蛋白源生物質(zhì)的綠色生物轉(zhuǎn)化

梁昕鑫 唐丹 霍毅欣，2

（1. 北京理工大學(xué) 生命學(xué)院 分子醫(yī)學(xué)與生物診療工業(yè)和信息化部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2. 蘇州工業(yè)園區(qū)洛加大先進(jìn)技術(shù)研究院，蘇州 215123）

自全球工業(yè)化開始以來，人類主要以化石資源為原料生產(chǎn)燃料和大宗的精細(xì)化學(xué)品及藥物中間體。但隨著煤炭、石油、天然氣等化石能源的枯竭及溫室氣體排放等環(huán)境問題的日益凸顯，生物質(zhì)開始躋身第四大能源物質(zhì)，其作為原料主要用于新型植物源生物燃料及高級(jí)醇等清潔能源的生產(chǎn)，是一個(gè)非常有前景的新興領(lǐng)域［1-3］。以往各種生物燃料或化工產(chǎn)品能否進(jìn)入生產(chǎn)領(lǐng)域，主要取決于原有機(jī)體通過光合作用固定二氧化碳的效率及是否存在氮源的過度使用問題［4-6］。然而這些問題是相關(guān)聯(lián)的，具體表現(xiàn)在：（1）在所有傳統(tǒng)種植業(yè)中，固定二氧化碳所生產(chǎn)的糖或纖維素經(jīng)發(fā)酵后都會(huì)產(chǎn)生大量的菌體蛋白質(zhì)等副產(chǎn)物，如Pseudochlorellasp.，C.mexicana及C. pitschmannii利用碳水化合物發(fā)酵后，剩余蛋白達(dá)到總生物質(zhì)含量的85%［7］。2015年，僅美國生物乙醇產(chǎn)業(yè)就產(chǎn)生了超過4×107t的干酒糟（DDGS）［8］。研究顯示，如果使用木質(zhì)纖維素等生物質(zhì)為原料進(jìn)行生物燃料生產(chǎn)，每年將在全球范圍內(nèi)產(chǎn)生超過2×1011t廢棄物；一旦生物燃料在全球能源需求占比達(dá)到10%，每年將產(chǎn)生108t蛋白質(zhì)廢棄物［9］。目前這些蛋白質(zhì)廢棄物通常被用作動(dòng)物飼料，2010年據(jù)Wijffels等［10］估計(jì)，如果利用微藻生物質(zhì)為原料生產(chǎn)生物燃料，將產(chǎn)生超過3×108t的飼料原料等副產(chǎn)物，這大約是目前進(jìn)口到歐洲的大豆蛋白數(shù)量的40倍，故目前已經(jīng)趨于飽和的飼料市場可能無力容納快速擴(kuò)張的生物能源產(chǎn)業(yè)所帶來的增量；（2）在所有現(xiàn)行方案中，菌體蛋白中所含的氮都無法被循環(huán)利用，新興農(nóng)業(yè)生物質(zhì)的生產(chǎn)必須通過添加外源氮肥來補(bǔ)充氮素營養(yǎng)，而每年氮肥生產(chǎn)所耗費(fèi)的能源約為人類一次能源供應(yīng)的2.5%［11］；（3）蛋白飼料的應(yīng)用導(dǎo)致了大量氮素通過動(dòng)物糞便的形式流失到環(huán)境中，并被土壤微生物以氮氧化合物（NOx）的形式排放到空氣中［12］。氮氧化物（如N2O）是溫室氣體，其對環(huán)境的危害作用高出同等質(zhì)量的二氧化碳將近300倍，同時(shí)也是霧霾的重要組成成分［13］。如上所述，蛋白質(zhì)作為自然界含量豐富的大分子有機(jī)物，其降解產(chǎn)物氨基酸中含有合成能源分子、化學(xué)品或者藥物中間體所需的碳骨架以及微生物生長所需的氮元素。若對其分別加以利用，則能在保護(hù)環(huán)境的同時(shí)實(shí)現(xiàn)氮的循環(huán)和蛋白質(zhì)這類副產(chǎn)物的資源化利用。

