血樣[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2015,33(3):200-205.

    [8] 雷永良,陳秀英,葉夏良,等. 經(jīng)輸血傳播的1例惡性瘧報(bào)告[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2015,15(2):170-171.

    [9] Sheikh IH,Kaushal DC,Chandra D,et al. Immunogenicity of a plasmid DNA vaccine encoding 42kDa fragment of Plasmodium vivax merozoite surface protein-1[J]. Acta Trop,2016,162(13): 66-74.

    [10] 戴玉柱,崔大偉,楊先知,等. 五重?zé)晒舛縍T-PCR法檢測甲型流感病毒[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志,2015,33(9):641-644.

    [11] Gupta H,Srivastava S,Chaudhari S,et al. New molecular detection methods of malaria parasites with multiple genes from genomes[J]. Acta Trop,2016,160(14):15-22.

    [12] 趙冉,陳瓊,孔繁德,等. 4種腸道致病菌的多重?zé)晒舛縋CR快速檢測方法的建立[J]. 畜牧與獸醫(yī),2014,3(8):67-71.

    [13] 程鵬飛,唐景峰,程弘夏,等. 淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、細(xì)小脲原體多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[J]. 中國生物制品學(xué)雜志,2014,6(1):109-119.

    [14] 王原,崔大偉,胡正軍,等. 一步法多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測人杯狀病毒的建立及應(yīng)用[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志,2014,32(9):647-651.

    [15] 王勝啟,李靜,郭玉琪,等. 新形勢下輸入性瘧疾疫情防控研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生,2016,54(4):132-135.

    [16] 張憲華. 腸道病毒71型(EV71)的檢測[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生,2015,53(20):93-95.

    [17] 紀(jì)衍瑾,孫雯雯,祝喆,等. 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測水產(chǎn)品中諾如病毒[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生,2015,53(19):130-132.

    [18] 萬向陽,孫菲,李歡. 熒光定量PCR技術(shù)在瘧疾診斷中的應(yīng)用[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,34(1):127-129.

    [19] Phuong M,Lau R,Ralevski F,et al. Sequence-based optimization of a quantitative real-time PCR assay for detection of Plasmodium ovale and Plasmodium malariae[J]. J Clin Microbiol,2014,52(4):1068-1073.

    [20] 李美,夏志貴,湯林華. 檢測4種人體瘧原蟲多重PCR體系的建立和應(yīng)用[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2015,33(2):91-95.

    [21] Mahdi AHM,Elamin AF,Albsheer MM,et al. Multiplicity of infection and genetic diversity of Plasmodium falciparum isolates from patients with uncomplicated and severe malaria in Gezira State,Sudan[J]. Parasit Vectors,2016,9(1):362-370.

    [22] Nabet C,Doumbo S,Jeddi F,et al. Genetic diversity of Plasmodium falciparum in human malaria cases in Mali[J].Malar J,2016,15(18):353-361.

    (收稿日期:2016-04-19)

