水溶液中白藜蘆醇穩(wěn)定性及降解產(chǎn)物分析

朱屹東， 周景文， 堵國成

江南大學(xué)生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫 214122

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水溶液中白藜蘆醇穩(wěn)定性及降解產(chǎn)物分析

朱屹東， 周景文， 堵國成*

江南大學(xué)生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫 214122

白藜蘆醇是一種具有較強(qiáng)抗氧化和防癌、抗癌等生理活性的植物天然產(chǎn)物，其功能與生產(chǎn)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)；然而，白藜蘆醇的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較差。在微生物發(fā)酵生產(chǎn)及存儲過程中需要采取特殊的工藝，以防止其降解，使得發(fā)酵及存儲工藝復(fù)雜化，增加了成本。本研究對發(fā)酵及存儲過程中的各類條件，如溫度、pH、培養(yǎng)基成分及大腸桿菌對白藜蘆醇的降解情況進(jìn)行了初步的研究；使用液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜，對白藜蘆醇的降解產(chǎn)物進(jìn)行了分析。本研究可作為基礎(chǔ)資料，為降低發(fā)酵生產(chǎn)及存儲過程中白藜蘆醇的降解提供重要參考。

白藜蘆醇； 降解； 液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜； 白藜蘆醇二聚體

白藜蘆醇(Resveratrol, 3,5,4’-trihydroxy-trans-stilbene)是植物界分布較廣的羥基二苯乙烯類多酚化合物，來源于花生、葡萄、虎杖和桑葚等植物，是一種植物抗毒素(phytoalexin)，對革蘭氏陽性細(xì)菌的生長有一定抑制作用，具有抗炎、抗心血管疾病等多種生理活性[1, 2]。同時，白藜蘆醇也具有較強(qiáng)的抗氧化[3]和防癌抗癌[4]的生理活性，可作為腫瘤的化學(xué)預(yù)防劑，亦可降低和防治動脈粥樣硬化心血管疾病。白藜蘆醇有反式和順式兩種異構(gòu)體，生理活性方面反式強(qiáng)于順式。近年來，白藜蘆醇的功能和生產(chǎn)成了研究的熱點(diǎn)[5]。目前市場上的白藜蘆醇多來源于植物提取法，由于其在植物中含量較低，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本較高，無法滿足日益增長的市場需求。因此，采用合成生物學(xué)方法改造微生物合成白藜蘆醇成為一個重要的選擇[6]。已有多篇文獻(xiàn)報道利用大腸桿菌、釀酒酵母等微生物異源合成白藜蘆醇[7, 8]。

已有的研究表明，白藜蘆醇在水溶液中的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均較差[9]。白藜蘆醇的合成過程中需要消耗大量的能量，需要在好氧的水相體系中進(jìn)行。這使得白藜蘆醇在水溶液中的積累和其合成產(chǎn)生了不可避免的矛盾[10]，增加了白藜蘆醇高效發(fā)酵生產(chǎn)的過程的復(fù)雜性，導(dǎo)致生產(chǎn)過程中必須采取嚴(yán)格優(yōu)化的發(fā)酵條件及培養(yǎng)基，以盡量減少白藜蘆醇的損失[11]。

本研究對白藜蘆醇在不同溫度、pH及培養(yǎng)基成分中降解速率進(jìn)行了初步研究，并考察了大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響。進(jìn)一步通過液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用，分析了白藜蘆醇降解的主要產(chǎn)物。本研究結(jié)果有助于理解微生物異源發(fā)酵生產(chǎn)白藜蘆醇過程中各種環(huán)境因子對白藜蘆醇降解的影響，對強(qiáng)化發(fā)酵過程中目標(biāo)產(chǎn)物的積累具有重要的參考價值。此外，相關(guān)結(jié)果也將對減少食品加工和貯存過程中白藜蘆醇的降解程度提供必要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌BL21 (DE3)，用于考察大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響。

1.2 儀器與試劑

白藜蘆醇標(biāo)樣購自Sigma-Aldrich公司，蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoid公司，M9培養(yǎng)基購自生工生物工程(上海)股份有限公司，甲醇和乙腈(色譜純)購自Merck KGaA公司，流動相所用超純水由Milli-Q UF-Plus超純水系統(tǒng)制備所得(電阻率>18 MΩ·cm)。其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

UFLC購自日本Shimadzu公司，配備一臺LC-20 AD二元泵、一臺SIL-20 AC自動進(jìn)樣器以及一臺CTO-20 AC柱溫箱。質(zhì)譜設(shè)備采用日本Shimadzu公司的離子阱-飛行時間質(zhì)譜，采用電噴霧離子源(ESI)。