長期以來，自然界為了最大化養(yǎng)分的利用效率，生物更傾向于蛋白質(zhì)的合成代謝而非分解代謝，所以存在蛋白水解產(chǎn)物脫氨這一技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)這一類豐富的資源物質(zhì)難以得到大規(guī)模開發(fā)利用。直到2011年，合成生物學(xué)領(lǐng)域的研究者首次通過在大腸桿菌中工程化改造氮代謝通路（外源引入轉(zhuǎn)氨和脫氨途徑），為脫氨反應(yīng)提供不可逆的代謝流，成功實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的脫氨，開創(chuàng)性地突破這一技術(shù)瓶頸［14］。在此研究基礎(chǔ)上，該領(lǐng)域?qū)W者相繼對蛋白源生物質(zhì)的挖掘利用展開了一系列研究。例如，2013年，研究者以甘氨酸為底物在酵母中實(shí)現(xiàn)丁醇和異丁醇的生產(chǎn)［15］。2014年，學(xué)者拓展了利用蛋白廢棄物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的底盤宿主，用代謝工程改造后的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)出產(chǎn)率達(dá)到18.9%的生物燃料和46.6%的氨［16］。至此，對蛋白質(zhì)的開發(fā)利用并未止步。2017年，有研究利用蛋白廢棄物的水解產(chǎn)物——氨基酸的脫氨反應(yīng)，生產(chǎn)出高達(dá)458 mg/L的氨（產(chǎn)率為47.8%）［17］。2019年，Ma等［18］則開拓性地利用枯草芽孢桿菌將咖啡渣和豆渣廢料（皆為蛋白質(zhì)廢棄物）轉(zhuǎn)化成生物醇，進(jìn)一步拓展了蛋白質(zhì)原料的來源。不久前，又有研究考察了由氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄機(jī)制驅(qū)動(dòng)的基于蛋白質(zhì)的生物精制過程，用補(bǔ)料分批發(fā)酵使得體系中異丁醇的產(chǎn)量最終達(dá)到4.78 g/L［18］。另外，有研究顯示耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica）可利用生物燃料廢棄物作為培養(yǎng)基生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和氨基酸［19］。以上研究都顯示出，蛋白廢棄物具備作為生產(chǎn)多種高附加值化合物原料的潛力和可行性（圖1），是當(dāng)下一直備受關(guān)注并快速發(fā)展的領(lǐng)域。有研究對蛋白廢棄物資源化生產(chǎn)的各種高值產(chǎn)品進(jìn)行估值，結(jié)果顯示，其轉(zhuǎn)化為散裝化學(xué)品的收益最高。每噸生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為散裝化學(xué)品大概估值7 000.3元，轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)如運(yùn)輸燃料估值1 400-2 800元、動(dòng)物飼料估值490-1 400元、電能估值420-1 050元［20］，故將種類繁多且數(shù)量巨大的蛋白質(zhì)廢棄物資源化利用具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義（表1）。

1 基于氨循環(huán)利用的蛋白源生物質(zhì)精煉方案

當(dāng)前的生物燃料生產(chǎn)是以環(huán)境中生物固定CO2產(chǎn)生的生物質(zhì)為原料，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化為燃料來推動(dòng)碳循環(huán)的流動(dòng)，未能實(shí)現(xiàn)能源的最優(yōu)化利用［8，22-24］。從生物燃料生產(chǎn)的全過程來看，最終產(chǎn)品僅集聚生物質(zhì)生長過程中的一部分化學(xué)能，能量回收率最高僅達(dá)42.44%［7］。除了該過程中的能量損耗，其他生物物質(zhì)如蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素等生物質(zhì)中含有的化學(xué)能并未得到全部轉(zhuǎn)化，這也是導(dǎo)致目前生物燃料行業(yè)利潤不佳的重要因素。此外，氮肥作為目前需求很大的化工產(chǎn)品之一（每年氮肥的化學(xué)合成達(dá)到1億t），基于Haber-Bosch工藝生產(chǎn)1 kg氮肥需要57 MJ能源，其能耗問題也是一大負(fù)擔(dān)［25-26］。以上問題都可以從以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的生物精煉方案中找到解決思路。

