產(chǎn)腈水解酶基因工程菌的產(chǎn)酶誘導(dǎo)條件及培養(yǎng)基優(yōu)化

唐璐敏， 薛建萍

上海市農(nóng)藥研究所生物工程中心， 上海 200032

?

產(chǎn)腈水解酶基因工程菌的產(chǎn)酶誘導(dǎo)條件及培養(yǎng)基優(yōu)化

唐璐敏， 薛建萍*

上海市農(nóng)藥研究所生物工程中心， 上海 200032

本文通過(guò)對(duì)產(chǎn)酶誘導(dǎo)條件及發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，成功提高了產(chǎn)腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit的產(chǎn)酶水平。研究結(jié)果顯示，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖0.2%、甘油0.7%(v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，pH 7.2。最佳產(chǎn)酶誘導(dǎo)條件為：發(fā)酵4 h時(shí)加入0.5 mmol/L IPTG，然后在28℃、240 r/min下誘導(dǎo)腈水解酶基因表達(dá)14 h～16 h。采用優(yōu)化方案，重組菌產(chǎn)酶水平可提升至0.9～1×105U，與野生菌株的產(chǎn)酶水平相比，提高幅度超過(guò)50%。同時(shí)重組菌培養(yǎng)僅需 24 h，培養(yǎng)周期縮短超過(guò)50 h。

腈水解酶； 重組菌； 誘導(dǎo)優(yōu)化； 培養(yǎng)基優(yōu)化

天然腈化物在自然界中廣泛存在，很多微生物具備轉(zhuǎn)化腈化物的能力。微生物所產(chǎn)腈水解酶能將多種有機(jī)腈催化生成相應(yīng)的有機(jī)酸，這些有機(jī)酸在工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值，因此近年來(lái)關(guān)于腈水解酶的研究倍受關(guān)注[1-4]。作者單位保藏的一株產(chǎn)腈水解酶菌株Arthrobacternitroguajacolicus可以轉(zhuǎn)化羥基乙腈生產(chǎn)羥基乙酸，已在工業(yè)化羥基乙酸生產(chǎn)項(xiàng)目中應(yīng)用，但與化學(xué)法生產(chǎn)羥基乙酸相比，產(chǎn)能優(yōu)勢(shì)尚不明顯，因此希望通過(guò)提高菌株發(fā)酵產(chǎn)酶水平來(lái)進(jìn)一步提升產(chǎn)能。研究發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)誘變方法難以繼續(xù)提高該菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶水平，因此開(kāi)展A.nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆及表達(dá)研究，通過(guò)酶基因的克隆和異源超量表達(dá)來(lái)突破瓶頸，進(jìn)一步提高產(chǎn)能。

作者已克隆到A.nitroguajacolicus的腈水解酶基因，構(gòu)建了一株產(chǎn)腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit(以下簡(jiǎn)稱為重組菌)[5,6]，但重組酶基因在宿主胞內(nèi)的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于野生菌株的產(chǎn)酶水平，不能滿足工業(yè)化應(yīng)用的需求。

通過(guò)對(duì)該重組菌的酶基因誘導(dǎo)表達(dá)條件及發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了重組菌的產(chǎn)酶水平，并縮短了培養(yǎng)周期，優(yōu)化結(jié)果可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

在本文研究基礎(chǔ)上，另一株基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNitd[基于基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit改造并已申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?01510995654.7)]的產(chǎn)酶水平有更大幅度的提高，用于轉(zhuǎn)化羥基乙腈生產(chǎn)乙醇酸具有顯著的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

產(chǎn)腈水解酶野生菌株Arthrobacternitroguajacolicus由上海市農(nóng)藥研究所保藏；基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit由上海市農(nóng)藥研究所構(gòu)建并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

野生菌種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖7.5、蛋白胨5、K2HPO40.5、KH2PO40.5、MgSO40.5，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15、蛋白胨10、味精0.75、K2HPO40.5、KH2PO40.5、MgSO40.5、半胱氨酸鹽酸鹽0.15，pH 7.0。

