Agrobacteriumtumefaciens OAH-01產(chǎn)脲酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

侯恩玲， 劉良禹， 林金雪嬌， 毛相朝

中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003

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AgrobacteriumtumefaciensOAH-01產(chǎn)脲酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

侯恩玲， 劉良禹， 林金雪嬌， 毛相朝*

中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003

氨基甲酸乙酯(EC)是大多數(shù)發(fā)酵制品中的潛在致癌物，而尿素是EC的最主要前體物質(zhì)之一，因此需要采取相關(guān)措施控制發(fā)酵制品中尿素的含量。向酒體中添加脲酶具有安全、高效和處理?xiàng)l件溫和等優(yōu)點(diǎn)，是FDA推薦的降低EC 含量的優(yōu)先方法。微生物是脲酶的主要來(lái)源，可利用其實(shí)現(xiàn)脲酶的大規(guī)模生產(chǎn)。本文以產(chǎn)脲酶根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensOAH-01為研究對(duì)象，考察了該菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線，證明該菌株產(chǎn)脲酶屬生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，且能在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大產(chǎn)酶量，此外還研究了發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)：蛋白胨20，酵母粉5，葡萄糖5，F(xiàn)eCl30.54，Na2HPO40.5，KH2PO40.5，NiSO40.1，起始pH 7.0。在最適條件下發(fā)酵16 h，菌懸液中脲酶酶活可達(dá)1.077 U/mL，為優(yōu)化前的2.4倍。超聲破碎后細(xì)胞上清中的脲酶活性為0.419 U/mL，為優(yōu)化前的4.4倍。

氨基甲酸乙酯； 根癌農(nóng)桿菌； 脲酶； 發(fā)酵優(yōu)化

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一種致癌物質(zhì)，廣泛存在于發(fā)酵食品如醬油、面包、奶酪及酒精飲料中，是發(fā)酵過(guò)程中的天然副產(chǎn)物[1,2]。2007年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其由第2B組“或可能令人類(lèi)患癌的物質(zhì)”改為第2A組“可能令人類(lèi)患癌的物質(zhì)”[3]。目前許多國(guó)家都制定了EC的限量標(biāo)準(zhǔn)，加拿大是第一個(gè)制定酒精飲料中EC限量標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)家，此后，美國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家也相繼制定了部分飲料中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)該物質(zhì)在2002年成為聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì)，并制定出國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)(JECFA)在第64次會(huì)議上建議，應(yīng)盡可能減少發(fā)酵食品和飲料中的EC含量，同時(shí)世界衛(wèi)生組織也提議應(yīng)該制定酒類(lèi)飲料中EC含量限量標(biāo)準(zhǔn)[4]。在酒精制品的發(fā)酵和存儲(chǔ)過(guò)程中，尿素被認(rèn)為是EC的主要前體物質(zhì)，它可以同乙醇反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成EC[5, 6]。因此，控制酒精飲料中的尿素含量是減少EC含量的關(guān)鍵。

