大豆種子蛋白質(zhì)組樣品制備與數(shù)據(jù)分析方法

牟永瑩 王道平 陳明 邱麗娟 潘映紅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081）

蛋白質(zhì)組是連接轉(zhuǎn)錄組與代謝組的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過研究不同時(shí)空的蛋白質(zhì)組構(gòu)成，可揭示各種復(fù)雜的生命活動過程。大豆（Glycine max）是一種在全球范圍內(nèi)廣泛種植的豆科植物，也是世界上產(chǎn)量最高的油料物。自2010年大豆品種Williams基因組測序完成后，蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)在大豆生長發(fā)育、逆境脅迫研究等多個(gè)方面得到廣泛應(yīng)用，目前已成為深入研究大豆育種和栽培分子基礎(chǔ)的有力工具［1-4］。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程主要包括樣品制備、質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)挖掘等步驟，其中，蛋白質(zhì)提取和酶切等樣品制備技術(shù)是決定后續(xù)質(zhì)譜分析重復(fù)性的關(guān)鍵因素之一，液相參數(shù)設(shè)置和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析方式也會對蛋白鑒定結(jié)果產(chǎn)生影響。盡管前人報(bào)道過一些大豆種子蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)工作［5-6］，但是仍缺乏對大豆種子蛋白質(zhì)組樣品制備和分析技術(shù)的系統(tǒng)研究。

林楊杰等［7］曾采用多種緩沖液進(jìn)行大豆種子蛋白初提和復(fù)提，并結(jié)合一維電泳預(yù)分離，可有效提高蛋白鑒定率，然而此方法處理步驟較繁瑣，且存在膠內(nèi)酶切過程中分子量大和疏水性強(qiáng)的肽段抽提難、酶解肽段回收率低的問題。為了提高樣品制備過程中蛋白提取與酶切的效率，Park等［8］針對強(qiáng)疏水性膜蛋白的酶解提出了熱變性方法，發(fā)現(xiàn)大豆種子蛋白樣品經(jīng)過熱變性處理后，蛋白質(zhì)更容易被酶解。除熱變性方法外，化學(xué)變性法也是廣泛使用的樣品處理方法。十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodeeysuzfate，SDS）是用于細(xì)胞、組織變性和增溶的首選試劑，但SDS在溶液中很難被完全去除，對后續(xù)酶切、色譜分離和質(zhì)譜分析有明顯影響，因此，開發(fā)替代方法尤為重要。林勇等［9］報(bào)道脫氧膽酸鈉（Sodiumdeoxyeholate，SDC）具有與SDS近似的變性作用，經(jīng)酸化處理和離心后可以從樣品中去除，在提高膜蛋白提取率的同時(shí)又不會明顯影響后續(xù)步驟。最近，Lys-C/trypsin順序酶切法也被用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，李倩等［10］利用該方法對培養(yǎng)的人細(xì)胞全蛋白樣本進(jìn)行酶解消化，肽段和蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)目均有顯著提高。

除樣品制備外，色譜分離和質(zhì)譜譜圖解析等對蛋白質(zhì)組分析結(jié)果也有明顯影響。在復(fù)雜蛋白分離過程中，任何梯度時(shí)間點(diǎn)上都可能存在大量同時(shí)洗脫的肽段，理想情況下，分析樣品中的所有肽都應(yīng)進(jìn)行MS/MS裂解，以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的完全覆蓋，然而質(zhì)譜儀的局限性和采集時(shí)間的限制導(dǎo)致大多數(shù)肽段在數(shù)據(jù)依賴采集中沒有被檢驗(yàn)，因此，提高多肽鑒定的一個(gè)途徑是在質(zhì)譜分析之前改進(jìn)肽段的液相色譜梯度分離［11-12］。Woehlbrand等［12］通過比較不同液相色譜梯度對海洋細(xì)菌蛋白質(zhì)組分析的影響，證明較長的梯度會增加鑒定的肽段和蛋白質(zhì)的數(shù)量以及結(jié)果的可重復(fù)性。受質(zhì)譜類型和經(jīng)費(fèi)的限制，一般情況下質(zhì)譜譜圖解析軟件的選擇余地較小，但有多種免費(fèi)蛋白數(shù)據(jù)庫可用于譜圖解析。對于植物材料，Phytozome、UniProt和NCBI這3種數(shù)據(jù)庫應(yīng)用較廣泛，Phytozome是一個(gè)專門比較植物基因組和基因家族的數(shù)據(jù)庫，可提供每種植物的序列、基因結(jié)構(gòu)、基因家族和基因組功能注釋［13］。UniProt是國際上廣泛使用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，主要包括UniProt知識庫（UniProtKB）、UniProt歸檔庫（UniParc）和UniProt參考序列集（UniRef）3部分，具有序列數(shù)據(jù)完整、資源廣泛的優(yōu)勢，為生命科學(xué)領(lǐng)域提供了寶貴資源［14］。NCBI是美國的一個(gè)大型生物信息學(xué)系統(tǒng)，擁有多種數(shù)據(jù)庫分析資源，是全球最有影響的生物學(xué)網(wǎng)站之一，可提供綜合的核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫［15］。這些數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)序列以及功能注釋信息的格式和更新速度各不相同，關(guān)于比較3種數(shù)據(jù)庫的大豆質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析結(jié)果的文章未見報(bào)道。

大豆種子蛋白質(zhì)組分析具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值，但大豆種子樣品制備中存在蛋白提取和酶切不徹底的問題，迫切需要優(yōu)化蛋白提取和酶切方法。液相分離時(shí)長可影響質(zhì)譜分析中可用的肽段檢出率，從而影響可識別蛋白的數(shù)量。而且目前可應(yīng)用的解譜數(shù)據(jù)庫種類較多，何種數(shù)據(jù)庫更適合大豆種子蛋白質(zhì)組分析也有待研究。

本研究擬以大豆種子為材料，通過改進(jìn)傳統(tǒng)的尿素硫脲蛋白提取液，選擇適合的酶切方法、液相梯度和數(shù)據(jù)庫，初步構(gòu)建一種適用于大豆種子蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析的技術(shù)體系，為深入的大豆蛋白組學(xué)研究創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 材料

中黃35和十勝長葉成熟大豆種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所大豆基因資源挖掘與利用課題組提供。

尿素（urea）、三羥甲基氨基甲烷（tris）購于美國昂飛（Affymetrix）公司；碘乙酰胺（IAA）、硫脲（thiourea）購于GE公司；胰蛋白酶（trypsin）、賴氨酸內(nèi)切酶（Lys-C）為Promega公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇（DTT）、乙腈（ACN）、甲酸購于賽默飛世爾科技（Thermo Fisher）；碳酸氫銨（ammonium bicarbonate）、乙二胺四乙酸（EDTA）、3-［（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸（CHAPS）購于Amresco公司。Easy-nano LC1000液相系統(tǒng)和Q-Exactive Plus質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司，Thermo Fisher）。

1.2 方法

對大豆種子蛋白質(zhì)組分析流程中的蛋白質(zhì)提取、酶切、液相質(zhì)譜分析和譜圖解析進(jìn)行優(yōu)化和比較（圖1）。

1.2.1 蛋白質(zhì)提取 常規(guī)尿素硫脲法（Urea thiourea extraction，UT）：將Natarajan等［16］與Wisniewski等［17］的方法結(jié)合用于大豆蛋白質(zhì)提取，具體步驟如下：首先取適量成熟大豆種子，在液氮中研磨至粉末，分別稱取50 mg種子粉置于2 mL的EP管中，加入0.3 mL 提取緩沖液（7 mol/L Urea、2 mol/L Thiourea、25 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L DTT和4%CHAPS），凍融3次后15 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液到10 K超濾管內(nèi)超濾離心（15 000 r/min，20 min，下同），樣品經(jīng)超濾管離心后加入100 μL現(xiàn)配碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAA）溶液（50 mmol/L IAA、8 mol/L Urea、100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.1）暗置30 min，離心，用100 μL尿素緩沖液（8 mol/L Urea，H2O）洗滌超濾3次，加200 μL 50 mmol/L碳酸氫氨洗滌超濾2次，獲得蛋白混合物待酶切。改進(jìn)的尿素硫脲法（Modified urea thiourea extraction，mUT）：為了提高蛋白提取效率，對尿素硫脲緩沖液進(jìn)行改進(jìn)，在原有的基礎(chǔ)上增加EDTA和NaCl成分，具體配置方法為8 mol/L Urea、2 mol/L Thiourea、25 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L DTT、4% CHAPS、2 mmol/L EDTA和200 mmol/L NaCl。還原和烷基化步驟同上。

1.2.2 蛋白酶切 常規(guī)胰蛋白酶切（Trypsin digestion，TD）：向超濾管的蛋白混合物中加1 μg酶，37℃反應(yīng)12 h，室溫，15 000 r/min離心30 min，收集超濾外管中的液體并轉(zhuǎn)移至上樣管中。高溫輔助酶切（High temperature assisted trypsin digestion，HTTD）：將超濾管置于100℃沸水中5 min，溫度降為室溫后加1 μg酶，37℃反應(yīng)12 h，離心、收集步驟同上。

賴氨酸C端內(nèi)切酶/胰蛋白酶順序酶切（Lys-C/trypsin digestion，Lys-C/TD）：蛋白混合物中加入Lys-C，37℃反應(yīng)2 h后，加入1 μg酶，剩余步驟同上。脫氧膽酸鈉輔助酶切法（Sodium deoxycholate assisted trypsin digestion，SDC-TD）：蛋白混合物溶解在0.4%SDC，再加1 μg酶，37℃反應(yīng)12 h后加10%TFA，離心去除SDC沉淀，取上清轉(zhuǎn)移至上樣管。

1.2.3 LC-MS分析和參數(shù)設(shè)置 使用基于質(zhì)譜的非標(biāo)記定量方法對大豆種子蛋白樣品進(jìn)行分析，液相為Easy-nLC 1000 nano液相系統(tǒng)，填裝C18 PepMap預(yù) 柱（100 μm×20 mm，Thermo Fisher Scientific）和C18 Tip色譜分析柱（75 μm×150 mm，Thermo Fisher Scientific）流動相A為0.1%FA，ddH2O；流動相B為0.1%FA，Acetonitrile。條件為流速420 nL/min。比較3種洗脫時(shí)間和梯度的分離效果：分別為30 min（0-22 min，0-35%；22-23 min，35%-100%；23-30 min，100%）、90 min（0-8 min，4%-5%；8-35 min，5%-9%；35-76 min，9%-18%；76-84 min，18%-31%；84-85 min，31%-100%；85-90 min，100%）和120 min（0-1 min，0-3%；1-4 min，3%-4%；4-24 min，4%-6%；24-104 min，6%-19%；104-109，19%-35%；109-110 min，35%-100%；110-120 min，100%），未涉及液相分離比較步驟時(shí)，液相色譜分離采用90 min梯度洗脫。試驗(yàn)所用質(zhì)譜儀為Orbitrap Q-Exactive，質(zhì)譜的采集模式為數(shù)據(jù)依賴采集（Data dependent acquisition，DDA），一級質(zhì)譜的分辨率為70 000，掃描范圍為300-1 800 m/z，自動增益控制值為3e6，注入時(shí)間為50 ms。二級質(zhì)譜的分辨率為17 500，自動增益控制值1e5，注入時(shí)間45 ms，碰撞能量27 NCE。二級采集的標(biāo)準(zhǔn)以前20個(gè)最強(qiáng)離子為母離子，再進(jìn)行Orbitrap檢測，每個(gè)樣品進(jìn)行3次質(zhì)譜技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)檢索軟件與數(shù)據(jù)庫 利用Proteome Discoverer 2.1（PD）定性分析軟件對質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。分別使用Phytozome、UniProt和NCBI大豆蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索（未涉及數(shù)據(jù)庫比較步驟時(shí)，定性分析僅使用UniProt數(shù)據(jù)庫）。搜索參數(shù)設(shè)定為：最多漏切位點(diǎn)為2、母離子質(zhì)量偏差為±20 ppm、固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化（Carbamidomethy/+57.021 Da）、可變修飾為甲硫氨酸（Met）氧化（Oxidation/+15.995 Da）和乙?；ǖ鞍譔端）。

1.2.5 分析技術(shù)體系優(yōu)化和驗(yàn)證 在比較大豆種子蛋白質(zhì)組提取、酶切、分離和解譜等技術(shù)方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建優(yōu)化的分析技術(shù)體系，并以大豆品種十勝長葉的成熟種子為材料進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)驗(yàn)證。選用UniProt數(shù)據(jù)庫解析質(zhì)譜譜圖，使用PD和Maxquant［18］軟件進(jìn)行定性和定量分析。

圖1 大豆種子蛋白質(zhì)組分析技術(shù)流程圖

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)提取方法比較

使用UT和mUT法提取等量中黃35大豆種子的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)兩者的蛋白質(zhì)數(shù)鑒定數(shù)和二級譜圖數(shù)差異不顯著，但mUT法得到的肽段鑒定數(shù)和肽段-譜圖匹配數(shù)均顯著高于UT法，且mUT法的各組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差均較UT法低（圖2-A）。UT法3次重復(fù)制樣平均鑒定到1 228組蛋白，其中共鑒定蛋白占62%，而mUT法3次制樣平均鑒定到1 334組蛋白，共鑒定蛋白占68%，共鑒定蛋白數(shù)目較UT法增加148組（圖2-B）。

圖2 UT法和mUT法提取大豆種子蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.2 蛋白酶切方法比較

分析4種酶切方法的酶解效率發(fā)現(xiàn)，使用Lys-C/TD法鑒定蛋白數(shù)目平均值為1 536組，顯著高于其他酶切方法，而SDC-TD和HT-TD法獲得的肽段和蛋白鑒定數(shù)目沒有顯著差異，但均比TD法顯著提高，蛋白鑒定數(shù)目最大差異約15%（圖3-A）。對各試驗(yàn)組中蛋白序列覆蓋度在20%-30%、30%-40%、＞40%區(qū)間的蛋白數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖3-B）。比較鑒定蛋白的肽段序列覆蓋率發(fā)現(xiàn)，在序列覆蓋率20%-30%和30%-40%區(qū)間，Lys-C/TD法所鑒定到的蛋白數(shù)顯著高于其他方法，在＞40%區(qū)間HT-TD法的鑒定蛋白數(shù)和重復(fù)性均較高（圖3-B）。進(jìn)一步分析顯示，使用Lys-C/TD法酶切時(shí)，蛋白漏切位點(diǎn)的比例約為25%，而其他方法的比例均大于33%（圖3-C）。

2.3 液相色譜分離效果比較

在液相洗脫梯度分別為30、90和120 min的色譜分離條件下，同等上樣量條件下的質(zhì)譜總離子流圖（TIC）如圖4所示，90和120 min梯度下總離子流的分布更均勻，液相色譜分離效果更好。質(zhì)譜鑒定結(jié)果（表1）顯示，90和120 min梯度相比，采用120 min梯度時(shí)，肽段-譜圖匹配數(shù)（PSMs）和二級圖譜鑒定數(shù)（MS/MS spectrum）較90 min梯度呈現(xiàn)倍數(shù)增長，肽段鑒定數(shù)雖有顯著差異卻未成倍增長，并且2種梯度下蛋白鑒定數(shù)無顯著差異。

圖3 TD、Lys-C/TD、SDC-TD和HT-TD 4種酶切方法的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖4 三種液相梯度分離蛋白的總離子流圖