重組菌種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5、蛋白胨10、NaCl 10、酵母膏5，pH 7.2。

氨芐抗性(Ampr)培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入終濃度100 μg/μl的氨芐青霉素(Amp)。

1.1.3 主要試劑和儀器

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡(jiǎn)寫IPTG)和氨芐青霉素鈉(Amp)購(gòu)自捷瑞生物工程(上海)有限公司；蛋白胨購(gòu)自南通東海龍生生物制品有限公司，可用OXOID公司胰蛋白胨(tryptone)替代；酵母膏購(gòu)自廣東江門生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心有限公司，可用OXOID公司酵母浸粉(yeast extract)替代；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。島津氣相色譜儀GC-2014購(gòu)自上海納锘實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶活測(cè)定

1 mL細(xì)胞液或發(fā)酵液加入0.05 mL丙烯腈，40℃下振蕩反應(yīng)5 min后加入0.08 mL濃HCl終止反應(yīng)(反應(yīng)液pH 1～2)，然后在15 000 r/min下離心5 min，取上清液用氣相色譜法測(cè)定丙烯酸含量。

酶活計(jì)算公式：C樣品=C標(biāo)樣×A樣品/A標(biāo)樣×60/t，其中C：濃度(μg/mL)；A：峰面積；t：反應(yīng)時(shí)間(min)。

酶活單位( U )定義：1 mL細(xì)胞液或發(fā)酵液反應(yīng)1 h產(chǎn)生1 μg丙烯酸為1個(gè)酶活力單位。

1.2.2 菌濃測(cè)定

取0.2 mL適當(dāng)稀釋的菌液，10 000 r/min下離心2 min，沉淀部分用去離子水等體積重懸，以去離子水為對(duì)照測(cè)OD600。

1.2.3 菌體培養(yǎng)

1.2.3.1 野生菌培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：28 ℃、220 r/min、24 h～48 h，以10%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)：28 ℃、220 r/min、48 h～72 h。

1.2.3.2 重組菌培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)：37 ℃培養(yǎng)16 h～18 h；種子培養(yǎng)：37 ℃、240 r/min，培養(yǎng)4 h～6 h，至OD600為0.6～0.8，以3%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)：37 ℃、240 r/min下培養(yǎng)一定時(shí)間后加誘導(dǎo)劑IPTG，然后在28 ℃、240 r/min下進(jìn)行酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.4 重組酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

1.2.4.1 重組菌發(fā)酵培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

重組菌發(fā)酵培養(yǎng)階段每隔0.5 h～1 h取樣測(cè)定OD600，繪制生長(zhǎng)曲線。根據(jù)生長(zhǎng)曲線確定誘導(dǎo)劑IPTG的加入時(shí)間點(diǎn)。

1.2.4.2 誘導(dǎo)因素優(yōu)化

分別對(duì)IPTG濃度、IPTG加入時(shí)的菌株培養(yǎng)時(shí)間(以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)時(shí)間)，IPTG加入后誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間這三個(gè)因素進(jìn)行全正交優(yōu)化試驗(yàn)。放瓶菌液在10 000 r/min下離心5 min收集細(xì)胞，去離子水重懸細(xì)胞，再次離心收集細(xì)胞，再用1mL去離子水懸浮細(xì)胞(此細(xì)胞液與放瓶菌液相比濃縮了15倍)，測(cè)定細(xì)胞液酶活。

各因素所取水平為IPTG終濃度 (mmol/L)：0.10、0.25、0.50、0.75和1.00；培養(yǎng)時(shí)間(h)：2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5(選取范圍根據(jù)菌體生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果確定)；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間(h)：7、15和20。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

通過(guò)3輪正交試驗(yàn)獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。具體內(nèi)容見(jiàn)結(jié)果與討論部分。

2 結(jié)果和討論

2.1 酶基因誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

2.1.1 重組菌的生長(zhǎng)曲線

重組菌的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。從圖中可以看出，2.5 h～5.5 h為菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，此后進(jìn)入穩(wěn)定期。2.5 h～6.5 h涵蓋了菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。