根據(jù)相關(guān)報(bào)道及實(shí)際應(yīng)用情況，可從3個(gè)方面控制尿素的含量：(1)對(duì)原料進(jìn)行處理。尿素常用于作為肥料，糧食原料中會(huì)有尿素殘留，而通過(guò)精制加工，可以有效減少尿素和精氨酸(尿素的前體物質(zhì))含量[7]；(2)降低發(fā)酵過(guò)程中尿素的生成。通過(guò)控制發(fā)酵過(guò)程中尿素的合成代謝途徑從而達(dá)到降低尿素含量的目的。例如，Kitamoto等構(gòu)建了一株工程清酒酵母，該酵母在發(fā)酵過(guò)程中不產(chǎn)生尿素和EC[8]，Suizu等則發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除酵母Saceharomycescerevisiae的CAR1基因后，將不再有尿素的積累[9]。(3)通過(guò)添加脲酶來(lái)分解尿素。據(jù)報(bào)道，通過(guò)添加酸性脲酶可以有效降低尿素含量[10]。Liu等報(bào)道一株Enterobactersp.，其產(chǎn)生的酸性脲酶可以去除黃酒中66.5%的尿素[11]。Zhou等也報(bào)道市售的酸性脲酶可以去除黃酒中80%的尿素[12]。微生物是脲酶的主要來(lái)源。雖然關(guān)于細(xì)菌、真菌和放線菌產(chǎn)脲酶的報(bào)道較多，但不同菌種所產(chǎn)脲酶的性質(zhì)及其產(chǎn)酶能力存在很大差異，從中尋找能適用于發(fā)酵食品生產(chǎn)的脲酶，具有現(xiàn)實(shí)意義。目前將微生物來(lái)源脲酶應(yīng)用于降解發(fā)酵食品中的尿素，從而降低EC含量的相關(guān)研究仍較少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)室自主篩選得到一株產(chǎn)脲酶的根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensOAH-01，以該菌株為研究對(duì)象，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，確定了該菌株的最佳產(chǎn)酶條件，提高了菌株的產(chǎn)酶量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensOAH-01由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.10914。

1.1.2 主要試劑

蔗糖、D-果糖、麥芽糖、α-乳糖、硫酸銨、FeCl3、KH2PO4、Na2HPO4、MnSO4·4H2O、NiSO4·6H2O、MgSO4·7H2O等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蛋白胨、酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司，瓊脂、尿素購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0。

脲酶選擇培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨1，NaCl 5，葡萄糖0.1，KH2PO42，尿素2，酚紅0.012，瓊脂15，pH 6.80。121 ℃滅菌20 min。

復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)：不添加瓊脂，其余同脲酶選擇培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖5，KH2PO40.5，Na2HPO40.5，MnSO4·4H2O 0.055，NiSO4·6H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

顯色劑Ⅰ：稱(chēng)取15.0 g苯酚加 0.625 g 亞硝基鐵氫化鈉，加水溶解，定容至 250 mL。

顯色劑Ⅱ：稱(chēng)取13.125 g 氫氧化鈉，加適量水溶解，再向其中加入7.5 mL 次氯酸鈉，定容至 250 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活測(cè)定方法

底物為3%尿素，反應(yīng)緩沖液為0.05 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 4.5)，將50 μL適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液加入1 mL反應(yīng)體系中，在37 ℃下反應(yīng)15 min后，加1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，再加1 mL顯色劑I和1 mL顯色劑II。37 ℃反應(yīng)15 min后定容至25 mL，測(cè)OD625。酶活單位定義(U)：在上述條件下反應(yīng)，每分鐘釋放1 μmol氨定義為一個(gè)酶活單位。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶特性測(cè)定

為研究菌株A.tumefaciensOAH-01的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶特性。將保藏的菌種接種至LB培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，然后將活化后的菌液按照2.5%的接種量接入上述發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)。24 h內(nèi)每隔4 h取樣測(cè)定搖瓶發(fā)酵液中的菌體濃度和酶活性，每次測(cè)三個(gè)平行樣。

1.2.3 碳源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

(1)不同碳源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：配制不同碳源(葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、α-乳糖，濃度均為5 g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后，測(cè)定菌懸液中的脲酶活力，比較不同碳源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

(2)碳源濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：選擇發(fā)酵產(chǎn)酶水平最高的碳源為最優(yōu)碳源，將其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別調(diào)整為0.5 g/L、1 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L和20 g/L，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同濃度碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后，測(cè)定菌懸液中脲酶活力以確定最佳碳源濃度。

1.2.4 氮源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

(1)不同氮源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：配制不同氮源(蛋白胨，氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀濃度均為5 g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后，測(cè)定菌懸液中的脲酶活力，比較不同氮源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

