一種不對稱水解(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新酯酶基因的克隆表達和酶學性質(zhì)研究

董劍鳴， 張利坤， 盧亞南， 姚星超， 楊玉瑩， 陸躍樂， 張朝暉

浙江工業(yè)大學生物工程學院，杭州 310014

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一種不對稱水解(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新酯酶基因的克隆表達和酶學性質(zhì)研究

董劍鳴， 張利坤， 盧亞南， 姚星超， 楊玉瑩， 陸躍樂， 張朝暉*

浙江工業(yè)大學生物工程學院，杭州 310014

本文將來自反硝化無色桿菌Achromobacterdenitrificans1104的酯酶基因EHest，轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，成功表達了具有不對稱水解農(nóng)藥甲霜靈的中間體(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)活性的酯酶EHesterase。用重組酯酶EHesterase催化MAP的水解，底物濃度50 g/L，反應(yīng)1h的轉(zhuǎn)化率29.5%，產(chǎn)物(R-酸)的eep是85.1%。該酶的最適反應(yīng)pH和溫度分別為9.0和50 ℃，在50 ℃以下和pH5～9之間具有較好的穩(wěn)定性。該酶水解MAP的米氏動力學參數(shù)Vm、Km分別是0.733 g/(L·min)和7.49 g/L。加入10%DMSO對酶EHesterase的立體選擇性和催化速度有一定的促進作用。Cu2+、Fe3+對酶活有明顯抑制作用。該酶水解MAP的活性與水解p-對硝基苯乙酸酯的活性數(shù)量級相當，是水解橄欖油活性的333倍。

反硝化無色桿菌； 酯酶； 克隆表達； (R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯； 酶學性質(zhì)

利用生物催化劑生產(chǎn)手性物質(zhì)具有條件溫和、選擇性高、污染少的優(yōu)點。目前，利用脂肪酶/酯酶催化酯水解或羧酸酯化是常用的制備手性醇、酸和酯的方法，其中用脂肪酶催化的生物拆分法已發(fā)展為生產(chǎn)手性化學品的重要方法之一[1]。

(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)是甲霜靈、氯霜靈、呋霜靈、異霜靈和苯霜靈等殺菌劑的中間體。甲霜靈是典型的旋光活性農(nóng)藥[2]，在體內(nèi)，R-(-)-對映體的活性比S-(+)-對映體高3～10倍[3]。在國內(nèi)市場上，甲霜靈的手性產(chǎn)品稱為精甲霜靈(R體為主)，它由化學法生產(chǎn)。

近年來，國內(nèi)外報道的生物拆分法生產(chǎn)手性純甲霜靈的方法，主要是對它的中間體(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)進行拆分，如圖1所示。選擇性拆分MAP的主要有：脂肪酶，如Lipase PS、Lipase OF、Lipase QLM[4]、Lipase CRL[5,6]、PSL[7,8]、CAL-B[8]；堿性蛋白酶Alcalase以及?；D(zhuǎn)移酶Acylase Amano[4]；微生物催化劑，如Burkhloderiasp. MC16-3和99-2-1[9]。這些催化劑對底物的立體選擇性有R型的(如Lipase PS)，也有S型(如PSL)。上述催化劑中，對Lipase PS的研究比較透徹[4,10]。

圖1 生物催化劑水解拆分(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)

在前期研究中，本實驗室獲得了一株對MAP具有較好的對映體選擇性和催化活性的新菌株，鑒定為反硝化無色桿菌(Achromobacterdenitrificans)，命名為Achromobacterdenitrificans1104。又通過基因文庫法找到了該菌酯酶基因(命名為EHest)序列。本文利用基因工程技術(shù)將該基因在大腸桿菌中表達，并研究了重組酯酶EHesterase的酶學性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

反硝化無色桿菌Achromobacterdenitrificans1104由本實驗室篩選得到，E.coliBL21Gold(DE3)plysS和pET-28a(+)由本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI 購于NEB；Ligation high Ver.2、KOD FX購于TOBOYO；DNA Marker DL2000、DNA Marker DL10000購于Takala；基因組抽提試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒、PCR清洗試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑購于AxyPrep；(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(98%)由浙江某公司贈送。除非特別說明，其它試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 酯酶基因的克隆及表達載體的構(gòu)建