圖1 E. coli BL21(DE3)-pETNYNit的生長(zhǎng)曲線

2.1.2 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

按1.2.4.2的方法試驗(yàn)，酶活測(cè)定結(jié)果如表1所示。從表中可看出，在重組菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期至穩(wěn)定期的初期加入0.5～1 mmol/L IPTG并誘導(dǎo)表達(dá)15 h的效果較好，其中培養(yǎng)5.5 h、加0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)15 h，重組菌產(chǎn)酶水平最高，可達(dá)34 939 U，而野生菌株產(chǎn)酶水平在5～6×104U，相比仍有一定差距。

表1 重組腈水解酶的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)一

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以半復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)重組大腸桿菌可提高菌體細(xì)胞密度，培養(yǎng)基中所含無(wú)機(jī)鹽如(NH4)2SO4、NH4Cl等有利于可溶性蛋白的合成[8]。

以重組菌種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)其中的碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨、酵母膏)及無(wú)機(jī)鹽(NaCl)配比進(jìn)行優(yōu)化，另外再加入組分(NH4)2SO4和10*M9 salt(10*M9 salt 為含NH4Cl 1%、Na2HPO4·12H2O 8%、KH2PO43%、MgSO4·7H2O 0.25%的鹽溶液)，進(jìn)行3水平正交試驗(yàn)，培養(yǎng)基pH 7.2。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，采用L18(37)正交試驗(yàn)表共18個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

表2 正交試驗(yàn)一的因素和水平設(shè)計(jì)

注：10*M9 salt水平為v/v%，其他組分水平為w/v%。

先按1.2.3.2的方法培養(yǎng)種子液并轉(zhuǎn)發(fā)酵，做重組菌在18組發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線 ，綜合18組生長(zhǎng)曲線走勢(shì)，發(fā)酵培養(yǎng)3.5 h的重組菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中前期，4 h則處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)于中后期。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，選定在轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)3.5 h和4 h加IPTG(終濃度0.5 mmol/L)，28 ℃、240 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜(14 h ～16 h)。放瓶方法同2.1.2所述方法，轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)3.5 h加IPTG的正交試驗(yàn)1-1結(jié)果及分析見(jiàn)表3、表4；轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)4 h加IPTG的正交試驗(yàn)1-2結(jié)果及分析見(jiàn)表5、表6。

表3 正交試驗(yàn)1-1的結(jié)果

注：以上表格中的酶活數(shù)據(jù)未除以濃縮倍數(shù)，為濃縮15倍的酶活。

從正交試驗(yàn)1-1的方差分析結(jié)果表4看，葡萄糖(因素A)F值最高，為9.490，其他因素的F值都較低，當(dāng)F0.05(2,2) = 19.00時(shí)各因素都無(wú)顯著性影響，當(dāng)F0.25(2,2) = 3.00時(shí)葡萄糖具有顯著性影響。根據(jù)表3中的極差分析得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(命名為Ⅰ-1)為：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.5%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9salt 10% (v/v)，pH 7.2。

表4 正交試驗(yàn)1-1的方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.01，F(xiàn)0.25(2,2)=3.00，表中顯著性以F0.05(2,2)為臨界值。

從正交試驗(yàn)1-2的方差分析結(jié)果表5看，葡萄糖(因素A)F值最高，為44.343，而其他因素的F值都較低，當(dāng)F0.05(2,2)=19.00時(shí)葡萄糖具有顯著性影響。根據(jù)表6極差分析得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(命名為Ⅰ-2)為：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9salt 10% (v/v)，pH 7.2。

表5 正交試驗(yàn)1-2的方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.01，F(xiàn)0.25(2,2)=3.00，表中顯著性以F0.05(2,2)為臨界值。

表6 正交試驗(yàn)1-2的結(jié)果

注：以上表格中的酶活數(shù)據(jù)未除以濃縮倍數(shù)，為濃縮15倍的酶活。

Ⅰ-1、Ⅰ-2培養(yǎng)基在蛋白胨含量上有區(qū)別，前者為1.5%，后者為1.0%，再次以Ⅰ-1、Ⅰ-2培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)，每組培養(yǎng)基都分別于轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)3.5 h和4 h加IPTG(終濃度0.5 mmol/L)，進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)做對(duì)照組(發(fā)酵培養(yǎng)基配方與種子培養(yǎng)基配方相同)，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 3種發(fā)酵培養(yǎng)基的比較