在以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的生物精煉方案中，蛋白質(zhì)經(jīng)水解產(chǎn)生的氨基酸通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)脫氨后得到碳骨架，繼而可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為生物燃料、化學(xué)品或醫(yī)藥中間體等［22］。該過程中脫掉的氨被植物或藻類等生長過程攝取，用于其生物量的增長，實(shí)現(xiàn)了氮循環(huán)流動(dòng)及對蛋白質(zhì)這類副產(chǎn)物的資源化利用［22］。該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展將充分利用藻類經(jīng)光合作用高效固碳的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，蛋白質(zhì)廢棄物的利用和氨的有效回收將有利于構(gòu)建碳氮平衡的生物地球化學(xué)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)資源的高效利用，具有生態(tài)友好性［25］。而且蛋白質(zhì)在快速生長的光合微生物和工業(yè)發(fā)酵殘留物中含量較高，因?yàn)槲廴镜墓夂衔⑸飳?shí)際上往往是生長較快的優(yōu)勢品種，相應(yīng)地其蛋白質(zhì)含量也較高，而蛋白正是我們可以利用的目標(biāo)產(chǎn)物；另外，一般也可以靠藻種自身的特性來進(jìn)行污染控制，如螺旋藻通過高pH值、杜氏鹽藻通過較高鹽度、小球藻通過快速生長控制污染，所以基本不用擔(dān)心污染問題。因此，利用蛋白質(zhì)作為原料可能會(huì)使菌體生長及CO2的固定速率最大化，整個(gè)循環(huán)體系的示意圖見圖2［27-30］。

圖1 生物質(zhì)精練主要過程及其下游產(chǎn)品（修改自文獻(xiàn)［21］）

表1 各種富含蛋白質(zhì)的生物質(zhì)殘留物中蛋白質(zhì)的含量、價(jià)格和潛在價(jià)值

2 蛋白源生物質(zhì)綠色高效生產(chǎn)高附加值化合物

蛋白質(zhì)是多種氨基酸通過肽鍵縮合而成的聚合物，故其徹底水解產(chǎn)物為氨基酸，表2列出了多種富含蛋白質(zhì)的生物質(zhì)廢棄物中各氨基酸的含量［21］。目前一些重要氨基酸已被生產(chǎn)并應(yīng)用（表3）［21］。然而，由于微生物體內(nèi)酶的化學(xué)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致其體內(nèi)的蛋白質(zhì)更傾向于合成代謝，而非分解代謝［22］，所以蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的脫氨反應(yīng)實(shí)際上是受到了熱力學(xué)可逆性和生物調(diào)節(jié)的雙重限制，這使得科研工作者積極地對相關(guān)的生物轉(zhuǎn)化途徑及其上下游工藝進(jìn)行代謝工程改造，以使微生物能夠更加高效合理地利用蛋白源生物質(zhì)，轉(zhuǎn)化生成生物燃料、大宗化學(xué)品以及藥物的中間體等。

圖2 基于氨循環(huán)利用的微藻蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生成異丁醇的示意圖

表2 富含蛋白質(zhì)的生物質(zhì)廢棄物經(jīng)酸性條件水解后測定的氨基酸組成（濕重%）

表3 重要氨基酸的生產(chǎn)及其應(yīng)用

2.1 在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)蛋白源生物質(zhì)高效綠色轉(zhuǎn)化