PCR擴增引物分別為：上游引物(GGAATTCATGCTGGCGCACGGCTCCT，EcoRI)和下游引物(CCCAAGCTTTCAGGACAGGCCCAGCAAC，HindⅢ)。

以Achromobacterdenitrificans1104基因組為模板，PCR擴增目的條帶。PCR條件為：94 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，30個循環(huán)，68 ℃ 10 min。PCR擴增的條帶和pET-28a(+)用限制性內(nèi)切酶進行酶切，并用Ligation high Ver.2連接酶連接，轉(zhuǎn)化于E.coliBL21Gold(DE3)plysS，重組大腸桿菌命名為EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS。

1.2.2 重組酯酶的誘導表達與表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析

將重組菌EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS在含卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600約為0.5～0.8，分別標記為誘導組和未誘導組。在宿主菌(單獨)組，空載體菌組和誘導組中添加500 mmol/L IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，未誘導組加等量的無菌水，25 ℃，180 r/min培養(yǎng)10 h。分別取宿主菌組，空載體菌組，未誘導組和誘導組菌液，4 ℃，10 000 r/min離心10 min后棄上清液，細胞懸浮于100 mmol/L的pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中，菌體濃度大約為0.05 g/mL，冰浴條件下超聲破碎。4 ℃、10 000 r/min離心30 min，取上清液(酶液)，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.3 重組菌與原始菌的表達酶活測定

分別取原始菌和誘導培養(yǎng)后的重組菌濕菌體各15 g，用50 mL磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)懸浮，經(jīng)超聲破壁后，離心，上清液即為酶液。取適量的酶液(EHesterase酶液取10 μL，原始菌株酶液取50 μL)，0.25 g(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯為底物，0.1 g吐溫80作為乳化劑，一定量的磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)，總反應(yīng)體系為5 mL，37 ℃搖床中反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)速180 r/min，用6M鹽酸終止反應(yīng)。

1.2.4 重組酯酶對(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的水解拆分效果

取100 μL的酶液，反應(yīng)1 h，反應(yīng)條件同1.2.3。乙酸乙酯萃取，取一定量，用氮氣吹干，加入流動相溶解，正相手性HPLC檢測。

1.2.5 酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

取適量的酶液，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃下測定酶活，反應(yīng)10 min，其它條件同1.2.3。

將酶液分別放在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴中保溫2 h，每隔30 min取適量酶液測定酶活，反應(yīng)10 min。

1.2.6 酶的最適pH和酸堿耐受性

將酶液在不同的pH(pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0為100 mmol/L檸檬鈉緩沖液；pH 6.0、 pH 7.0、pH 8.0為100 mmol/L磷酸鹽緩沖液；pH 9.0為100 mmol/L Tris-HCl緩沖液；pH 10.0、pH 11.0為Na2CO3-NaHCO3緩沖液)測定酶活，反應(yīng)10 min。

將酶液放于100 mmol/L pH為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0的緩沖液中，緩沖液∶酶液=4∶1(體積比)，30 ℃下放置2 h，每隔30 min取取適量酶液測定酶活，反應(yīng)10 min。

1.2.7 底物濃度對酶反應(yīng)速率的影響暨米氏方程參數(shù)的測定

取適量酶液，(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的濃度分別為4 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L和100 g/L，反應(yīng)時間10 min，其它條件同1.2.3。

1.2.8 金屬離子對酶活的影響

含1 mmol/L 的K+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Ba2+、Mg2+、Li+的酶液，測定酶活，反應(yīng)10 min。

1.2.9 有機溶劑對酶活性和立體選擇性的影響

含10%和50%(v/v)有機溶劑(二甲基亞砜等)催化反應(yīng)體系分別用于拆分(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，反應(yīng)體系為5 mL，以沒加有機溶劑作為對照，反應(yīng)條件同1.2.3。

1.2.10 酶對不同底物的活性測定

以p-硝基苯酚酯為底物測定酶活：配制10 mmol/L的p-硝基苯酚酯的乙腈溶液，取0.03 mL與2.05 mL磷酸緩沖液溶液(pH 7.0)混合，加入20 μL酶液啟動反應(yīng)，37 ℃下測定p-硝基苯酚酯在 410 nm處吸光度隨時間的變化。以不加酶為對照。產(chǎn)物p-硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)為17 500 M-1cm-1。酶活單位1U：在上述條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μmol的產(chǎn)物p-硝基苯酚所需的酶量。