    猜你喜歡
    瘧原蟲瘧疾
    中國榮獲世界衛(wèi)生組織頒發(fā)的“無瘧疾”認(rèn)證
    自我保健(2021年8期)2021-12-01 03:13:36
    研究揭示瘧原蟲對(duì)青蒿素的耐藥性機(jī)理
    瘧原蟲可“潛伏”血液數(shù)月
    胞漿表達(dá)綠色熒光蛋白的伯氏瘧原蟲的構(gòu)建和篩選
    聯(lián)合國宣布阿爾及利亞和阿根廷根除致死性瘧疾
    能迅速殺死傳播瘧疾蚊子的轉(zhuǎn)基因真菌
    2019 年世界瘧疾日
    ——“零瘧疾從我開始”
    河南省首例輸入性諾氏瘧的診斷和分析
    非洲“兩蘇”地區(qū)瘧疾預(yù)防與治療
    類人猴瘧原蟲:另一種可能感染人類的靈長類瘧疾病原
    国产不卡一卡二| 丁香欧美五月| 999久久久精品免费观看国产| 少妇高潮的动态图| 午夜日韩欧美国产| 午夜精品一区二区三区免费看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久午夜亚洲精品久久| 51午夜福利影视在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 国产91精品成人一区二区三区| 美女免费视频网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 熟女电影av网| 国产精品1区2区在线观看.| 少妇的逼水好多| 国内精品久久久久精免费| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美极品一区二区三区四区| aaaaa片日本免费| 亚洲人与动物交配视频| 精品一区二区三区视频在线 | 99精品在免费线老司机午夜| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲专区国产一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 丁香六月欧美| 天堂网av新在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲在线自拍视频| 国产综合懂色| 国产成人啪精品午夜网站| 中出人妻视频一区二区| aaaaa片日本免费| 国产单亲对白刺激| 又爽又黄无遮挡网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲成人久久爱视频| 黄片大片在线免费观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产黄色小视频在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 九色成人免费人妻av| 色综合亚洲欧美另类图片| 高清日韩中文字幕在线| 午夜a级毛片| avwww免费| avwww免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产欧美日韩精品亚洲av| 88av欧美| 国产av不卡久久| 国产黄a三级三级三级人| 国产黄a三级三级三级人| 少妇的丰满在线观看| 性欧美人与动物交配| 国产视频内射| 成年免费大片在线观看| aaaaa片日本免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美3d第一页| 久久草成人影院| 欧美成人免费av一区二区三区| 99久久综合精品五月天人人| 99热这里只有精品一区| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲男人的天堂狠狠| 人妻久久中文字幕网| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品午夜福利视频在线观看一区| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品久久久久久久久久久久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一本精品99久久精品77| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 日韩精品青青久久久久久| 老汉色∧v一级毛片| 成人特级黄色片久久久久久久| 色哟哟哟哟哟哟| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一区二区三区高清视频在线| 此物有八面人人有两片| 无遮挡黄片免费观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 草草在线视频免费看| 在线观看一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 99久久精品热视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美性感艳星| 69av精品久久久久久| 国产精品女同一区二区软件 | 欧美高清成人免费视频www| 亚洲无线观看免费| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 丰满的人妻完整版| 日韩欧美三级三区| 天堂√8在线中文| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日本免费a在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 麻豆国产av国片精品| 一级黄片播放器| 免费看日本二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 99热这里只有是精品50| 午夜视频国产福利| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 黄色成人免费大全| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲国产欧美人成| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产av不卡久久| 日韩欧美三级三区| 亚洲av免费在线观看| 嫩草影院精品99| 欧美在线一区亚洲| 日韩高清综合在线| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲avbb在线观看| 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 国语自产精品视频在线第100页| 精品国产亚洲在线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| av国产免费在线观看| 亚洲激情在线av| 亚洲av电影在线进入| 亚洲av熟女| 国产亚洲精品久久久com| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美一级毛片孕妇| 日本一本二区三区精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩国内少妇激情av| 九九在线视频观看精品| 波多野结衣高清无吗| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲av免费在线观看| 99国产综合亚洲精品| 中亚洲国语对白在线视频| 好男人在线观看高清免费视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 一本精品99久久精品77| 亚洲人成网站高清观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜两性在线视频| 此物有八面人人有两片| 久久亚洲精品不卡| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美日韩乱码在线| 日韩高清综合在线| aaaaa片日本免费| 国产亚洲欧美98| 免费人成在线观看视频色| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 全区人妻精品视频| 亚洲自拍偷在线| 亚洲激情在线av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美黑人巨大hd| 俺也久久电影网| 国产日本99.