細(xì)菌脲酶蛋白結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制

賀越 趙圣國(guó) 張曉音，2 鄭楠 王加啟

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070）

脲酶（Urease，EC 3.5.1.5）是一種活性中心含有鎳離子的金屬酶［1］，由許多植物、真菌、細(xì)菌和一些無(wú)脊椎動(dòng)物合成［2］。脲酶催化尿素分解產(chǎn)生氨和氨基甲酸酯，后者進(jìn)一步自發(fā)地分解產(chǎn)生氨和碳酸氫鹽［3］。動(dòng)物、植物和微生物能利用脲酶催化產(chǎn)生的氨作為養(yǎng)分，促進(jìn)自身的代謝生長(zhǎng)［4］。例如，在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，瘤胃微生物利用氨合成微生物蛋白，供給機(jī)體利用，同時(shí)幫助降低蛋白質(zhì)飼料成本［5］。但是，脲酶也存在諸多不利的影響。反芻動(dòng)物瘤胃中的微生物脲酶活性過(guò)高會(huì)使體內(nèi)產(chǎn)氨速度大于氨的利用速度，極易引起氨中毒［6-7］。人體內(nèi)一些致病菌能利用分泌的脲酶對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，如人胃中的幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori）脲酶分解尿素產(chǎn)生氨，致使胃中pH升高，促進(jìn)幽門(mén)螺桿菌的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而引發(fā)與胃腸相關(guān)的癌癥［8］。由此可見(jiàn)，脲酶所具備的獨(dú)特生物學(xué)功能，對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖、人類(lèi)健康等方面都具有深遠(yuǎn)的影響。

不同細(xì)菌的脲酶基因簇在組成成分上存在一定的差異，但大部分都由結(jié)構(gòu)基因和輔助基因組成，少部分還包含調(diào)節(jié)基因。由脲酶基因簇編碼的脲酶蛋白也分成結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白。細(xì)菌脲酶結(jié)構(gòu)蛋白包含活性中心，而沒(méi)有金屬離子與活性中心作用的脲酶結(jié)構(gòu)蛋白處于失活的狀態(tài)，只有當(dāng)輔助蛋白協(xié)助將金屬鎳傳遞到活性中心后，脲酶結(jié)構(gòu)蛋白才被激活，從而起到催化尿素分解的作用［9-10］。催化活性依賴(lài)鎳離子是脲酶的一個(gè)獨(dú)特特征［11］，也是脲酶抑制劑開(kāi)發(fā)的一個(gè)靶點(diǎn)。因此，本文將從細(xì)菌脲酶結(jié)構(gòu)特征、活性中心特征、脲酶催化機(jī)制、脲酶抑制劑作用機(jī)制4個(gè)方面進(jìn)行綜述，以期為脲酶的研究提供參考。

1 脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)特征

目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Date Bank，PDB）中收錄的脲酶結(jié)構(gòu)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的總數(shù)量為97，而大部分為細(xì)菌脲酶，其中產(chǎn)氣克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）脲酶、芽孢桿菌（Sporosarcina pasteurii）脲酶、幽門(mén)螺桿菌脲酶分別占總數(shù)的35%（34）、23.7%（23）、18.5%（18），在這些晶體結(jié)構(gòu)中包括一些突變的脲酶結(jié)構(gòu)和抑制劑作用下的晶體結(jié)構(gòu)。產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶、巴氏芽孢桿菌（Bacillus pasteurii）脲酶和幽門(mén)螺桿菌脲酶是目前研究得較為透徹的3種細(xì)菌脲酶。