以橄欖油、乙酸丁酯、乙酸乙酯為底物測定酶活[11]，反應(yīng)在37 ℃、pH 7.0下進行。

1.2.11 (R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯及其產(chǎn)物(酸)的分析檢測

正相HPLC用于檢測R型和S型底物和產(chǎn)物(酸)。流動相為正己烷∶異丙醇=98∶2(加入0.1%的三氟乙酸)，流速0.5 ml/min，檢測紫外波長220 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μl，大賽璐手性O(shè)D柱250 mm×4 mm。色譜儀Waters。

反相HPLC用于檢測總底物和總產(chǎn)物(酸)。流動相是乙腈∶水=60∶40(加入0.1%三氟乙酸)，流速1 ml/min，檢測紫外波長220 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，C18柱250 mm×4 mm，色譜儀島津LC-20AT。

對映體過量值(ee)和底物總轉(zhuǎn)化率(C)按以下計算：

式中，[S]s和 [S]R分別為樣品中S和R型底物的含量，[P]s和 [P]R分別是S和R型產(chǎn)物(酸)的含量，ees和eep分別為底物和產(chǎn)物對映體過量值。

2 結(jié)果與討論

2.1 酯酶基因EHest的克隆表達

2.1.1 酯酶基因的擴增和基因工程菌的構(gòu)建

以反硝化無色桿菌Achromobacterdenitrificans1104基因組為模板，PCR擴增目的條帶，擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2。從圖中可以看出，在(500～1 000) bp左右都有明亮的條帶，無非特異性擴增，與預(yù)期大小相符。使用AxyPrepTMDNA Gel Extraction G Kit切膠回收目的片段。目的基因和pET-28a(+)經(jīng)雙酶切，連接后得到重組質(zhì)粒，然后全部轉(zhuǎn)化到E.coliBL21Gold(DE3)plysS宿主菌，獲得EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS。隨機挑取平板上的4個單菌落，LB液體培養(yǎng)基(50 μg/mL卡那霉素抗性和35 μg/mL氯霉素抗性)過夜富集培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒，做質(zhì)粒PCR驗證，瓊脂糖電泳檢測，EHest基因序列大小約為700 bp，與預(yù)期基因相符。取該克隆子送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果表明，重組大腸桿菌構(gòu)建成功。

圖2 EHest基因PCR擴增的瓊脂糖電泳

2.1.2 重組酯酶的表達與表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析

分別取宿主菌組，空載體菌組，未誘導組和誘導組菌液蛋白粗提液(即超聲破碎后的上清液)進行SDS-PAGE電泳分析，如圖3可知，經(jīng)IPTG誘導，重組大腸桿菌有目的蛋白含量的表達，EHest酯酶目的蛋白約為30KDa，說明基因在EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS成功異源表達。

M,蛋白Marker；1，誘導組；2，未誘導組；3，空載體菌株對照；

2.1.3 重組菌與原始菌的表達酶活的測定

原始菌株的表達酶活為17.6 U/mL。而重組菌EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS的表達酶活為476 U/mL，是原始菌株的27.1倍。

2.1.4 重組酯酶對(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的水解拆分效果

用重組酯酶EHesterase(來自重組濕菌體)對MAP進行拆分，折算后的濕菌體與底物的質(zhì)量比為1∶2.4(g/g)。經(jīng)過1 h反應(yīng)，底物的轉(zhuǎn)化率達到了29.5%，產(chǎn)物的eep達到了85.1%，對映體選擇性為R型。

Oh-Jin等[4]用Lipase PS催化MAP的水解，酶粉和底物用量之比為1∶2(g/g)，反應(yīng)3 h，轉(zhuǎn)化率為17.1%，eep達到96.6%，選擇性為R型。王巖等[7]利用南極假絲酵母脂肪酶CAL-B，酶粉和底物用量之比為1∶5.5(g/g)，反應(yīng)2 h，轉(zhuǎn)化率為48.2%，產(chǎn)物的eep為69.2%，選擇性是R型。與上述報道相比，EHesterase的活性高于Lipase PS和CAL-B，但酶的選擇性低于前者，與后者相當。