大腸桿菌自身具有用于高級(jí)醇生產(chǎn)的特殊代謝途徑和關(guān)鍵酶，故其可作為生產(chǎn)高級(jí)醇的理想宿主［32-33］。基于Ehrlich途徑，在大腸桿菌培養(yǎng)基中添加特定的酮酸可以表達(dá)相關(guān)的酶，從而催化相應(yīng)醇的生成。Ehrlich途徑的具體流程如下：氨基酸脫氨生成α-酮酸，酮酸脫羧生成醛，醛被還原生成醇。故氨基酸脫氨是通過Ehrlich途徑產(chǎn)高級(jí)醇的第一步，但在自然界中，為了最大化養(yǎng)分的利用效率，微生物傾向于以氨基酸為單元再次合成蛋白質(zhì)。為使工程菌株能夠?qū)我话被峄蛘叩鞍踪|(zhì)（代謝的混合物）定向轉(zhuǎn)化為某一種或幾種高附加值的生物產(chǎn)品，Huo等［14］在大腸桿菌中進(jìn)行了相關(guān)研究（圖3），具體如下：（1）構(gòu)建突變庫，確定氨基酸降解的相關(guān)調(diào)控蛋白并使之失活；（2）對分解反應(yīng)關(guān)鍵酶進(jìn)行定向進(jìn)化以獲得具有更高反應(yīng)速度及底物親和性的突變體，并將其整合入工程菌；（3）通過構(gòu)建氨泵使蛋白質(zhì)降解所脫掉的氨排出胞外；（4）構(gòu)建了高效的代謝通路將蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的碳骨架轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品；（5）通過構(gòu)建人工氨基轉(zhuǎn)移循環(huán)并將氨基酸的脫氨反應(yīng)與不可逆反應(yīng)偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)對所有氨基酸的不可逆脫氨。最終，實(shí)現(xiàn)了微生物發(fā)酵生產(chǎn)中氮元素的循環(huán)利用，結(jié)果顯示，在一個(gè)有酮酸途徑存在的菌株中，改造轉(zhuǎn)氨酶使其不可逆地釋放氨，阻斷群體感應(yīng)系統(tǒng)，使得工程菌株中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物脫氨生產(chǎn)生物燃料的產(chǎn)量達(dá)到理論產(chǎn)率的56%［14］。另外，大腸桿菌也可以將蘇氨酸脫氨生成2-氧代丁酸［34］，將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化生成肉桂酸［35］，將天冬氨酸的α-脫氨基以生產(chǎn)富馬酸/馬來酸［36］等重要化工產(chǎn)品。由上述研究結(jié)果可知，氨同化途徑失效和轉(zhuǎn)氨循環(huán)的改進(jìn)是阻止氨再攝取和驅(qū)動(dòng)脫氨的重要步驟［31，37］，也是實(shí)現(xiàn)蛋白源生物質(zhì)高效綠色轉(zhuǎn)化生成高附加值化合物的關(guān)鍵技術(shù)。

圖3 大腸桿菌中以氮為中心的代謝工程策略

如果綜合利用代謝動(dòng)力學(xué)和生物調(diào)節(jié)的信息，一些氨基酸可以直接脫氨基生成α-酮酸，然后可以通過具有廣泛底物特異性的α-酮酸脫羧酶轉(zhuǎn)化為醛等化合物，再通過醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為醇類；其他氨基酸可以脫氨基成為三羧酸循環(huán)的中間體（圖4），其可以通過糖異生途徑中的酶如蘋果酸酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶導(dǎo)向生成丙酮酸（一種主要的代謝中間體）。然后丙酮酸通過多種代謝途徑轉(zhuǎn)化成各種高級(jí)醇及化學(xué)品（圖5）。Choi等［38］利用代謝工程策略對大腸桿菌進(jìn)行改造，通過過表達(dá)ilvA（編碼抗反饋的蘇氨酸脫水酶）以及刪除逆代謝途徑上的基因（ilvI、ilvH、ilvB和ilvN），然后過表達(dá)cimA（檸檬酸合酶）和adhEmut（醇/醛脫氫酶突變體）將碳通量導(dǎo)向2-酮丁酸，2-酮丁酸再轉(zhuǎn)化為丙酸，之后生成1-丙醇，最終產(chǎn)量高于10 g/L。與之類似，Wang等［39］通過重新構(gòu)建并優(yōu)化D-1，2，4-丁三醇（BT）的生物合成途徑，使大腸桿菌利用高純度的D-木糖或玉米棒水解產(chǎn)物生成BT 的含量達(dá)到5.1 g/L BT。

圖4 與中心代謝相關(guān)的蛋白源氨基酸的分解代謝途徑（修改自文獻(xiàn)［40］）

2.2 其他底盤宿主利用蛋白源生物質(zhì)高效綠色生產(chǎn)