不同來(lái)源的細(xì)菌脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的亞基數(shù)量存在差異，但亞基組成上也存在聯(lián)系（圖1）［12-13］。產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶和巴氏芽孢桿菌脲酶由UreA（γ）、UreB（β）、UreC（α）3個(gè)亞基組成，而幽門(mén)螺桿菌脲酶則由兩個(gè)亞基UreA（β）、UreB（α）組成，研究發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌脲酶中β亞基和產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶、巴氏芽孢桿菌脲酶中β和γ亞基融合體具有同源性，三者的α亞基具有同源性［14］。盡管脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異，但是一般都會(huì)形成相似的三聚體結(jié)構(gòu)［15］。圖2是產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶、巴氏芽孢桿菌脲酶和幽門(mén)螺桿菌脲酶的連續(xù)剖面圖［16］，產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶和巴氏芽孢桿菌脲酶由α、β、γ三個(gè)亞基聚合形成（αβγ）3形式［13，17］，幽門(mén)螺桿菌脲酶由α、β二個(gè)亞基以［（αβ）3］4形式聚合形成。脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的α亞基包括1個(gè)TIM（Triosephosphate isomerase，異丙酮酸異構(gòu)酶）桶狀結(jié)構(gòu)和1個(gè)β-折疊域；β亞基位于這個(gè)三聚物的外表面，以β-折疊為主；γ亞基則既包括α-螺旋也包括β-折疊［18］。幽門(mén)螺桿菌脲酶的β亞基有N端和C端域，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間由1個(gè)短的loop環(huán)相連接，位于α亞基的上面和側(cè)面，起著連接3個(gè)子單位的作用，3個(gè)β亞基的N端以首尾相連的方式連接，從而促使三聚形式的形成［14］。在產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶中，每一個(gè)α亞基與2個(gè)β和γ亞基相連形成“三角形”的邊，并且位于β和γ亞基的中間；每一個(gè)β亞基與2個(gè)毗鄰的α亞基連接，位于“三角形”的角上；每一個(gè)γ亞基也與2個(gè)α亞基相連，并且與另外2個(gè)γ亞基緊密連接［19］。

脲酶結(jié)構(gòu)蛋白亞基的功能目前也有一些研究。通過(guò)化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜的方法對(duì)產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，β亞基上的賴(lài)氨酸76（Lys76）與α亞基的賴(lài)氨酸382（Lys382）能發(fā)生交聯(lián)，而這兩個(gè)氨基酸在晶體結(jié)構(gòu)中的位置相距較遠(yuǎn)，這提示了β亞基可能在與傳遞鎳離子的輔助蛋白相互作用下發(fā)生了構(gòu)象變化，從而使二氧化碳（CO2）和鎳離子能更好地進(jìn)入活性中心［20-21］。通過(guò)對(duì)產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶的β亞基中的第19個(gè)氨基酸進(jìn)行突變，揭示了β亞基能避免金屬離子在進(jìn)入活性中心前被鰲合，并促進(jìn)金屬離子進(jìn)入活性中心［22］。

圖1 細(xì)菌脲酶結(jié)構(gòu)蛋白亞基組成與排布［12-13］

2 脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的活性中心及flap區(qū)域

2.1 脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的活性中心

脲酶活性中心位于結(jié)構(gòu)蛋白中，在催化尿素分解的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的細(xì)菌脲酶活性中心結(jié)構(gòu)具有很高的相似性，如產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶和芽孢桿菌脲酶［23］。這也提示對(duì)不同來(lái)源的細(xì)菌脲酶結(jié)構(gòu)蛋白活性中心進(jìn)行比較分析，對(duì)開(kāi)發(fā)廣譜性微生物脲酶抑制劑化合物有著重要的意義。已知的脲酶的活性中心由高度保守的氨基酸序列［24］、2個(gè)金屬離子、金屬離子配位體組成［25］。金屬離子是脲酶的激活劑，只有當(dāng)金屬離子進(jìn)入活性中心后，脲酶結(jié)構(gòu)蛋白才能被激活。激活脲酶的最有效的金屬離子是鎳離子，曾有研究用其他金屬離子來(lái)替代鎳離子，發(fā)現(xiàn)其他金屬離子激活脲酶的效果甚微［26］。脲酶結(jié)構(gòu)蛋白每一個(gè)αβγ或每一個(gè)αβ亞單位（圖2）中含有一個(gè)活性中心，活性中心位于α亞基上，每一個(gè)活性中心包含2個(gè)鎳離子（紅色球體）。由此可知，一個(gè)產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶或巴氏芽孢桿菌脲酶有3個(gè)活性中心，包含6個(gè)鎳離子，一個(gè)幽門(mén)螺桿菌脲酶有12個(gè)活性中心，包含24個(gè)鎳離子［27］。

圖2 巴氏芽孢桿菌（A）、產(chǎn)氣克雷伯氏菌（B）、幽門(mén)螺桿菌（C）的脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)特征［16］

脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的活性中心的這兩個(gè)鎳離子稱(chēng)為Ni1和Ni2，兩個(gè)鎳離子由1個(gè)氨基酰化的賴(lài)氨酸（Lys）殘基和1個(gè)羥基連接，2個(gè)鎳離子之間的距離約為3.7 ?，通過(guò)突變研究發(fā)現(xiàn)，氨基?；腖ys殘基是脲酶活化過(guò)程中必不可少的［28-30］，除此之外，Ni1還與另外2個(gè)組氨酸（His）殘基和1個(gè)水分子配位，而Ni2除了與2個(gè)His殘基和1個(gè)水分子配位外，還有一個(gè)天冬氨酸（Asp）與之配位［31-32］（圖3），連接2個(gè)鎳離子的羥基與3個(gè)水分子（2個(gè)與鎳離子配位）一起在活性中心形成了1個(gè)四面體［33］。

通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，用丙氨酸（Ala）對(duì)產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶活性中心的His、Asp進(jìn)行替換，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)活性中心αHis134、αHis136、αHis246等與鎳離子相結(jié)合的氨基酸以及鎳離子周?chē)摩罤is219、αAsp221等氨基酸發(fā)生突變后，脲酶的活性顯著降低，這一結(jié)果的原因可能是與鎳離子配位的氨基酸發(fā)生突變后使鎳離子與活性中心的配位發(fā)生改變，進(jìn)一步改變了脲酶活性，而αHis219本身與促進(jìn)底物與鎳離子的結(jié)合有關(guān)［34-35］，發(fā)生突變后，致使底物與鎳離子的結(jié)合能力降低，從而反映出脲酶活性的降低。

2.2 flap區(qū)域

在脲酶催化過(guò)程中，除活性中心氨基酸殘基發(fā)揮作用外，活性中心附近的半胱氨酸（Cys）形成了一個(gè)柔性、可移動(dòng)的flap區(qū)域（圖4）［16］。這個(gè)flap區(qū)域覆蓋在活性中心上，由螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域組成，通過(guò)運(yùn)動(dòng)控制一個(gè)His殘基來(lái)調(diào)控底物的進(jìn)入和產(chǎn)物的排出［18，36］。在催化過(guò)程中，flap區(qū)域的氨基酸殘基主要通過(guò)氫鍵與底物結(jié)合，從而起到穩(wěn)定催化過(guò)渡狀態(tài)、加速催化反應(yīng)的作用［37］。用Ala對(duì)產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶flap區(qū)域的Cys319進(jìn)行替換，脲酶活性顯著下降，驗(yàn)證了Cys319 在脲酶催化中起著重要的作用［38］。

圖3 產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶活性中心［12］

圖4 脲酶flap區(qū)域開(kāi)放（A）和關(guān)閉（B）［16］

3 脲酶的催化機(jī)制

脲酶催化尿素分解的機(jī)制一直以來(lái)都頗受爭(zhēng)議［39-40］，隨著脲酶抑制劑的研究的深入，有一種催化機(jī)制獲得了廣泛的認(rèn)可［41-42］。該機(jī)制［43］是：脲酶被鎳離子激活后，其flap區(qū)域打開(kāi)，允許底物尿素進(jìn)入活性中心，然后尿素取代活性位點(diǎn)的3個(gè)水分子（圖5-A），即尿素的羰基氧與Ni1離子結(jié)合，這種結(jié)合使尿素的碳更親電，因此更容易發(fā)生親核攻擊（圖5-B），當(dāng)尿素與Ni1結(jié)合后，flap區(qū)域關(guān)閉，即整個(gè)催化過(guò)程與外界隔離。然后，尿素氨基氮原子與Ni2結(jié)合，這就使得尿素與脲酶形成雙齒配位（圖5-C），這種結(jié)合有助于連接兩個(gè)鎳離子的水分子親核攻擊尿素的羰基碳，使尿素中的O=C雙鍵發(fā)生斷裂（圖5-D），親核攻擊促使NH3和氨基甲酸酯的形成，而后flap區(qū)域打開(kāi)，將催化產(chǎn)物釋放出來(lái)（圖5-E），flap區(qū)域的打開(kāi)讓下一個(gè)尿素分子進(jìn)入活性中心，從而進(jìn)行下一個(gè)催化反應(yīng)［44］。但是目前這種催化機(jī)制也尚存在一點(diǎn)爭(zhēng)議，主要爭(zhēng)議點(diǎn)是，Benini等［40］提出的這個(gè)機(jī)制中認(rèn)為親核攻擊是通過(guò)連接兩個(gè)鎳離子的氫氧根來(lái)為NH3提供質(zhì)子的，但Karplus等［39］認(rèn)為是flap區(qū)域的一個(gè)His殘基起到質(zhì)子化作用。另外，Karplus等［39］還考慮了一種催化機(jī)制，即尿素與Ni1和Ni2單齒結(jié)合，而兩個(gè)鎳離子提供的水分子親核攻擊尿素羰基碳。