表1 不同液相梯度時(shí)間蛋白分離效果比較

2.4 數(shù)據(jù)庫譜圖解析結(jié)果比較

以目前常用的3個(gè)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫Phytozome、UniProt和NCBI為背景庫，對用DDA模式采集的同批高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行譜圖解析，分別鑒定到1 971、1 990和1 958種大豆種子蛋白，其中，使用NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定到有功能注釋的蛋白最多，占其總鑒定蛋白數(shù)的76.66%，UniProt大豆數(shù)據(jù)庫得到有功能注釋蛋白所占的比例最小，僅占其總鑒定蛋白數(shù)的62.16%（表2）。

2.5 蛋白提取流程可靠性驗(yàn)證

在前述結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，選取mUT蛋白提取法、Lys/C-TD順序酶切法、90 min液相梯度和Uniport數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了大豆種子蛋白質(zhì)組分析技術(shù)體系。定性分析結(jié)果顯示，3次樣品制備重復(fù)試驗(yàn)共鑒定非冗余蛋白2 244組，單次最大鑒定量為6 946組肽段和1 631組蛋白，約60%的蛋白可被重復(fù)鑒定（圖5-A和圖5-B）。定量結(jié)果顯示，3次獨(dú)立樣品制備重復(fù)實(shí)驗(yàn)中肽段和蛋白的相關(guān)性均在70%以上，且相同信號強(qiáng)度內(nèi)定量的蛋白數(shù)目大致相同（圖5-C和圖5-D）。

表2 不同數(shù)據(jù)庫搜庫結(jié)果比較

圖5 十勝長葉質(zhì)譜定性定量分析結(jié)果

3 討論

3.1 使用改進(jìn)尿素硫脲提取法配合Lys-C/Trypsin順序酶切法可以顯著提高蛋白鑒定數(shù)目

蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備的第一步是蛋白提取，常用的大豆蛋白質(zhì)提取方法有尿素硫脲法和三氯乙酸（TCA）丙酮法［19-21］。林楊杰等［7］前期工作表明用尿素硫脲法初提大豆種子蛋白時(shí)，樣品蛋白得率最高，但是此方法在提取蛋白過程中加入丙酮沉淀蛋白去除雜質(zhì)，會導(dǎo)致部分樣品損失。為了解決這個(gè)問題，本研究參考過濾輔助樣品制備法（Filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP）［17］，使提取蛋白的除雜和酶切步驟均在超濾管內(nèi)完成。目前公認(rèn)利用超濾膜可以較有效地去除表面活性劑和更換蛋白裂解液，也可以分離酶切后的肽段，該方法具有操作簡單，樣品損失少，酶切后肽段純度高的優(yōu)勢［22］。除了蛋白提取方式外，本試驗(yàn)對蛋白提取液也進(jìn)行了改進(jìn)，增加了EDTA等成分。使用原始尿素硫脲法（UT）和改進(jìn)后的尿素硫脲法（mUT）的大豆種子蛋白提取結(jié)果如圖2所示，2種方法鑒定的蛋白數(shù)目雖無顯著差別，但是mUT法3次制樣重復(fù)的共有蛋白占的比列相對于UT法明顯增加，說明mUT法具有更好的重復(fù)性。這一結(jié)果或許與金屬螯合劑EDTA的加入相關(guān)，Jez等［23］研究表明EDTA可以去除緩沖液中存在的痕量重金屬離子。因此，在蛋白提取液中加入EDTA可以防止重金屬離子與蛋白質(zhì)形成不溶復(fù)合物，避免因復(fù)合物酶切不徹底對質(zhì)譜鑒定產(chǎn)生的影響，提高了質(zhì)譜鑒定結(jié)果的穩(wěn)定性。

酶切是影響樣品制備效果的另一個(gè)重要因素，大豆種子蛋白中存在一些結(jié)構(gòu)緊湊的難酶解蛋白，單獨(dú)使用胰蛋白酶酶切無法將其完全酶解，因此，需要通過一些物理和化學(xué)方法的輔助，破壞蛋白的緊湊結(jié)構(gòu)，從而提高蛋白的溶解性。本研究比較了單一胰蛋白酶切（TD）、賴氨酸C端內(nèi)切酶/胰蛋白酶順序酶切（Lys-C/TD）、脫氧膽酸鈉輔助酶切（SDC-TD）與高溫輔助酶切（HT-TD）4種方法的酶切效果。結(jié)果顯示，Lys-C/TD的蛋白鑒定數(shù)目顯著高于另3種方法，其中蛋白序列覆蓋度在20%-30%和30%-40%區(qū)間的蛋白增加較多，蛋白漏切位點(diǎn)數(shù)目低于其他方法。這與Betancourt等［24］和Hakobyan等［25］報(bào)道結(jié)果相符，Lys-C酶和Trypsin酶順序酶切可以顯著降低漏切位點(diǎn)的數(shù)目，提高序列覆蓋度在20%-40%的蛋白鑒定數(shù)目。SDC-TD法的蛋白鑒定數(shù)目高于TD法，漏切位點(diǎn)數(shù)目與TD相比無明顯差異。前人研究表明SDC在促進(jìn)蛋白的溶解和變性的同時(shí)，還具有增強(qiáng)胰蛋白活性的作用［26-27］，本研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。除此之外，本研究還表明SDC的加入對降低蛋白漏切位點(diǎn)無顯著作用。HT-TD與SDC-TD法的蛋白鑒定數(shù)目均高于TD法并且低于Lys-C/TD法，漏切位點(diǎn)也與SDCTD法和TD法無明顯差異，且序列覆蓋度在20%-40%區(qū)間的蛋白數(shù)目相對較少，＞40%區(qū)間蛋白數(shù)目比例提高，這與前人的研究結(jié)果類似［28］。

綜上所述，mUT蛋白提取方法具有更強(qiáng)的可重復(fù)性，Lys-C/TD、SDC-TD和HT-TD酶切法與TD法相比均可以提高蛋白鑒定數(shù)目，Lys-C/TD提升效果最佳而且可以降低漏切位點(diǎn)。因此，mUT配合Lys-C/TD可以顯著提高蛋白鑒定數(shù)目，更適用于大豆種子樣品制備。

3.2 適宜的液相梯度分離時(shí)間可以有效提高蛋白鑒定數(shù)目

液相對酶切肽段的分離時(shí)長和梯度決定了每個(gè)時(shí)間間隔可用于電離和質(zhì)譜分析的肽段數(shù)量。本研究確定大豆種子酶切肽段在梯度洗脫時(shí)間為30、90和120 min時(shí)的分離效果，結(jié)果表明，相對于30 min分離時(shí)長，90和120 min分離時(shí)長得到的離子峰分布更均勻，即肽段在不同梯度時(shí)間點(diǎn)上的分布更均勻，可減少因同一時(shí)間點(diǎn)洗脫肽段過于集中而造成的質(zhì)譜漏檢情況。蛋白鑒定結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，與30 min分離相比，采用90和120 min梯度分離后的肽段和蛋白鑒定率均顯著提高。Hsieh等［29］研究顯示液相色譜梯度長度增加主要通過增加樣品采集分析時(shí)間來影響肽的鑒定，將梯度長度從30 min增加到60或90 min會使MS/MS光譜數(shù)增加兩倍以上。增加梯度長度會使肽段鑒定數(shù)目增加，但是肽段提升程度不是線性變化的，而是會隨著梯度增加而逐漸減弱，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

雖然大量研究證明在液相質(zhì)譜分析中，梯度洗脫時(shí)間越長，肽段和蛋白的識別率越高［11，30-31］，但是增加梯度長度在提升肽段鑒定率的同時(shí)會降低樣品通量。因此，在設(shè)置液相色譜分離時(shí)間梯度時(shí)，需要結(jié)合蛋白特性，在保證樣品通量的前提下盡可能延長梯度時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)樣品的有效采集，提高蛋白鑒定率。