注：表格中的酶活數(shù)據(jù)未除以濃縮倍數(shù)，為濃縮15倍的酶活。

根據(jù)表7的結(jié)果，正交試驗(yàn)一得到的發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ-1為最優(yōu)培養(yǎng)基，其組分為：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.5%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9 salt 10% (v/v)，pH 7.2。使用此培養(yǎng)基時(shí)，重組菌培養(yǎng)條件為：37 ℃、240 r/min種子培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，以3%接種量轉(zhuǎn)發(fā)酵；37 ℃、240 r/min發(fā)酵培養(yǎng)4 h加入IPTG，IPTG終濃度為0.5 mmol/L；28 ℃、240 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)14 h～16 h。

2.2.2 正交試驗(yàn)二

以發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ-1為基礎(chǔ)，進(jìn)行第二輪發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。從正交試驗(yàn)一的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，葡萄糖濃度 >0.2%時(shí)重組菌的酶活明顯降低，原因可能是作為常用碳源的葡萄糖，其含量對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有顯著影響，存在明顯的葡萄糖效應(yīng)。葡萄糖濃度過(guò)高會(huì)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。而碳源是菌體產(chǎn)酶必需的營(yíng)養(yǎng)元素，0.2%的葡萄糖含量無(wú)法滿足此需求(一般產(chǎn)酶細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量為1%～2%)，在無(wú)法以葡萄糖為碳源的情況下，采用一些非快速利用的碳源來(lái)替代葡萄糖。

甘油是一種常見(jiàn)的非快速利用的碳源，在Ⅰ-1培養(yǎng)基中加入不同量的甘油，考察重組菌放瓶發(fā)酵液的酶活。培養(yǎng)方法同2.2.1所述最優(yōu)方法，放瓶發(fā)酵液直接按酶活測(cè)定方法測(cè)酶活，結(jié)果見(jiàn)表8。

從表8結(jié)果可看出，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甘油有助于菌體量及酶活的提高，將甘油與正交試驗(yàn)一中除葡萄糖外的其他組分一起進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步細(xì)化正交試驗(yàn)一各組分的水平，縮小各因素水平范圍，培養(yǎng)基中0.2%葡萄糖為確定組分。正交試驗(yàn)采用L18(37)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表9、10、11所示。

表8 甘油對(duì)重組菌發(fā)酵的影響

表9 正交試驗(yàn)二的因素和水平設(shè)計(jì)

注：10*M9 salt水平為v/v%；甘油配成10%(v/v)的溶液，按表中體積百分比加入培養(yǎng)基中；培養(yǎng)基中其他組分水平為w/v%。

表10 正交試驗(yàn)二的方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.01，F(xiàn)0.25(2,2)=3.00，表中顯著性以F0.05(2,2)為臨界值。

從表10看，甘油為顯著影響因素，與試驗(yàn)前所做碳源對(duì)產(chǎn)酶的重要性分析相符。

在表11的極差分析中，甘油的均值M1(對(duì)應(yīng)水平0.5%)與均值M2(對(duì)應(yīng)水平0.7%)相近且明顯高于均值M3(對(duì)應(yīng)水平1.0%)，需做進(jìn)一步試驗(yàn)確定。其他各組分的M1、M2和M3值都很接近。蛋白胨各水平的均值很接近?？紤]到氮源濃度不易過(guò)高，以保證培養(yǎng)基的碳氮比適中及控制培養(yǎng)基成本，選用蛋白胨1.2%。10*M9 salt各水平均值接近，呈現(xiàn)出谷形走勢(shì)而不是峰形走勢(shì)，選用兩端水平點(diǎn)7%和13%做進(jìn)一步試驗(yàn)確定。除了需進(jìn)一步確定的因素水平(甘油0.5%或0.7%、10*M9 salt 7%或13%)外，根據(jù)極差分析結(jié)果確定其他培養(yǎng)基組分為：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%，pH 7.2。