斯氏梭菌（Clostridium sticklandii）和其他梭狀桿菌屬胞內(nèi)含有可降解氨基酸的代表性途徑（Stickland反應(yīng)）和相關(guān)酶（輔酶B12依賴性氨基變位酶，含硒氧化還原酶和對氧極其敏感的2-羥脂酰-CoA脫水酶），可以用來生產(chǎn)生物燃料［41-43］。在該類菌屬中，C. sticklandiiDSM 519有成為綠色生物燃料高效生產(chǎn)的微生物細(xì)胞工廠的潛力，其能夠通過Stickland反應(yīng)分解氨基酸生成丙酮酸（一種主要的代謝中間體），從而進(jìn)一步發(fā)酵成乙醇/正丁醇及乙酸/正丁酸［44］。酵母則是工業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的發(fā)酵微生物之一，可以通過氮代謝阻遏效應(yīng)（NCR）的調(diào)節(jié)機(jī)制選擇性地利用底物［45］。例如，酵母以甘氨酸為底物經(jīng)脫氨基等一系列反應(yīng)后，系統(tǒng)中異丁醇和正丁醇的產(chǎn)量分別達(dá)到了58和92 mg/L［15］。膠紅類酵母菌（Rhodotorula glutinis）用L-苯丙氨酸為唯一碳源和氮源，發(fā)酵生產(chǎn)反式肉桂酸［46］。此外，纈氨酸在鏈霉菌中可轉(zhuǎn)化合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［47］，而在銅綠假單胞菌中可氧化脫氨生成2-氧代異戊酸［48］。Izaguirre等［49］將城市固體垃圾堆肥酶促水解后，從其有機(jī)部分中回收了多種游離氨基酸，回收率達(dá)76%，將其用作乳酸菌生長及生產(chǎn)乳酸的氮源，在發(fā)酵工業(yè)乳桿菌（Lactobacillus fermentumATCC 9338）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumNCIMB 8826）中達(dá)到的最大乳酸濃度分別為9.0±0.2 g/L和11.1±0.1 g/L。以上研究都對蛋白質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化利用提供了可行的思路。

圖5 以葡萄糖為基礎(chǔ)的生物質(zhì)衍生的工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)流程及合成途徑（修改自文獻(xiàn)［40］）

3 蛋白源生物質(zhì)的持續(xù)可獲得性

在以蛋白質(zhì)為前體的生物精煉過程中，蛋白質(zhì)的來源可以從短期和長期兩方面分析。短期而言，利用碳水化合物和脂類生產(chǎn)生物乙醇和生物柴油過程中會(huì)產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)廢棄物；長期來看，藻類以二氧化碳為唯一碳源進(jìn)行生長，且蛋白質(zhì)含量相對較高（表4），因此可以大規(guī)模種植微藻來生產(chǎn)蛋白質(zhì)，作為蛋白質(zhì)生物精煉的前體［10，50］。此外，由于光照幾率高、比表面積大和光合作用效能高，故微藻通過光合作用固定CO2的效率（6%-10%）較陸生植物（1%-2%）更高［51］。微生物利用藻類經(jīng)光合作用產(chǎn)生的蛋白質(zhì)來生產(chǎn)能源物質(zhì)，可有效降低目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)成本，促進(jìn)生產(chǎn)效率的提高和生產(chǎn)過程的可持續(xù)性［14，31，50，52］。另外，近年來，隨著合成生物學(xué)和代謝工程改造手段的發(fā)展，嗜鹽微生物的全基因組序列和分析信息日漸豐富，對其改造更具有靶向性，將有可能實(shí)現(xiàn)利用海水等非飲用水進(jìn)行多種高級(jí)醇的生產(chǎn)，可以降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的競爭性。

表4 藻類各組分及含量比例（干重百分比）

4 蛋白源生物質(zhì)綠色轉(zhuǎn)化中技術(shù)優(yōu)化面對的挑戰(zhàn)與策略

上述基于氨循環(huán)利用的方案將為實(shí)現(xiàn)氨基酸的生物轉(zhuǎn)化提供更多的理論基礎(chǔ)，也對現(xiàn)有優(yōu)化技術(shù)提出挑戰(zhàn)。結(jié)合多項(xiàng)組學(xué)的數(shù)據(jù)集分析可以對微生物細(xì)胞的潛在特征進(jìn)行檢測，有助于對其功能背后機(jī)制的解讀。在工程設(shè)計(jì)微生物過程中，引入DNA溯源技術(shù)和高通量篩選，是蛋白質(zhì)高效綠色轉(zhuǎn)化的有效策略［53］。Li等［54］研究了在白酒發(fā)酵中特異性地將氨基酸轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇所涉及到的基因和酶，其中LEU1編碼α-異丙基蘋果酸脫氫酶，LEU2編碼β-異丙基蘋果酸脫氫酶和ILV1編碼蘇氨酸脫氨酶。ILV1雙等位基因缺失的二倍體突變體分別使異丁醇、異戊醇和正丙醇的產(chǎn)量增加326.4%，57.6%和14.09%。此外，通過使用碳通量和氮通量修飾等工程化策略，還可以提高其他多種化合物的產(chǎn)量［33，37，55-59］（圖6）。