1.3 培養(yǎng)基及樣品制備

LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl。

M9培養(yǎng)基：10×M9鹽200 mL，1 mol/L硫酸鎂2 mL，1 mol/L氯化鈣100 μL，以無菌水定容至1 L。

10×M9鹽：64 g磷酸氫二鈉，15 g磷酸二氫鉀，2.5 g氯化鈉，5.0 g氯化銨，以去離子水定容至1 L后滅菌。

10×M9鹽、硫酸鎂和氯化鈣分別滅菌后混合，防止沉淀。

蛋白胨水溶液：10 g/L蛋白胨。

酵母粉水溶液：5 g/L酵母提取物。

白藜蘆醇儲備液：精確稱量10 mg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，以乙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，獲得質(zhì)量濃度為1 g/L的儲備液，于-20 ℃下避光保存。由于白藜蘆醇的光穩(wěn)定性極差，所有本實(shí)驗(yàn)中的白藜蘆醇溶液均儲存于鋁箔包裹的離心管中，實(shí)驗(yàn)中全程避光。

1.4 溫度及pH對白藜蘆醇降解的影響

用PBS緩沖液(pH 7.4)將白藜蘆醇儲備液稀釋至50 mg/L，分裝至鋁箔包裹的14 mL培養(yǎng)管中，分別放置于25 ℃、30 ℃、37 ℃和42 ℃條件下，用于檢測溫度對白藜蘆醇降解的影響。

用pH分別為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0的緩沖液，將白藜蘆醇儲備液稀釋至50 μg/mL，分裝至鋁箔包裹的14 mL培養(yǎng)管中，放置于25 ℃條件下，用于檢測pH對白藜蘆醇降解的影響。

所有的樣品取出后立即12 000 r/min離心1 min，經(jīng)過0.2 μm濾膜過濾后用于LCMS-IT-TOF檢測，取樣時間點(diǎn)為2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h。

1.5 不同培養(yǎng)基對白藜蘆醇降解的影響

分別用水、蛋白胨水溶液、酵母提取物水溶液、LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基將白藜蘆醇儲備液稀釋至50 μg/mL，分裝至鋁箔包裹的14 mL培養(yǎng)管中，放置于30 ℃培養(yǎng)箱中，用于檢測不同培養(yǎng)基對白藜蘆醇降解的影響。

將一株大腸桿菌BL21 (DE3)接種至LB培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6時，轉(zhuǎn)接至含有50 μg/mL白藜蘆醇的LB培養(yǎng)基中，于30 ℃, 200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于檢測大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響。

所有的樣品取出后都立即12 000 r/min離心1 min，經(jīng)過0.2 μm濾膜過濾后用于LCMS-IT-TOF檢測，取樣時間點(diǎn)為2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h。

1.6 降解動力學(xué)參數(shù)的計算

溫度對白藜蘆醇降解速率影響的參數(shù)利用阿累尼烏斯方程計算：

其中A為指前因子，Ea為活化能(J/mol)，R為摩爾氣體常量(8.314 J/kmol)，T為絕對溫度。

1.7 LCMS-IT-TOF分析

樣品采用Shimazu VP-ODS C18柱(2 mm i.d. 250 mm, 5 mm)進(jìn)行色譜分離[12]，進(jìn)樣量為5 μL，流動相為0.1%的乙酸(30%，A)和乙腈 (70%，B)，柱溫為35 ℃，流速為0.2 mL/min，進(jìn)入質(zhì)譜的分流比為100%。TOF檢測使用ESI離子源，檢測模式為負(fù)離子模式，檢測電壓1.56 kV，霧化氣(N2)流速1.5 L/min，干燥氣(N2)壓力100 kPa；離子收集時間30 ms；碰撞能量50%，MS1掃描范圍(100～600) m/z，MS2掃描范圍(100～500) m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對白藜蘆醇降解的影響