將需要確定的兩個(gè)因素的兩個(gè)水平相互組合，加入已確定的培養(yǎng)基組分配制成以下4組培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表12、13。

從表13結(jié)果看，Ⅱ-1為最佳培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、10*M9 salt 13% (v/v)，pH 7.2。將10*M9 salt中各組分拆分換算得到各組分含量：NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%。

2.2.3 正交試驗(yàn)三

將發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ-1中10*M9 salt的各組分拆分，進(jìn)行第三輪正交試驗(yàn)優(yōu)化。同時(shí)加入在第二輪優(yōu)化結(jié)果中顯示具有顯著影響性的甘油，培養(yǎng)基中其他組分為葡萄糖0.2%、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%，pH 7.2。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表14，采用正交試驗(yàn)表L18(37)。培養(yǎng)方法同2.2.1所述最優(yōu)方法，放瓶發(fā)酵液直接按酶活測(cè)定方法測(cè)酶活，試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表15、16。

表11 正交試驗(yàn)二的結(jié)果

表12 甘油及M9 salt組分含量的確定

表13 甘油及M9 salt組分含量確定的試驗(yàn)結(jié)果

注：對(duì)照為不加甘油。

從表16可看出，各因素的F值都較低，當(dāng)F0.25(2,2)=3.00和F0.05(2,2)=19.00時(shí)都不具有顯著性影響。根據(jù)表15的極差分析得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(命名為Ⅲ-1)為葡萄糖0.2%、甘油0.5% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.15%、Na2HPO4·12H2O 1.5%、KH2PO40.8%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH 7.2。

將培養(yǎng)基Ⅱ-1和Ⅲ-1作為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表17。

表17結(jié)果顯示，Ⅱ-1和Ⅲ-1的發(fā)酵產(chǎn)酶效果相近，在無(wú)機(jī)鹽使用量上后者明顯高于前者，增加了原料成本，因此仍選Ⅱ-1為最佳培養(yǎng)基。

2.2.4 水質(zhì)實(shí)驗(yàn)

以上發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)中都是用去離子水配制培養(yǎng)基，為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，改用自來(lái)水配制培養(yǎng)基。用去離子水和自來(lái)水分別配制以上優(yōu)化試驗(yàn)獲得的Ⅱ-1和Ⅲ-1培養(yǎng)基，既考察了水質(zhì)對(duì)發(fā)酵的影響，又再次比較優(yōu)化培養(yǎng)基Ⅱ-1和Ⅲ-1。結(jié)果見(jiàn)表18。

表14 正交試驗(yàn)三的因素和水平設(shè)計(jì)

注：甘油配成10%(v/v)的溶液，按表中體積百分比加入培養(yǎng)基中；其他組分水平為w/v%。

表15 正交試驗(yàn)三的結(jié)果

表16 正交試驗(yàn)二的方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.01，F(xiàn)0.25(2,2)=3.00，表中顯著性以F0.05(2,2)為臨界值。

表17 發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ-1和Ⅲ-1對(duì)產(chǎn)酶效果

表18 水質(zhì)對(duì)發(fā)酵效果的影響

從表18的結(jié)果可知，可用自來(lái)水替代去離子水配制培養(yǎng)基，用發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ-1和Ⅲ-1的發(fā)酵結(jié)果相近，結(jié)果能重現(xiàn)。確定最優(yōu)培養(yǎng)基為Ⅱ-1：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，自來(lái)水配制，pH 7.2。

經(jīng)過(guò)3輪正交試驗(yàn)，確定了最佳培養(yǎng)基配方及相應(yīng)培養(yǎng)方法。在優(yōu)化條件下，重組菌的產(chǎn)酶水平可達(dá)(0.9～1)×105U，比野生菌的產(chǎn)酶水平提高了50%以上。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)產(chǎn)腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit的酶基因誘導(dǎo)表達(dá)條件及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，成功提高了該重組菌的產(chǎn)酶水平。