圖6 提升高級(jí)醇的產(chǎn)量的工程化策略

以微藻生物質(zhì)為例，對微生物進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵和酯交換生產(chǎn)燃料的整個(gè)過程中的碳氮通量進(jìn)行計(jì)算。微藻蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化過程中，會(huì)生成副產(chǎn)物——氨?；谟?jì)算結(jié)果，構(gòu)建了重新施用氨的工藝流程，如圖7所示。如果種植富含蛋白質(zhì)微藻的開放池塘的尺寸為24 600 km，在生物質(zhì)生長之后，對收集的原料蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，每年可產(chǎn)生1.360億t高級(jí)醇（600億gal的生物燃料）［60］?；谇笆龅奈⒃搴痛x工程細(xì)菌結(jié)合的生物燃料生產(chǎn)方案［14］，每年的微藻蛋白可產(chǎn)生97.5萬t生物燃料和5 480萬t氨［27］。

通過使用高效節(jié)能的預(yù)處理，可以解決生物質(zhì)因其各種生理特性（包括細(xì)胞壁厚度和生物成分含量）導(dǎo)致的利用受限問題。對微藻生物質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理，可以獲得良好的能量轉(zhuǎn)化和生物燃料產(chǎn)量。Ha等［7］使用綠藻假單胞菌（Pseudochlorellasp.）對微藻生物質(zhì)進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵和酯交換處理，獲得0.45 g生物乙醇/g碳水化合物、0.44 g高級(jí)醇/g蛋白質(zhì)和0.55 g生物柴油/g脂質(zhì)，碳水化合物和蛋白質(zhì)的發(fā)酵效率為86%和72%，總能量回收率為42.44%［43］。

5 展望

圖7 重新施用氨的工藝流程圖

生物燃料的高效生產(chǎn)對我國增加能源供應(yīng)、推進(jìn)環(huán)境保護(hù)意義重大。通過底物生產(chǎn)過程中氨的循環(huán)利用，可以從源頭解除過量氮排放對空氣和飲用水安全造成的威脅。生物將大氣中的N2固定后轉(zhuǎn)化為NH3或者銨鹽，通過同化作用進(jìn)一步合成氨基酸和其他含氮化合物，或者通過硝化細(xì)菌的硝化作用生成亞硝酸鹽及硝酸鹽；在厭氧條件下，硝酸鹽又能經(jīng)反硝化作用分解成為N2進(jìn)入大氣，實(shí)現(xiàn)氨的自然循環(huán)。然而，現(xiàn)代社會(huì)發(fā)展中，人類大量使用化石能源，直接將空氣中大量的N2直接轉(zhuǎn)化為氮肥，工業(yè)固氮水平（＞100 Tg/a，Tg，1 012 g）與地球上的自然固氮水平基本（130-450 Tg/a）相近，這極大破壞了氮素的自然循環(huán)體系［27］。此外，人類活動(dòng)使得未經(jīng)處理的富含N、P的生活廢水大量排進(jìn)水體，造成全球水體富營養(yǎng)化，藻類大量繁殖，致使水華大范圍爆發(fā)，人類的飲用水安全面臨前所未有的嚴(yán)重威脅［61］。因此，實(shí)現(xiàn)NH3在能源物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)中的循環(huán)利用，能夠改善大氣的富氨狀態(tài)，緩解水體富營養(yǎng)化，進(jìn)而從根本上解除主要空氣污染以及藍(lán)藻水華對飲用水安全造成的威脅。