免费观看| 亚洲不卡免费看| 国产熟女xx| 在线a可以看的网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 男女下面进入的视频免费午夜| 床上黄色一级片| 一个人免费在线观看电影| 两个人视频免费观看高清| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产69精品久久久久777片| 亚洲av成人精品一区久久| 国产探花极品一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 精品乱码久久久久久99久播| 国产伦人伦偷精品视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| www国产在线视频色| 免费人成在线观看视频色| 成人高潮视频无遮挡免费网站| ponron亚洲| 一进一出好大好爽视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 青草久久国产| 欧美3d第一页| 可以在线观看毛片的网站| 小说图片视频综合网站| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲激情在线av| 两个人视频免费观看高清| 成人av在线播放网站| 在线播放国产精品三级| 91在线观看av| 国产精品综合久久久久久久免费| 少妇丰满av| 深爱激情五月婷婷| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲avbb在线观看| 欧美日本视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品国产美女av久久久久小说| 九九热线精品视视频播放| 高清毛片免费观看视频网站| 国产成人欧美在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费av不卡在线播放| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日本免费a在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 观看免费一级毛片| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 天堂动漫精品| 十八禁人妻一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品野战在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 高清日韩中文字幕在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 老司机午夜十八禁免费视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产毛片a区久久久久| 97碰自拍视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲人成网站在线播| 亚洲国产欧美网| 悠悠久久av| 丰满人妻一区二区三区视频av | 麻豆成人午夜福利视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产av在哪里看| 少妇的逼好多水| 日韩欧美精品免费久久 | 国产视频内射| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美日韩黄片免| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品免费久久久久久久清纯| x7x7x7水蜜桃| 免费人成在线观看视频色| av天堂在线播放| 91在线精品国自产拍蜜月 | 日韩欧美 国产精品| 88av欧美| 男人的好看免费观看在线视频| 成人18禁在线播放| 国产精品乱码一区二三区的特点| 美女大奶头视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久精品大字幕| 一区二区三区激情视频| 久久精品国产自在天天线| 日本a在线网址| 在线看三级毛片| 中文字幕av在线有码专区| 日韩精品青青久久久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜福利视频1000在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 国语自产精品视频在线第100页| 男女下面进入的视频免费午夜| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产日本99.免费观看| netflix在线观看网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品乱码久久久久久99久播| 中国美女看黄片| av黄色大香蕉| 久久国产精品影院| 午夜a级毛片| 亚洲黑人精品在线| 99热这里只有精品一区| 手机成人av网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲国产色片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 久久久成人免费电影| 国产精品 国内视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 婷婷亚洲欧美| eeuss影院久久| 亚洲av熟女| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久国产乱子伦精品免费另类| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲欧美日韩高清专用| 99热这里只有精品一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 少妇高潮的动态图| 久久这里只有精品中国| 在线观看午夜福利视频| xxx96com| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久香蕉国产精品| av女优亚洲男人天堂| 麻豆一二三区av精品| 日韩精品青青久久久久久| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| www日本在线高清视频| 午夜福利欧美成人| 精品久久久久久久末码| 最新美女视频免费是黄的| 日本黄大片高清| 成年女人永久免费观看视频| 国产中年淑女户外野战色| 欧美+日韩+精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲av一区综合| 色av中文字幕| av福利片在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 久久性视频一级片| 国产熟女xx| ponron亚洲| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美一区二区精品小视频在线| 淫秽高清视频在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲,欧美精品.| 国产真实乱freesex| 麻豆一二三区av精品| 丁香欧美五月| 精品久久久久久久末码| 脱女人内裤的视频| 不卡一级毛片| 乱人视频在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 免费av不卡在线播放| 岛国视频午夜一区免费看| 成人性生交大片免费视频hd| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜免费成人在线视频| 天美传媒精品一区二区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 真人一进一出gif抽搐免费| 日本一本二区三区精品| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲成a人片在线一区二区| 网址你懂的国产日韩在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产成人av教育| 无限看片的www在线观看| 欧美bdsm另类| 久久九九热精品免费| a级一级毛片免费在线观看| 日本与韩国留学比较| 天美传媒精品一区二区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 亚洲精华国产精华精| 久久久精品大字幕| 午夜免费成人在线视频| 天天躁日日操中文字幕| av专区在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 欧美极品一区二区三区四区| 女同久久另类99精品国产91| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产成人啪精品午夜网站| 最好的美女福利视频网| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在线观看午夜福利视频| 久久久久久久久中文| 少妇丰满av| 国产欧美日韩一区二区精品| 老司机深夜福利视频在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 