(2)氮源濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：選擇最優(yōu)氮源，將其在發(fā)酵培養(yǎng)基中濃度分別調(diào)至5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L和80 g/L，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同濃度氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后，測(cè)定菌懸液中的脲酶活力，確定最佳氮源濃度。

1.2.5 酵母粉對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

原始發(fā)酵培養(yǎng)基中不含酵母粉，通過(guò)向初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0 g/L、0.5 g/L、1 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L和25 g/L的酵母粉配制發(fā)酵培養(yǎng)基，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同濃度酵母粉的發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后，測(cè)定菌懸液的酶活力，考察酵母粉對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.6 發(fā)酵初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

分別配制不同初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的發(fā)酵培養(yǎng)基，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于不同pH的發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后，測(cè)定脲酶活力，比較不同初始pH對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.7 常見(jiàn)金屬離子對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

向除去金屬離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的Ni2+、Mn2+、Mg2+、Fe3+、Na2HPO4和KH2PO4離子，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同濃度金屬離子的發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后，測(cè)定菌懸液中的脲酶活力，考察不同金屬離子及金屬離子的不同濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.8 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、FeCl3四因素，以發(fā)酵后菌懸液中的脲酶活力為指標(biāo)，做四因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下表1。

表1 正交試驗(yàn)L27(35)

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株A.tumefaciensOAH-01的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶特性

菌株A.tumefaciensOAH-01生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線如圖1所示。4 h內(nèi)菌體處于延滯期，生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶量較小。4 h后菌體進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，產(chǎn)酶水平也隨著菌體密度增加而迅速提升，說(shuō)明產(chǎn)酶屬于生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型。16 h時(shí)，菌體密度達(dá)到最大，之后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰退期。而16 h脲酶活力也達(dá)到最大，表明酶活力和菌體量顯著相關(guān)，這與Liu等報(bào)道的Enterobactersp.菌株類(lèi)似[11]。根據(jù)前人的文獻(xiàn)報(bào)道，Lactobacillusfermentum需30 h～72 h酶活力水平才能達(dá)到最高[13]，而Proteusmirabilis則至少需72 h[14]。與之相比，A.tumefaciensOAH-01產(chǎn)酶峰值到來(lái)的時(shí)間顯著縮短。

圖1 菌株A. tumefaciens OAH-01的

2.2 碳源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.2.1 不同碳源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

碳源是組成細(xì)胞骨架及菌體生長(zhǎng)代謝不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，不同菌體中所含有的酶系不同，因此對(duì)不同碳源的利用率也不同，菌種利用不同種類(lèi)的碳源得到的菌體量和產(chǎn)酶量也有很大差異。不同種類(lèi)的碳源對(duì)菌株A.tumefaciensOAH-01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖2A所示，從圖中可以看出，當(dāng)葡萄糖為碳源時(shí)所得脲酶酶活水平最高，使用其他4種碳源，所得脲酶酶活力相差不大，但均低于葡萄糖，因此選擇葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。

2.2.2 碳源濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

考察不同葡萄糖濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。如圖2B所示，葡萄糖濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶影響較大。當(dāng)葡萄糖濃度為0.5 g/L和1.0 g/L時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酶活力較低，說(shuō)明碳源濃度低會(huì)使菌體營(yíng)養(yǎng)不足，產(chǎn)酶量少。當(dāng)葡萄糖濃度增加到5.0 g/L時(shí)，酶活顯著增加并達(dá)到最大值，進(jìn)一步增加葡萄糖濃度，酶活開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明碳源濃度過(guò)高反而會(huì)抑制菌體產(chǎn)酶。因此，葡萄糖的最佳濃度為5.0 g/L。

2.3 氮源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.1 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