不同溫度(25 ℃、30 ℃、37 ℃和42 ℃)下白藜蘆醇的降解過程如圖1所示。pH 7.0時，白藜蘆醇在37 ℃和42 ℃迅速的降解，在25 ℃時降解速度稍有減慢。不同溫度下計算所得的白藜蘆醇降解動力學(xué)參數(shù)如表1所示。白藜蘆醇在pH 7.0時不同溫度下的降解過程符合一級動力學(xué)方程，溫度對白藜蘆醇降解速率的影響遵循阿累尼烏斯方程：logkobs=24.896-9 360.8(1/T) (r2=0.99)。白藜蘆醇降解速率對溫度敏感的原因在于其活化能位于50～96 kJ/mol范圍內(nèi)[13]。由上述結(jié)果可以看出，溫度上升能明顯加快白藜蘆醇的降解速率，因此在生理溫度下進(jìn)行的白藜蘆醇研究(白藜蘆醇的生理活性以及胞內(nèi)藥物傳遞，白藜蘆醇的微生物合成等)都需要注意白藜蘆醇的高降解速率。有些研究時間長達(dá)48 h[14]甚至72 h[15]，在此過程中，超過一半的白藜蘆醇可能會被降解，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 不同溫度下白藜蘆醇的降解動力學(xué)參數(shù)

圖1 不同溫度下白藜蘆醇的降解過程

2.2 pH對白藜蘆醇降解的影響

白藜蘆醇在不同pH條件(3.0、5.0、7.0、9.0和11.0)下的降解過程如圖2所示。白藜蘆醇在酸性條件下相對穩(wěn)定，然而在堿性條件下卻快速降解。白藜蘆醇在酸性條件下穩(wěn)定是由于其羥基被大量帶正電荷的H3O+所保護(hù)[16]。當(dāng)pH高于7.0時，白藜蘆醇的降解速度顯著加快；當(dāng)pH高于9.0時，白藜蘆醇能在數(shù)分鐘內(nèi)以肉眼可見的速度被降解，溶液顏色迅速加深。在pH 9.0時，白藜蘆醇的一個羥基部分去質(zhì)子化；而當(dāng)pH達(dá)到10.0時，白藜蘆醇的一個羥基完全去質(zhì)子化而另一個羥基也部分去質(zhì)子化[17]。這表明白藜蘆醇堿降解的機(jī)制可能與其羥基解離的程度有關(guān)。然而，目前大部分圍繞白藜蘆醇的實(shí)驗(yàn)都是在pH 7.0左右的環(huán)境里進(jìn)行的，因此不可避免的會受到白藜蘆醇降解的影響。

圖2 不同pH條件下白藜蘆醇的降解過程

2.3 不同的培養(yǎng)基成分對白藜蘆醇降解的影響

白藜蘆醇在不同培養(yǎng)基(水、蛋白胨水溶液、酵母提取物水溶液、LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基)中的降解過程如圖3。在本研究中，白藜蘆醇的降解速率都一定程度的受到溫度和pH的影響，因?yàn)榕囵B(yǎng)基都是在適合菌體生長的溫度和pH條件下放置，很少會有需要在低溫和pH較低的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基。由結(jié)果可以看出， M9培養(yǎng)基對白藜蘆醇降解的影響最小，在經(jīng)過72 h之后仍有超過70%的白藜蘆醇未被降解；酵母提取物對白藜蘆醇的降解有一定的影響，72 h時白藜蘆醇含量相比水中的多降解了23%；而在含有蛋白胨的水溶液以及含有蛋白胨的LB培養(yǎng)基中，白藜蘆醇降解速率明顯加快，經(jīng)過72 h后幾乎沒有白藜蘆醇?xì)埩?，全部被降解?/p>

圖3 不同培養(yǎng)基中白藜蘆醇的降解過程

由此可見，培養(yǎng)基中的蛋白胨成分會較明顯的促進(jìn)白藜蘆醇的降解。由于許多豐富培養(yǎng)基中都含有蛋白胨成分，因此當(dāng)使用這些培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物進(jìn)行白藜蘆醇發(fā)酵生產(chǎn)時，會受到白藜蘆醇降解的影響，從而影響產(chǎn)量。

2.4 大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響

大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響如圖4所示。在添加大腸桿菌BL21 (DE3)的LB培養(yǎng)基中，在前24 h白藜蘆醇的降解速率稍有加快；24 h之后，白藜蘆醇的降解速率開始減慢；到72 h時，未添加大腸桿菌BL21 (DE3)的LB培養(yǎng)基中白藜蘆醇已經(jīng)完全降解，而添加大腸桿菌BL21 (DE3)的LB培養(yǎng)基中還有10%白藜蘆醇?xì)埩?。該現(xiàn)象可能的原因是發(fā)酵過程中pH的降低，減慢了白藜蘆醇的降解；培養(yǎng)基中的蛋白胨被大腸桿菌消耗，減少了蛋白胨的含量。由此可知，大腸桿菌的生長對白藜蘆醇的降解并沒有顯著的影響，利用代謝工程改造的大腸桿菌生產(chǎn)白藜蘆醇不會增加白藜蘆醇的降解。