2.2 重組酯酶EHest的酶學性質(zhì)

2.2.1 酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

分別測定不同溫度下的酶活，以最高酶活為100%，結(jié)果如圖4，酯酶在50 ℃酶活最高，在40 ℃和60 ℃酶活仍保持最高酶活的80%以上，但高于70 ℃，酶的活性迅速下降。酯酶熱穩(wěn)定性實驗的結(jié)果如圖5，30 ℃、40 ℃和50 ℃處理的酶液的殘留酶活在90%以上。當溫度在60 ℃及以上時，酯酶的穩(wěn)定性迅速下降，70 ℃處理30 min后，酶的活性幾乎喪失。

圖4 溫度對重組酯酶EHesterase活性的影響

圖5 溫度對重組酯酶EHesterase穩(wěn)定性的影響

2.2.2 酶的最適pH及酸堿穩(wěn)定性

分別測定不同pH下的酶活，以最高酶活為100%，結(jié)果如圖6，酯酶在pH為9.0時活性最高， pH達到11時，依然保持相當高的活性；而在酸性條件下，酶的活性迅速下降，尤其pH為3和4時，酶的活性很低。pH對酶穩(wěn)定性實驗的結(jié)果如圖7，酶在pH 5～9之間保持了良好的穩(wěn)定性，但過酸過堿時，重組酯酶的穩(wěn)定性大大下降。

圖6 pH對重組酯酶EHesterase酶活的影響

圖7 pH對重組酯酶EHesterase穩(wěn)定性的影響

2.2.3 底物濃度對重組酯酶反應(yīng)速率的影響

測定了不同MAP濃度下的初始酶反應(yīng)速率，見圖8。MAP的初始水解近似一級不可逆反應(yīng)，應(yīng)該符合米氏方程。由圖可知，隨著MAP濃度的增加，反應(yīng)速率呈拋物線增加，確是典型的米氏方程曲線。通過對初始反應(yīng)速率和底物濃度作雙倒數(shù)圖(圖9)，求得米氏方程參數(shù)Vm=0.733 g/(L·min)，Km=7.49 g/L。由于所用酶液未經(jīng)純化，我們無法測出酶液中重組酯酶的確切濃度[E]，因此無法算出米氏方程的參數(shù)k2(k2=Vm/[E])。

圖8 底物(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯

2.2.4 金屬離子對酶活性的影響

分別測定加入金屬離子后的酶活，以不加金屬離子時的酶活(control)為100%，結(jié)果如圖10。K+、Ba2+和Li+能輕微促進酶活；Ca2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+和Mg2+輕微抑制酶活。但Cu2+和Fe3+存在時，出現(xiàn)了對酶活的明顯抑制。

圖9 酶反應(yīng)速率和底物濃度的雙倒數(shù)圖

圖10 金屬離子(1 mmol/L)對重組酯酶EHesterase

2.2.5 有機溶劑對重組酯酶活性和立體選擇性的影響

含10%和50%有機溶劑(DMSO等)的反應(yīng)體系分別用于拆分(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，以不加任何有機溶劑體系作為對照，結(jié)果如表1所示。10%DMSO對酶的立體選擇性和催化速度有促進作用；50%DMSO情況下，重組酯酶EHest依然保持了較高的催化速率，說明酶對DMSO的耐受性較好。10%其他的有機溶劑對重組酯酶EHest酶活性出現(xiàn)了的不同程度的抑制作用，當達到50%有機溶劑含量，酶活更低(數(shù)據(jù)未列出)。

2.2.6 重組酯酶對不同底物的活性

從表2知，重組酯酶水解MAP(酯)的活性是水解橄欖油(脂肪)活性的333倍，但它對其它兩種酯(乙酸乙酯和乙酸丁酯)的水解活性不高。MAP是芳香氨基酸的酯，該酶可能對芳香氨基酸殘基的選擇性大于脂肪酸殘基。在用p-硝基苯酚酯作底物測定酯酶/脂肪酶的活性時，由于這些底物的特殊性，不能在底物過量的情況下測定它們的酶活。p-硝基苯酚酯的典型測試濃度是0.14 mmol/L，用2.2.3節(jié)的米氏公式計算了MAP在此濃度下的酶活性，與之進行比較。從表2中可知，酶水解MAP的活性(相對活性0.40)與水解p-硝基苯乙酸酯的活性(相對活性1.0)數(shù)量級相當。由于MAP是甲醇酯，而p-硝基苯乙酸酯是芳香醇(p-硝基苯酚)的酯，所以酶對芳香醇殘基還是脂肪醇殘基的選擇性不明顯。隨著p-硝基苯酚酯脂肪酸殘基鏈長的增加，酶對它們的水解活性下降。丁酸酯的活性只有乙酸酯活性的12%，鏈再加長，活性趨向于0。

表1 有機溶劑對重組酯酶活性和

表2 重組酯酶對不同底物的相對活性*

*在計算相對活性時，將酶濃度均校正為一個相同的濃度水平。

**MAP指(R,S)-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯。

***為了和p-硝基苯酚酯進行比較，用2.2.3節(jié)的米氏公式計算MAP在此濃度下的酶活性。

3 結(jié)論

本研究將來自反硝化無色桿菌Achromobacterde-nitrificans1104的酯酶基因EHest，與表達載體pET28a(+)連接后，成功在E.coliBL21Gold(DE3)plysS中表達，IPTG誘導后重組菌的表達酶活為476 U/mL，比原始菌株高27.1倍。用重組酯酶EHesterase催化拆分(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，底物濃度50 g/L，反應(yīng)1 h，底物轉(zhuǎn)化率達到29.5%，產(chǎn)物(R-酸)的對映體過量值eep達到85.1%。

重組酯酶EHesterase的最適反應(yīng)pH和溫度為9.0和50 ℃，在50 ℃以下和pH 5～9之間具有較好的穩(wěn)定性。該酶水解MAP的米氏動力學參數(shù)Vm、Km分別是0.733 g/(L·min)和7.49 g/L。加入10%DMSO對酶EHesterase的立體選擇性和催化速度有一定的促進作用。Cu2+和Fe3+對酶活有明顯抑制作用。該酶水解MAP的活性與水解p-對硝基苯乙酸酯的活性數(shù)量級相當，是水解橄欖油活性的333倍。

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DONG Jian-ming, ZHANG Li-kun, LU Ya-nan, YAO Xing-chao, YANG Yu-ying,LU Yue-le, ZHANG Zhao-hui

College of Biological Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014

Cloning and expression of a novel esterase capable of enantioselective hydrolysis of methyl (R,S)-N-(2,6-dimethylphenyl) alaninate and its enzymatic properties

The esterase gene (EHest) fromAchromobacterdenitrificans1104 was ligated with plasmids pET28a(+), transformed intoE.coliBL21Gold(DE3)plysS. The resulting recombinants successfully expressed the esterase (EHesterase) capable of catalyzing enatioelective hydrolysis of methyl (R,S)-N-(2,6-dimethylphenyl) alaninate (MAP), a key intermediate for the synthesis of metalaxyl. Catalyzing the hydrolysis of MAP(5% m/v) by EHesterase for 1 h at 37 ℃, the substrate conversion was 29.5% andeepof the product acid (major in R configuration) was 85.1%．The optimum reaction pH and temperature of EHesterase were 9.0 and 50 ℃ respectively. The enzyme was stable at below 50 ℃ and between pH 5 and pH 9. The Michaelis-Menten kinetics parameters Vmand Kmfor MAP’s hydrolysis catalyzed by EHesterase were 0.733 g/(L·min) and 7.49 g/L respectively. 10% DMSO somewhat increased the enantioselectivity and activity of the enzyme. 1 mmol/L of Cu2+, Fe3+significantly inhibited its activity. Using MAP as substrate, the hydrolysis activity of EHesterase was the same order as that usingp-nitrophenyl acetate as substrate and was 333 times as high as that using olive oil as substrate.

Achromobacterdenitrificans; esterase; gene cloning and expression; methyl(R,S)-N-(2,6-dimethylphenyl) alaninate; enantioselective hydrolysis; enzymatic properties

國家自然科學基金(21447005)。

董劍鳴(1989～)，男，碩士研究生。E-mail:dongjianming1231@163.com。

*通訊作者：張朝暉(1968～)，男，博士，副教授，主要從事酶工程的研究。E-mail：zzh@zjut.edu.cn。