氮源是菌體細(xì)胞和各種含氮物質(zhì)的構(gòu)成成分，也是菌體生長(zhǎng)合成代謝產(chǎn)物必不可少的營(yíng)養(yǎng)成分。不同種類(lèi)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響如圖2C所示。從圖中可看出，當(dāng)以蛋白胨作為氮源時(shí)，菌株生長(zhǎng)狀況良好，而使用其他種類(lèi)氮源進(jìn)行發(fā)酵，16 h后，發(fā)酵液仍保持澄清狀態(tài)，菌體沒(méi)有明顯生長(zhǎng)跡象。這說(shuō)明菌株A.tumefaciensOAH-01無(wú)法有效利用氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀等無(wú)機(jī)氮源進(jìn)行菌體生長(zhǎng)。因此選擇蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

2.3.2 氮源濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的蛋白胨，考察氮源濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。如圖2D所示，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛仍? g/L～30 g/L內(nèi)時(shí)，隨蛋白胨濃度升高，脲酶活性逐漸增加，30 g/L時(shí)脲酶活性達(dá)到最大，繼續(xù)增大蛋白胨濃度，脲酶活性開(kāi)始下降。因此發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨的最適濃度選擇30 g/L左右。

圖2 碳源、氮源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.4 酵母粉對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

酵母粉作為菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，既可算作碳源，也可作為氮源?？疾煸诔跏及l(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度酵母粉對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)酵母粉添加濃度在20 g/L以下時(shí)，對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，但隨著添加濃度提高，發(fā)酵液中酶活力減弱。當(dāng)添加量超過(guò)20 g/L時(shí)，則反而會(huì)抑制產(chǎn)酶。因此，酵母粉的適宜添加濃度定為5.0 g/L。

2.5 發(fā)酵初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH會(huì)直接影響菌體的生長(zhǎng)代謝。由圖4可知，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。當(dāng)初始pH為6.0～9.0時(shí)，發(fā)酵后獲得的脲酶酶活較高，且當(dāng)pH為7.0時(shí)脲酶酶活力最高。當(dāng)pH小于6.0或大于9.0時(shí)發(fā)酵后酶活力較低，說(shuō)明過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和脲酶的產(chǎn)量。因此，本試驗(yàn)認(rèn)為pH 7.0為菌株OAH-01發(fā)酵產(chǎn)酶的最適宜pH。

圖3 酵母粉濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖4 發(fā)酵初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.6 常見(jiàn)金屬離子對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

某些金屬離子是核酸、蛋白質(zhì)、輔酶和細(xì)胞膜的構(gòu)成元素，同時(shí)還有維持細(xì)胞滲透壓和調(diào)節(jié)酸堿度的作用。

2.6.1 Ni2+對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

脲酶是一種含鎳的寡聚酶[15]。培養(yǎng)基中的Ni2+對(duì)菌株產(chǎn)酶可能會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)作用。為考察Ni2+對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為0 mmol/L、0.008 mmol/L、0.04 mmol/L、0.2 mmol/L和1 mmol/L的Ni2+。不同濃度的Ni2+對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響如圖5A所示。從圖中可看出，低濃度的Ni2+對(duì)菌體產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，但隨著Ni2+濃度升高，逐漸變?yōu)橐种?。因此，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加少量Ni2+可有助于提高脲酶的產(chǎn)量。

2.6.2 Mn2+對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

為考察Mn2+對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了不同濃度的Mn2+，濃度分別為0 mmol/L、0.008 mmol/L、0.04 mmol/L、0.2 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和50 mmol/L，圖5B顯示，隨Mn2+添加量的提高，菌株產(chǎn)酶總體上表現(xiàn)為受抑制。因此以不添加Mn2+為宜。

圖5 金屬離子對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.6.3 Mg2+對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

圖5C顯示了不同Mg2+濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。從圖中可看出，在0～50 mmol/L的范圍內(nèi)，Mg2+濃度高低與脲酶活力無(wú)顯著相關(guān)性。因此可從發(fā)酵培養(yǎng)基配方中去除添加Mg2+。