2.5 LCMS-IT-TOF分析降解產(chǎn)物

白藜蘆醇主要降解產(chǎn)物的分析通過LCMS-IT-TOF來完成。利用全掃描模式對白藜蘆醇的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析之后，得到主要的降解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖，見圖5。結(jié)果表明，白藜蘆醇降解的主要產(chǎn)物有兩個，即m/z453.168 3 和m/z243.063 6。為了得到這兩種物質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)，將m/z453.168 3和m/z243.063 6作為母離子，進(jìn)一步打碎檢測二級質(zhì)譜，得到的二級質(zhì)譜圖如圖6和圖7。由二級質(zhì)譜結(jié)果可知，m/z453.168 3和m/z243.063 6打碎之后都得到了一個碎片峰m/z227，為白藜蘆醇的[M-1]-峰。m/z453.168 3對應(yīng)[2M-2H-1]-，來源于兩分子白藜蘆醇脫去兩個氫結(jié)合成的白藜蘆醇二聚體；而m/z243.063 6對應(yīng)[M+O-1]-，是白藜蘆醇被氧化得到的產(chǎn)物氧化白藜蘆醇(2,3′,4,5′-四羥基二苯乙烯)。將二級質(zhì)譜結(jié)果導(dǎo)入MZmine-2.10進(jìn)行處理，處理結(jié)果與KEGG Compound數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果表明，加入大腸桿菌和白藜蘆醇的培養(yǎng)基中甲基胞嘧啶含量有較大程度的增加，這可能與白藜蘆醇多聚物抑制細(xì)菌DNA合成有關(guān)[18]。其他降解產(chǎn)物在總離子流圖(TIC)上出峰較小，無法逐一進(jìn)行分析。

圖4 大腸桿菌對白藜蘆醇降解過程的影響

圖5 白藜蘆醇降解產(chǎn)物的一級質(zhì)譜圖

圖6 m/z 453.168 3對應(yīng)的二級質(zhì)譜譜圖

圖7 m/z 243.063 6對應(yīng)的二級質(zhì)譜譜圖

3 結(jié)論

通過研究不同溫度、pH和培養(yǎng)基成分等環(huán)境因子對白藜蘆醇降解的影響，本研究發(fā)現(xiàn)，較高的溫度、pH，以及培養(yǎng)基中蛋白胨的存在，均會導(dǎo)致白藜蘆醇降解速率的加快；而在低溫、酸性及不含蛋白胨的條件下白藜蘆醇穩(wěn)定性較高。該發(fā)現(xiàn)有助于降低發(fā)酵過程中白藜蘆醇的降解速率，同時可作為白藜蘆醇長期保存的重要參考。通過對白藜蘆醇的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，得到了其中兩個主要的降解產(chǎn)物，即白藜蘆醇二聚體和氧化白藜蘆醇。此外，通過在培養(yǎng)基中添加大腸桿菌BL21 (DE3)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的生長不會增加白藜蘆醇的降解速率，證明了利用代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)白藜蘆醇的可行性。

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Stability of resveratrol in aqueous solutions and identification of degradation products

ZHU Yi-dong, ZHOU Jing-wen, DU Guo-cheng

School of biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China

Resveratrol is a plant natural product, which exhibits strong physiological activities, such as antioxidation, cancer prevention and anticancer. Researches on the function and production of resveratrol are the central issues. However, the light stability and hot stability of resveratrol are poor. Special treatment is required during the fermentation and storage to prevent the degradation of resveratrol. This special treatment complicates the processes of fermentation and storage, and thus increases the cost. In this study, the effects of environmental conditions on resveratrol degradation were studied, including temperature, pH, medium composition and the existence ofEscherichiacoli. The degradation products were also analyzed by LCMS-IT-TOF. The results can serve as the foundational

for decrease of resveratrol degradation during both fermentation and storage.

resveratrol; degradation; LCMS-IT-TOF; viniferin

國家自然科學(xué)基金(31370130)“大腸桿菌合成黃酮類化合物關(guān)鍵前體丙二酰輔酶A的代謝調(diào)控”，江南大學(xué)自主科研計劃重點(diǎn)項目(JUSRP51307A)“微生物高效積累黃酮類化合物的關(guān)鍵共性問題研究”。

朱屹東(1990～)，男，碩士研究生，主要從事微生物代謝工程合成白藜蘆醇的研究。E-mail:zhuyd1990@outlook.com。

*通訊作者: 堵國成，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：0510-85918309，E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn。