高效液相-蒸發(fā)光散射法檢測氟［18F］脫氧葡糖注射液中2-氯-2-脫氧-D葡萄糖含量

張強(qiáng)，謝新民，周

（1.中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510010；2.中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院正電子藥物中心，廣東廣州510010）

高效液相-蒸發(fā)光散射法檢測氟［18F］脫氧葡糖注射液中2-氯-2-脫氧-D葡萄糖含量

張強(qiáng)1，謝新民1，周2

（1.中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510010；2.中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院正電子藥物中心，廣東廣州510010）

目的建立測定氟［18F］脫氧葡糖注射液中2-氯-2-脫氧-D葡萄糖（CLDG）含量的高效液相-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法。方法色譜柱為SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 m），流動相為甲醇-0.1%三氟乙酸（10∶90），流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為10 L；Sedex 85型低溫型蒸發(fā)光散射檢測器，載氣（N2）壓力為3.0 bar，檢測池溫度為40℃，gain值為10。結(jié)果CLDG質(zhì)量濃度在5.06～135.00 g/mL范圍內(nèi)與峰面積同時取對數(shù)后呈良好線性關(guān)系，R2=0.999 0，檢測限為2 g/mL，定量限為5.0 g/mL。結(jié)論該方法簡便、快速，適用于氟［18F］脫氧葡糖注射液生產(chǎn)中的常規(guī)質(zhì)量控制。

高效液相-蒸發(fā)光散射法；2-氯-2-脫氧-D葡萄糖；氟［18F］脫氧葡糖注射液

氟［18F］脫氧葡糖（［18F］-FDG）注射液的放射性核素半衰期很短，僅120 min，屬短壽命的正電子放射性藥物，且所含雜質(zhì)極其微量，通常相當(dāng)于納摩爾量級，迫使用于化學(xué)雜質(zhì)檢查的方法需要快速且有更低的檢測下限，以及專門的安全性評價、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制措施［1-6］。2015年版《中國藥典（二部）》開始收載氟［18F］脫氧葡糖注射液，在其檢查項下對合成催化劑氨基聚醚（KryPtofixTM2.2.2）作了限量規(guī)定，但未對合成中酸水解引入的2-氯-2-脫氧-D葡萄糖（CLDG）作限量要求［7］。目前，CLDG尚無半數(shù)致死量（LD50）數(shù)據(jù)［8］，但《美國藥典》（USP）明確規(guī)定CLDG應(yīng)小于1.0 mg/dose，并推薦高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（HPAEC-PAD）。Nakao等［9］報道，可采用柱前衍生和高效液相色譜-紫外光譜（HPLC-UV）法，在210 nm波長處對CLDG進(jìn)行測定。袁艷娟等［10］報道，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）檢測氟［18F］脫氧葡糖注射液中的CLDG含量。MS和PAD檢測器昂貴，維護(hù)保養(yǎng)要求高。柱前衍生操作步驟煩瑣，均不利于氟［18F］脫氧葡糖注射液的快速常規(guī)質(zhì)量分析，而價格相對低廉的低溫型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）作為一種通用型質(zhì)量檢測器，越來越多地被運用在無紫外吸收和紫外末端吸收物質(zhì)的常規(guī)分析中［11-12］。有研究已成功應(yīng)用HPLC-ELSD法對氟［18F］脫氧葡糖注射液中的氨基聚醚進(jìn)行了測定［13］。在此基礎(chǔ)上，筆者采用HPLCELSD法測定氟［18F］脫氧葡糖注射液中CLDG的含量，旨在為應(yīng)用該方法同時測定氟［18F］脫氧葡糖注射液中的氨基聚醚和CLDG含量提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1　儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（包括G1313A型高壓二元泵，G1313A型自動進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，安捷倫科技公司）；Sedex 85型低溫型蒸發(fā)光散射檢測器（迪馬科技有限公司）；Agilent A.09.01型化學(xué)工作站（安捷倫科技公司）。2-氯-2-脫氧-D葡萄糖對照品（Sigma公司）；甲醇為色譜純（Merck公司），三氟乙酸為分析純，水為重蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-0.1%三氟乙酸（10∶90）；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；N2壓力：3.0 bar；檢測池溫度：40℃；gain值：10；柱溫：25℃。

2.2溶液制備

對照品溶液：精密稱取CLDG對照品0.005 05 g，置容量瓶中，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為1.010 0 g/L的貯備液，置4℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

樣品溶液：［18F］-FDG注射液（批號分別為20160311，20160322，20160330），在廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院正電子藥物中心，使用SiemensExploraFDG4裝置合成。2.3方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性與檢測靈敏度試驗：取對照品貯備液，用乙腈逐級稀釋，在擬訂色譜條件下試驗，CLDG的保留時間為3.41 min，其色譜圖見圖2。按信噪比（S/N）=3計算，得CLDG最小檢測限約為2.0 μg/mL，定量限為5.0 μg/mL。

線性關(guān)系考察：精密量取CLDG貯備液，用乙腈依次稀釋成質(zhì)量濃度為135.00，67.50，33.75，16.88，5.06 μg/mL的梯度溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣試驗，記錄CLDG色譜峰面積。結(jié)果表明，CLDG質(zhì)量濃度在5.06～135.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，兩者在取對數(shù)后呈線性關(guān)系，線性方程為Y=0.882+ 1.461 X，R2=0.999 0。

精密度和準(zhǔn)確度試驗：線性關(guān)系考察中取5個濃度梯度的CLDG對照品溶液，在擬訂色譜條件下試驗，每個濃度重復(fù)測定5次，連續(xù)測定3 d。分別用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和相對誤差（RE）計算日內(nèi)和日間的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1。

2.4樣品含量測定

等滲調(diào)節(jié)劑氯化鈉會干擾上述色譜條件下氟［18F］脫氧葡糖注射液中CLDG的測定，故樣品測定應(yīng)在調(diào)節(jié)注射液等滲前。結(jié)果，3個批次的氟［18F］脫氧葡糖注射液中CLDG含量均小于2 μg/mL。

圖2　氟［18F］脫氧葡糖注射液和CLDG色譜圖

3　討論

HPLC-ELSD法要求流動相組分在檢測時先被加熱蒸發(fā)，而后不揮發(fā)的溶質(zhì)顆粒通過光散射池時產(chǎn)生的電信號被光傳感器測定［14］。CLDG的極性較大，故采用無極性的C18分析柱，極性溶劑和揮發(fā)性的酸性離子對試劑組成的流動相是最適合的HPLC-ELSD色譜條件。試驗中對有機(jī)溶劑（甲醇，乙腈）和揮發(fā)性的離子對試劑（甲酸，乙酸，三氟乙酸，七氟丁酸）進(jìn)行了對比，選擇甲醇-0.1%三氟乙酸作為流動相，通過調(diào)整比例和流速，使CLDG達(dá)到基線分離。

氟［18F］脫氧葡糖注射液制備過程中，使用鹽酸對氟［18F］脫氧葡糖前體進(jìn)行水解，引入的氯離子及水解純化后調(diào)節(jié)等滲的氯化鈉均會干擾該試驗方法下CLDG的測定，水解引入的副產(chǎn)物可通過氟［18F］脫氧葡糖注射液合成裝置（Siemens Explora FDG4）中的AG11A8離子交換樹脂柱（Waters公司）除去。

表1　日內(nèi)和日間精密度的RSD及RE

本試驗中選擇HPLC-ELSD方法檢測氟［18F］脫氧葡糖注射液中CLDG的含量，靈敏度高，簡便快速，適用于生產(chǎn)過程的快速質(zhì)量控制，符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）對過程控制的理念。

［1］Subcommittee on Medical Application of Cyclotron-Produced Radionuclides，Medical Science and Pharmaceutical Committee，Japan Radioisotope Association.Standard for compounds labeled with positron nuclides approved as established techniques for medicaluse（2001revision）［J］.Radioisotopes，2001，50（15）：190-204.