2.6.4 Fe3+對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加濃度分別為0 mmol/L、0.04 mmol/L、0.2 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和50 mmol/L的Fe3+，結(jié)果如圖5D所示。Fe3+濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較大，當(dāng)濃度為1 mmol/L時(shí)對(duì)產(chǎn)酶促進(jìn)效果最顯著。

2.6.5 初始培養(yǎng)基中Na2HPO4和KH2PO4對(duì)菌株OAH-01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

為考察Na2HPO4和KH2PO4對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，向培養(yǎng)基中分別添加0 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L和2 g/L的Na2HPO4和KH2PO4。如圖6所示，隨Na2HPO4濃度提高，脲酶酶活先升高后保持穩(wěn)定，當(dāng)Na2HPO4濃度為0.5 g/L，脲酶酶活達(dá)到最大，再提高濃度，酶活基本保持不變。因此將Na2HPO4濃度定為0.5 g/L。隨KH2PO4濃度的升高，脲酶酶活則逐漸下降。但當(dāng)濃度為0.1 g/L和0.5 g/L時(shí)，發(fā)酵后得到的脲酶酶活要高于初始發(fā)酵培養(yǎng)基。濃度越小脲酶酶活越高，故選擇KH2PO4的添加濃度為0.1 g/L。

圖6 Na2HPO4和KH2PO4對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了培養(yǎng)基中各組分對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響及各組分的最適濃度范圍。為進(jìn)一步確定最佳培養(yǎng)基配方，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較大的四個(gè)因素：蛋白胨(A)、酵母粉(B)、葡萄糖(C)、FeCl3(D)，以發(fā)酵后菌懸液中脲酶活力為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

極差R值分析可知，蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、FeCl3濃度對(duì)菌懸液中酶活力影響的主次效應(yīng)為FeCl3>酵母粉>葡萄糖>蛋白胨。根據(jù)圖7可知，這四種組分濃度的最優(yōu)組合是A1B2C2D3，即蛋白胨20 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，F(xiàn)eCl30.54 g/L，此時(shí)發(fā)酵后菌懸液中酶活水平最高。

圖7 酶活均值主效應(yīng)圖

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用最佳培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，菌懸液中的脲酶活力水平為1.077 U/mL，是使用初始發(fā)酵培養(yǎng)基所得酶活(0.45 U/mL)的2.4倍。將發(fā)酵后收獲的菌體進(jìn)行超聲破碎，離心取上清測(cè)脲酶活力，結(jié)果顯示，采用最佳培養(yǎng)基配方，上清液中脲酶酶活可達(dá)0.419 U/mL，而使用初始培養(yǎng)基，上清中酶活力僅為0.095 U/mL，前者比后者提升了4.4倍。

3 結(jié)論

以產(chǎn)脲酶根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciensOAH-01為對(duì)象，研究了該菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線。利用單因素試驗(yàn)及正交優(yōu)化確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)：蛋白胨20，酵母粉5，葡萄糖5，F(xiàn)eCl30.54，Na2HPO40.5，KH2PO40.5，NiSO40.1，起始pH 7.0。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，菌懸液中脲酶活力水平提高2.4倍，而超聲破碎后，細(xì)胞上清液中脲酶活性水平提高了4.4倍。

[1] Masqu MC, Soler M, Zaplana B,etal. Ethyl carbamate content in wines with malolactic fermentation induced at different points in the vinification process. Annals of Microbiology, 2011, 61(1): 199-206.

[2] Sarah H, Colin C, Nicholas P,etal. Survey of ethyl carbamate in fermented foods sold in the United Kingdom in 2004. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2007, 55(7): 2755-2759.

[3] 巫景銘, 洪瑞澤. SPE結(jié)合GC/MS測(cè)定黃酒中氨基甲酸乙酯. 釀酒, 2010, 37(6): 67-70.

[4] 劉俊. 中國(guó)黃酒中氨基甲酸乙酯控制策略及機(jī)制的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué), 2012.