4 脲酶抑制劑作用機(jī)制

脲酶抑制劑可以對(duì)脲酶的活性進(jìn)行調(diào)控［45-46］。目前已知的脲酶抑制劑種類(lèi)繁多，根據(jù)脲酶與抑制劑的結(jié)構(gòu)特征可大致分為兩類(lèi)：（1）與脲酶活性中心鎳離子相互作用的脲酶抑制劑，如尿素類(lèi)似物［47］、氧肟酸類(lèi)［48］、磷酸二酰胺及其衍生物［49］等；（2）與flap區(qū)域保守的氨基酸相互作用的脲酶抑制劑，如1，4-苯醌［50］、鄰苯二酚［51］、一些重金屬離子［52］等。盡管存在多種脲酶抑制劑，但是目前只有乙酰氧肟酸可用于治療幽門(mén)螺桿菌引起的胃和尿道感染疾病，它也是目前市場(chǎng)上唯一的商用抑制劑。

脲酶抑制劑與脲酶活性中心相互作用的機(jī)制分成兩種，一種是以硫脲為代表的尿素類(lèi)似物，這類(lèi)小分子的結(jié)構(gòu)往往大于尿素分子，其結(jié)構(gòu)中含有尿素結(jié)構(gòu)部分，這就使得尿素類(lèi)似物能像尿素一樣與脲酶結(jié)合，其結(jié)合機(jī)制和尿素結(jié)合到脲酶的過(guò)程一樣，區(qū)別在于脲酶不能分解尿素類(lèi)似物［53］。另一種是磷酸二酰胺及其衍生物類(lèi)脲酶抑制劑，這類(lèi)小分子的結(jié)構(gòu)與底物沒(méi)有相似性，它本身不與脲酶活性中心結(jié)合，而是通過(guò)分解成其他中間產(chǎn)物來(lái)發(fā)揮作用，也稱(chēng)為“機(jī)械性抑制劑”。Mazzei等［54］通過(guò)X-射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)（X-ray）獲得了在正丁基硫代磷酰三胺（N-（n-butyl）thiophosphoric triamide，NBPT）作用下的SPU晶體結(jié)構(gòu)，其分辨率達(dá)到了1.28 ?，并從結(jié)構(gòu)角度揭示了NBPT能夠與脲酶活性位點(diǎn)中的鎳離子相互作用，進(jìn)行原位水解，生成一個(gè)四面體結(jié)構(gòu)的分子（MATP）阻斷活性位點(diǎn)（圖6）。Benini等［40］也通過(guò)X-ray獲得了苯基磷二酰胺（Phenylphosphorodiamidate，PPD）與巴氏芽孢桿菌脲酶相互作用的晶體結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)，在PPD作用下，巴氏芽孢桿菌脲酶活性中心與鎳離子相互作用的氨基酸殘基位置和天然狀態(tài)下沒(méi)有顯著差異，根據(jù)結(jié)構(gòu)顯示，實(shí)際與活性中心發(fā)生結(jié)合的不是PPD，而是其一種產(chǎn)物DAP，它是一個(gè)四面體分子。電子密度揭示了這個(gè)四面體形狀的分子精確地取代了天然巴氏芽孢桿菌脲酶中的4個(gè)水/氫氧根分子簇，通過(guò)3個(gè)原子與活性中心結(jié)合：一個(gè)對(duì)稱(chēng)地橋接兩個(gè)鎳離子，而另兩個(gè)分別與一個(gè)鎳離子結(jié)合。