［2］Honkomagome，Bunkyoaku.Description of the“Established Standard Techniques of Labeling Compounds with Positron Nuclides for use as radiopharmaceuticals：Approved by the Subcommittee on MedicalApplicationofCyclotron-ProducedRadionuclides（revision in 2001）”［J］.Radioisotopes，2001，50（5）：1-23.

［3］FDA，HHS.Current Good Manufacturing For Positron Emission Tomography Drugs［J］.Federal Register，2009，74（236）：65 409.

［4］Aerts J，Ballinger JR，Behe M，et al.Guidance on current good radiopharmacy practice for the small-scale preparation of radiophamaceuticalsusingautomatedmodules：aEuropeanperspective［J］. J Labelled Comp Radiopharm，2014，57（10）：615-620.

［5］Natesan R，Van So Le，Hyon-soo H，et al.Guidelines for Good Manufacturing Practices of Radiopharmaceuticals［M］.Korea：The Korea Atomic Energy Research Institute，2001：55-77.

［6］Guideline for Quality Assurance and Quality Control of18F-FDG（2-deoxy-2-fluoro-d-glucose）［EB/OL］.［2011-03-18］. http：//www.fnca.mext.go.jp/english/pet/guideline_2.pdf.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1 599-1 600.

［8］Hung JC.Comparison of Various Requirements of the Quality Assurance Procedures for18F-FDG Injection［J］.J Nucl Med，2002，43（11）：1 495-1 506.

［9］Nakao R，Ito T，Yamaguchi M，et al.Simultaneous analysis of FDG，ClDG and Kryptofix 2.2.2 in［18F］-FDG preparation by high-performance liquid chromatography with UV detection［J］. Nucl Med Biol，2008，35（2）：239-244.

［10］袁艷娟，劉晶，何學(xué)軍，等.HPLC-MS法檢測氟［18F］脫氧葡糖注射液中2-氯-2-脫氧-D葡萄糖（ClDG）的含量［J］.分析實驗室，2012，31（5）：93-95.

［11］Dreux M，Lafosse M，Morin-Allory L.The Evaporative Light-Scattering Detector-A Universal Instrument for Non-Volatile Solutes in LC and SFC［J］.LCGC International，1996，9（3）：148-153.

［12］Sims JL.Proposed Performance Qualification and Calibration Method for Evaporative Light-Scattering Detector［J］.Chromatographia，2001，53（7）：401-404.

［13］Deng WJ，Zhang XN，Sun ZP，et al.HPLC-ELSD Determination of Kryptofix 2.2.2 in the Preparations of 2-Deoxy-2-［18F］fluoro-D-glucose and other radiopharmaceuticals［J］.Chromatographia，2012，75（11）：629-633.

［14］張悅晗，甄漢深，成莉.蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）應(yīng)用概況［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（4）：831-833.

Content Determination of the Concentration of CLDG in［18F］-FDG by HPLC-ELSD

Zhang Qiang1，Xie Xinmin1，Zhou Zheng2
（1.DepartmentofPharmacy，GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand，Guangzhou，Guangdong，China510010；2.Positron Medicine Center，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou，Guangdong，China510010）

ObjectiveTo establish an HPLC-ELSD method to determine the concentration of CLDG in［18F］-FDG.M ethodsThe C18column was used and the mobile phase was methanol-0.1%TFA（10∶90）at a flow rate of 0.2 mL/min.The auto-injection volume was set to 10 μL.The pressure of nebulizing gas（N2）was 3.0 bar.The drift tube temperature was 40℃.The gain was 10.Results Excellent linearity（R2=0.999 0）was obtained over the range of 5.06-135.00 μg/mL.The limit of detection was 2 μg/mL，and the quantification limit was 5.0 μg/mL.ConclusionThis method simple，rapid，quantitative and sensitive detection of CLDG in［18F］-FDG thus making it amenable to routine quality assurance testing.

HPLC-ELSD；CLDG；［18F］-FDG

R927.1；R979.1

A

1006-4931（2016）12-0069-03

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目，項目編號：A2014493。

（2016-01-06；

2016-02-09）