[5] Delledonne D, Rivetti F, Romano U. Developments in the production and application of dimethylcarbonate. Appl Catala-Gen, 2001, 221(1): 241-251.

[6] Wang D, Yang B, Zhai X,etal. Synthesis of diethyl carbonate by catalytic alcoholysis of urea. Fuel Process Technol, 2007, 88(8): 807-812.

[7] 沈棚. 客家黃酒中氨基甲酸乙酯的研究[D]. 廣東：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院, 2014.

[8] Kitamoto K, Miyazaki K, Yamaoka H,etal. Sake Brewing Tests using Sake Yeasts Producing No Urea in Sake Factories. J Ceram Soc Jpn, 1992, 87: 602-607.

[9] Suizu T, Iimura Y, Gomi K,etal. Construction of Urea Non-producing YeastSaccharomycescerevisiaeby Disruption of the CAR1 Gene. Agric Biol Chem, 1990, 54(2): 537-539.

[10] 趙光鰲, 劉吉泉. 酒中致癌物氨基甲酸乙酯的研究. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1988, 5: 70-72.

[11] Liu J, Xu Y, Nie Y,etal. Optimization production of acid urease byEnterobactersp. in an approach to reduce urea in Chinese rice wine. Bioproc Biosyst Eng, 2012, 35(4): 651-657.

[12] Zhou JD, Ding GH, Zheng ZQ. Study on enzymatic characteristics of acid urease to hydrolyze urea in Chinese rice wine. China Brew, 2006, 11(11): 45-46.

[13] Mhadhbi H, Ben-Rejeb S, Cleroux C,etal. Purification and characterization of acid urease fromLactobacillusfermentum. Talanta, 1990, 37(2): 167-173.

[14] Mohammed SO, Elshahaby OA, Hafez EE,etal. Characterization and purification of urease enzyme from newproteusmirabilisstrain. Journal of Advanced Scientific Research, 2014, 5(4): 12-20.

[15] 趙圣國(guó), 王加啟, 劉開(kāi)朗等. 脲酶在生物工程中的應(yīng)用. 生物技術(shù)通報(bào), 2009, 3: 37-41.

Optimization of fermentation culture by urease-producing strainAgrobacteriumtumefaciensOAH-01

HOU En-ling, LIU Liang-yu, LIN JIN Xue-jiao, MAO Xiang-zhao

Food science and engineering, Ocean university of China, Shandong, Qingdao, 276000

Urea as the main precursor of ethyl carbamate (EC) is a potential carcinogenic component in most of the fermented foods. The methods for elimination of urea must be taken to control the amount of urea. The preferred method for reducing EC content recommended by FDA is adding urease to the wine, because of its advantages such as efficiency, high safety and mild treatment conditions. Microbes are the main source of urease which can be carried out mass production. In this paper, an urease-producing strainAgrobacteriumtumefaciensOAH-01 was investigated. Its growth curve and urease-producing curve indicated that the production of enzyme was growth associated model and it could reach the maximum yield in a relatively short time. The effects of fermentation medium composition on urease production by OAH-01 were also investigated. The fermentation medium composition was optimized based on single factor experiment and orthogonal experiment. The optimal medium and conditions were as follows (g/L): peptone 20, yeast extract 5, glucose 5, FeCl30.54, Na2HPO40.5, KH2PO40.5, NiSO40.1, pH 7.0 and cultivation 16 h. Under the optimized conditions, the urease activity of cell suspension was 1.08 U/mL, it was 2.4 times than that before optimization. The activity of supernatant after ultrasonic decomposition was 0.419 U/mL, it was 4.4 times than that before optimization.

ethyl carbamate;Agrobacteriumtumefaciens; urease; fermentation optimization

山東省科技重大專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào)：2015ZDZX05003)。

侯恩玲(1990～)，女，碩士研究生。E-mail：15763908360@163.com。

*通訊作者：毛相朝，男，教授。Tel：0532-82031360，E-mail：xzhmao@ouc.edu.cn。