通過(guò)研究獲得的最優(yōu)培養(yǎng)方法為：斜面挑菌接入種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，以3%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h加入0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG。種子及發(fā)酵培養(yǎng)條件均為37 ℃、240 r/min。加入IPTG后，在28 ℃、240 r/min下誘導(dǎo)酶基因表達(dá)14 h～16 h。經(jīng)正交優(yōu)化所得的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，pH 7.2。試驗(yàn)同時(shí)證明，培養(yǎng)基可使用自來(lái)水進(jìn)行配制。培養(yǎng)基中均含100 μg/mL Amp。

采用最優(yōu)培養(yǎng)方法，重組菌產(chǎn)酶水平可提升到(0.9～1)×105U，與野生菌株相比提高幅度超過(guò)50%。同時(shí)重組菌培養(yǎng)僅需 24 h，相比之下，野生菌株培養(yǎng)需72 h～120 h，培養(yǎng)周期大幅縮短。該優(yōu)化方法在工業(yè)生產(chǎn)中能有效提高腈水解酶的產(chǎn)能，具有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

[1] 徐建妙，鄭裕國(guó)，沈寅初. 腈水解酶的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其應(yīng)用 [J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2005，32(5)：141-146.

[2] 何玉財(cái)，許建和. 腈水解酶在羧酸合成中的研究進(jìn)展 [J]. 生物加工過(guò)程，2009,7(1)：7-11.

[3] 鄭裕國(guó)，薛亞萍，柳志強(qiáng)等. 腈轉(zhuǎn)化酶在精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用 [J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2009，25(12)：1795-1807.

[4] 劉鑫，游松，蘇昕. 微生物酶催化腈類化合物的研究進(jìn)展 [J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29(6)：485-490.

[5] 唐璐敏，徐玉華，薛建萍. Arthrobacter nitroguajacolicus 腈水解酶基因的克隆和表達(dá) [J]. 工業(yè)微生物，2014，44(6)：13-20.

[6] Novagen，pET System Manual 10thEd. 2006.

[7] 司文，唐璐敏，李還寶. 一株產(chǎn)腈水解酶基因工程菌轉(zhuǎn)化羥基乙腈生產(chǎn)乙醇酸的工藝初探 [J]. 工業(yè)微生物，2015，45(6)：48-52.

[8] 李寅，高海軍，陳堅(jiān). 高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù). 化學(xué)工業(yè)出版社. 2006-10. 第三章.

Optimization of culture conditions for production of nitrilase by using recombinantE.coli

TANG Lu-min, XUE Jian-ping

Biological Engineering Center，Shanghai Pesticide Research Institute，Shanghai 200032, China

In this study, the production of nitrilase by using recombinant strainE.coliBL21 (DE3) -pETNYNit was improved by optimization of induced conditions and fermentation medium. The results indicated that the optimal medium were as follows: glucose 0.2%, glycerol 0.7% (v/v), peptone 1.2%, yeast extract 0.8%, NaCl 0.3%, (NH4)2SO40.3%, NH4Cl and 0.13%, Na2HPO4·12H2O 1.04%, KH2PO40.39%, MgSO4·7H2O 0.03%, pH 7.2; the optimal induced conditions were the following: 0.5 mmol/L IPTG induced expression after fermented for 4 hours, and then cultured for 14 hours to 16 hours at 28 ℃ and 240 r/min. After optimization, the nitrilase activity of the recombinant strain increased to (1～0.9)×105U. Compared with that of the wild strain, the enzyme activity increased by more than 50%. At the same time, the culture time of the recombinant strain was about 24 hours, reduced more than 50 hours.

nitrilase; recombinant strain; induction condition optimization; culture medium optimization

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)，課題編號(hào)SS2014AA022106。

唐璐敏(1982～)，女，工程碩士。電話：021-64387891-133，E-mail：coriah@126.com。

*通訊作者: 薛建萍(1961～)，女，高級(jí)工程師。電話：021-64387891-133，E-mail：xjp54241246@163.com。