1，4-苯醌、鄰苯二酚及一些重金屬離子及其衍生物對(duì)脲酶的抑制作用機(jī)制是金屬離子作用在活性中心周?chē)膄lap區(qū)域。有研究對(duì)1，4-苯醌抑制作用下的芽孢桿菌脲酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得到了分辨率為2.07 ? 的脲酶晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)1，4-苯醌共價(jià)結(jié)合脲酶flap區(qū)域的Cys322，阻礙flap區(qū)域的活動(dòng)，從而起到抑制脲酶活性的作用［50］，而鄰苯二酚的抑制機(jī)制與1，4-苯醌相類(lèi)似［51］。Mazzei等［55］獲得了分辨率為2.14 ? 的金離子（Au3+）抑制芽孢桿菌脲酶的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)Au3+與flap區(qū)域的Cys322、His323、Met367三個(gè)氨基酸殘基結(jié)合，兩個(gè)Au3+由Cys322連接起來(lái)，其中一個(gè)Au3+與His323結(jié)合，另一個(gè)Au3+與Met367結(jié)合，Cys322、His323能調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)活性中心空腔大小和催化相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基的位置，而Met367位于面對(duì)flap區(qū)域的一個(gè)loop環(huán)上，Au3+與這3個(gè)氨基酸殘基的結(jié)合阻礙了flap區(qū)域的活動(dòng)，從而抑制了脲酶的催化活性，晶體結(jié)構(gòu)分析也發(fā)現(xiàn)Au3+的存在對(duì)金屬離子所在的活性中心沒(méi)有顯著影響（圖7），而銀（Ag）的衍生物對(duì)芽孢桿菌脲酶的抑制機(jī)制同Au3+類(lèi)似［56］。

圖5 脲酶的催化機(jī)理［43］

5 總結(jié)

目前運(yùn)用晶體結(jié)構(gòu)學(xué)的手段已經(jīng)獲得了多種來(lái)源的細(xì)菌脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。雖然不同來(lái)源的脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的組成上存在差異，但是發(fā)生催化反應(yīng)的活性中心及周?chē)膄lap區(qū)域卻極為相似，底物與活性中心的鎳離子相互作用后被分解，而脲酶抑制劑可以通過(guò)與鎳離子或者flap區(qū)域相互作用來(lái)達(dá)到抑制脲酶活性的效果。雖然目前對(duì)于脲酶的研究已經(jīng)很多，但仍需要對(duì)以下幾個(gè)方面的問(wèn)題進(jìn)行探索。

一是組成脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的各個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)及功能的研究。目前很少有對(duì)不包含活性中心的各個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)的研究。另外，各個(gè)亞基彼此之間是通過(guò)什么樣的結(jié)合方式相互作用，而這種相互作用對(duì)于金屬離子傳遞進(jìn)入活性中心的意義是什么都需要深入研究。

圖6 MATP結(jié)合SPU活性位點(diǎn)的原子模型［54］

圖7 Au3+與芽孢桿菌脲酶相互作用［55］

二是對(duì)更多來(lái)源的細(xì)菌脲酶進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期對(duì)奶牛瘤胃微生物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物種類(lèi)繁多，微生物脲酶蛋白來(lái)源具有多樣性，有哪些微生物能產(chǎn)生脲酶呢，而這些脲酶基因是如何表達(dá)的，瘤胃微生物脲酶的結(jié)構(gòu)同已知的脲酶結(jié)構(gòu)上是否存在差異等問(wèn)題還未解決。對(duì)不同來(lái)源的微生物脲酶進(jìn)行定向的研究，更有利于對(duì)脲酶的活性進(jìn)行有效的調(diào)控。

三是基于脲酶晶體結(jié)構(gòu)開(kāi)發(fā)新型脲酶抑制劑。脲酶研究的最終目的是有效地調(diào)控它的活性，脲酶抑制劑的開(kāi)發(fā)依賴(lài)于脲酶結(jié)構(gòu)的解析。目前所得的脲酶結(jié)構(gòu)幾乎都是通過(guò)X-射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)得到的，運(yùn)用冷凍電鏡技術(shù)解析脲酶的結(jié)構(gòu)是否會(huì)有不同的發(fā)現(xiàn)呢，而新開(kāi)發(fā)的脲酶抑制劑如何進(jìn)行有效的生理評(píng)價(jià)等問(wèn)題尚待研究。