3.3 采用適宜的質(zhì)譜解析數(shù)據(jù)庫可以使后續(xù)數(shù)據(jù)分析更便捷

獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，要利用數(shù)據(jù)庫對譜圖進(jìn)行解析。目前，常用的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫有Phytozome、UniProt和NCBI，從表2得知，3個(gè)數(shù)據(jù)庫的大豆總蛋白條目數(shù)相近，而且蛋白質(zhì)定性結(jié)果顯示本研究鑒定到的大豆種子蛋白數(shù)目均接近2 000組，并無明顯差異，這表明對于大豆種子樣品，數(shù)據(jù)庫的選擇似乎對最終蛋白鑒定數(shù)目無顯著影響。但值得注意的是，不同的數(shù)據(jù)庫有各自的蛋白編號，對于UniProt和NCBI大豆數(shù)據(jù)庫的蛋白編號，PD軟件在定性時(shí)可同時(shí)進(jìn)行功能注釋，而Phytozome數(shù)據(jù)庫則需要使用其他軟件再次注釋。在后續(xù)分析過程中，我們也發(fā)現(xiàn)使用Phytozome數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出的蛋白編號需要通過序列比對轉(zhuǎn)換為可識別編號，給后續(xù)研究增加了一些無意義的工作量，而UniProt數(shù)據(jù)庫蛋白編號與多數(shù)生物信息學(xué)分析網(wǎng)站的兼容度最高，質(zhì)譜定性和定量解析時(shí)選擇UniProt數(shù)據(jù)庫可以使后續(xù)數(shù)據(jù)分析更便捷。

3.4 蛋白提取與分析流程的穩(wěn)定性分析

經(jīng)過對大豆種子蛋白提取與分析流程的比較優(yōu)化，提出了由mUT法和Lys-C/TD法提取和酶切，配合90 min色譜分離，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用UniPort數(shù)據(jù)庫解析的分析流程，并將其應(yīng)用于十勝長葉成熟種子蛋白質(zhì)組學(xué)分析中。結(jié)果顯示，3次樣品制備重復(fù)試驗(yàn)共鑒定非冗余蛋白2 244組，平均鑒定蛋白數(shù)量穩(wěn)定在1 628組，是Xu等［32］報(bào)道的使用雙向凝膠電泳方法檢測的2倍以上，但是蛋白定性鑒定重復(fù)率較低，僅約60%的蛋白可被重復(fù)鑒定到，進(jìn)一步的定量分析證實(shí)，重復(fù)制備樣品得到的定量蛋白Spearman系數(shù)水平均值為0.75，相關(guān)性較顯著，3次重復(fù)樣品中重復(fù)性差的蛋白信號強(qiáng)度主要分布在5E+08以下，而信號強(qiáng)度大于5E+08的蛋白數(shù)量很穩(wěn)定，這一現(xiàn)象可能與質(zhì)譜分析時(shí)采用數(shù)據(jù)依賴采集方式相關(guān)，高豐度蛋白更容易被檢測，因此出現(xiàn)的頻率更穩(wěn)定。總體而言，以上結(jié)果表明本蛋白質(zhì)組分析技術(shù)體系可以提高蛋白鑒定數(shù)目，具備一定的可靠性和穩(wěn)定性，更適用于大豆種子蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

4 結(jié)論

對于基于質(zhì)譜的大豆種子蛋白質(zhì)組學(xué)分析，采用改進(jìn)后的尿素硫脲提取液配合賴氨酸C端內(nèi)切酶/胰蛋白酶順序酶切法，經(jīng)90 min納升級液相梯度分離和Q Extractive質(zhì)譜分析，蛋白鑒定數(shù)目最高且定量重復(fù)性較好，研究還發(fā)現(xiàn)Phytozome、UniProt和NCBI數(shù)據(jù)庫的大豆蛋白總條目數(shù)相近，使用以上數(shù)據(jù)庫搜庫時(shí)，大豆種子蛋白定性鑒定數(shù)目均接近2 000組，并且使用UniProt數(shù)據(jù)庫可以使后續(xù)分析更便捷。