目前對生物燃料生產(chǎn)菌株的改造策略主要集中于碳代謝流，經(jīng)改造的酵母和細(xì)菌菌株已經(jīng)成功用于乙醇的生產(chǎn)。但以氮為中心進(jìn)行的代謝工程改造，其利用蛋白質(zhì)為原料進(jìn)行生物精細(xì)化的可行性也得到了相關(guān)研究的支持［14，62］。然而大批量蛋白質(zhì)的獲得仍然是一個(gè)待解決的問題，在此，微藻可作為大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的重要來源，因其具有以下特點(diǎn)：第一，藻類生產(chǎn)的蛋白質(zhì)是其固碳相關(guān)酶的來源。油脂是微藻儲(chǔ)能物質(zhì)，其含量的積累和生物量的增加呈負(fù)相關(guān)，而生物量和蛋白質(zhì)的增加無須脂類積累過程中必要的饑餓條件。因此，蛋白質(zhì)含量豐富的藻種可以在快速固定CO2的狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)生物量的高效積累，使得用于微生物能源生產(chǎn)的底物（蛋白質(zhì)）的產(chǎn)率和總量得到增加。第二，蛋白質(zhì)含量豐富的微藻的快速生長有利于開放式培養(yǎng)系統(tǒng)的應(yīng)用。與蛋白質(zhì)含量較低的微藻以及其他陸生作物相比，快速生長的微藻具有生長優(yōu)勢，可以最大化二氧化碳的固定效率［10，29，50，63］。此外，廢棄物處理和發(fā)酵工業(yè)中的蛋白質(zhì)生物質(zhì)也作為長期、可持續(xù)的蛋白質(zhì)來源，避開昂貴的光生物反應(yīng)器的需求或木質(zhì)纖維素的頑固性問題［64-66］。回收的氨可用于未來的蛋白質(zhì)生產(chǎn)、傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)栽培或其他化學(xué)品的生產(chǎn)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源過程中生成的氨，也使資源分配在一定程度上擺脫生長繁殖及生存維持的限制，利于構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠［22］。然而，目前仍有一些挑戰(zhàn)有待突破，包括藻類大規(guī)模生產(chǎn)、收獲、產(chǎn)品凈化和硝基回收等過程中存在的問題（表5）。此外，隨著代謝網(wǎng)絡(luò)智能改造、異源重組表達(dá)和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化技術(shù)進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用，也給微生物工廠帶來新的挑戰(zhàn)［67］。采用基因編輯技術(shù)、代謝途徑組裝技術(shù)及發(fā)酵過程優(yōu)化技術(shù)等方法對微生物細(xì)胞內(nèi)氮代謝的層級(jí)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行改造（圖8），為進(jìn)一步闡明氨代謝的調(diào)控機(jī)理提供參考。可以想象，利用蛋白質(zhì)作為生物精細(xì)化原料的潛在優(yōu)勢可能會(huì)刺激這一方向的發(fā)展。

圖8 氮同化過程

表5 微藻生物能源工業(yè)化生產(chǎn)概況一覽表

能源危機(jī)以及環(huán)境問題一直是社會(huì)各界關(guān)注的重點(diǎn)，基于氮平衡的二氧化碳微生物轉(zhuǎn)化給出了有效的解決方案，但微生物細(xì)胞工廠利用氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)高值化學(xué)品的生物轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟(jì)可行性取決于大規(guī)模生產(chǎn)力和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。高能量密度的生物燃料可提高發(fā)動(dòng)機(jī)效率，因此獲得最佳性能只需要更少的燃料［22］。對遺傳改良、生物精煉以及從各種生物質(zhì)中大規(guī)模生產(chǎn)高級(jí)醇的進(jìn)一步研究，將促使這一進(jìn)程盡早落地，實(shí)現(xiàn)商業(yè)化［68］?；谀Ｊ缴锎竽c桿菌進(jìn)行的改造仍是未來的研究方向，利用大腸桿菌自身修復(fù)系統(tǒng)和抗逆機(jī)制，通過合成生物學(xué)技術(shù)對菌株和途徑進(jìn)行改造，從而得到抗逆性強(qiáng)的大腸桿菌菌株，以應(yīng)用于高值產(chǎn)物的生產(chǎn)。另外，合理的代謝設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化兩者之間的協(xié)同作用，也有助于優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)，推動(dòng)可持續(xù)性能源的發(fā)展。