操出白浆在线播放| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av成人av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 女同久久另类99精品国产91| 久久香蕉国产精品| 99久久综合精品五月天人人| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 美女cb高潮喷水在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 在线观看一区二区三区| 国产真实乱freesex| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品日产1卡2卡| 1000部很黄的大片| 精品免费久久久久久久清纯| 九色国产91popny在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产av麻豆久久久久久久| 少妇丰满av| bbb黄色大片| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲内射少妇av| 亚洲人成网站在线播| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品 国内视频| 国产激情欧美一区二区| 一区福利在线观看| 操出白浆在线播放| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 男人舔奶头视频| 欧美zozozo另类| 成人欧美大片| 亚洲片人在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国语自产精品视频在线第100页| a级毛片a级免费在线| 欧美中文综合在线视频| 国产爱豆传媒在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 91在线观看av| 亚洲av美国av| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩人妻高清精品专区| 一区二区三区免费毛片| 韩国av一区二区三区四区| 精品乱码久久久久久99久播| 婷婷丁香在线五月| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日韩av在线大香蕉| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品国产清高在天天线| 最新在线观看一区二区三区| av在线蜜桃| 国产精品女同一区二区软件 | 一进一出好大好爽视频| 日本黄色片子视频| 色哟哟哟哟哟哟| 免费搜索国产男女视频| 亚洲午夜理论影院| 亚洲av美国av| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久久九九精品影院| www日本在线高清视频| 天堂√8在线中文| 黄色丝袜av网址大全| 精品久久久久久,| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美日韩精品网址| 欧美性感艳星| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费av毛片视频| 久久草成人影院| 精品电影一区二区在线| 男插女下体视频免费在线播放| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产成人福利小说| 级片在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 久久九九热精品免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 一夜夜www| 久久精品国产综合久久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产淫片久久久久久久久 | 老司机福利观看| 男女午夜视频在线观看| 久久久国产成人免费| 日本成人三级电影网站| 国产高清有码在线观看视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 99热只有精品国产| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜福利在线在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产精品99久久99久久久不卡| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲国产欧美网| 一二三四社区在线视频社区8| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品国产自在天天线| 桃色一区二区三区在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 日本 欧美在线| 手机成人av网站| 欧美日韩乱码在线| a级一级毛片免费在线观看| 十八禁网站免费在线| 国产高清三级在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| xxxwww97欧美| ponron亚洲| 国产亚洲精品久久久com| 在线观看免费视频日本深夜| 日韩av在线大香蕉| 亚洲无线观看免费| 最近视频中文字幕2019在线8| 免费人成在线观看视频色| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 热99re8久久精品国产| 一区二区三区激情视频| 男插女下体视频免费在线播放| 国产乱人伦免费视频| 亚洲av熟女| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美性猛交黑人性爽| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费看美女性在线毛片视频| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 男女床上黄色一级片免费看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久精品国产自在天天线| 国产成人欧美在线观看| 97碰自拍视频| 三级毛片av免费| 中文字幕av成人在线电影| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品国产亚洲在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 小说图片视频综合网站| 欧美黑人巨大hd| 在线a可以看的网站| 最近最新免费中文字幕在线| 国产乱人伦免费视频| 精品久久久久久久末码| 老司机在亚洲福利影院| 日本 欧美在线| 一级黄色大片毛片| 色播亚洲综合网| 国产精品1区2区在线观看.| 久久6这里有精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产伦一二天堂av在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 一本综合久久免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美性感艳星| 在线播放无遮挡| 99国产综合亚洲精品| 亚洲无线观看免费| 极品教师在线免费播放| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 51午夜福利影视在线观看| 一个人看视频在线观看www免费 | 91在线观看av| av在线天堂中文字幕| 国产亚洲精品av在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 老司机午夜福利在线观看视频| 五月伊人婷婷丁香| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲片人在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 免费av毛片视频| xxx96com| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女被艹到高潮喷水动态| 九九热线精品视视频播放| 在线观看舔阴道视频| 午夜亚洲福利在线播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 婷婷亚洲欧美| 18美女黄网站色大片免费观看| 在线天堂最新版资源| tocl精华| 久久精品人妻少妇| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品成人久久久久久|