高效液相色譜法測(cè)定竹葉提取物中的14種酚酸類(lèi)化合物

王智聰　沙躍兵　余笑波

摘 要：該研究建立了原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷等14種酚酸類(lèi)化合物同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜方法。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm），采用甲醇-水（含0.1%甲酸）流動(dòng)相體系，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm和324nm。結(jié)果顯示，14種酚酸類(lèi)化合物在0.250～50.0 μg/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99；方法精密度良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于7.7%。表明該方法可用于竹葉提取物中酚酸類(lèi)化合物含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：酚酸類(lèi)化合物；竹葉提取物；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào) TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）16-0109-05

Abstract：A simple method was developed in this paper for simultaneous determination of 14 phenolic acids by high pressure liquid chromatography，the compounds includes protocatechuic aicd，gentisic aicd，m-hydroxybenzoic aicd，chlorogenic acid，vanillic acid，caffic acid，syringic acid，p-coumaric acid，terulic acid，sinapic acid，homoorientin，orientin，vitexin and isovitexin. The samples were separated by Agilent ZORBAX SB-C18 column（5μm，4.6×250mm）using methanol and 0.1% formic acid aqueous solution as mobile phases by gradient elution under 274nm and 324nm for different compound.The results showed that there are good linear ranges with 0.250～50.0μg/mL，good correlation coefficients（r2）with greater than 0.99，and good precisions with less than 7.7% of relative standard deviations for all 14 phenolic acids.The method can be used for phenolic acids determination for bamboo extract samples.

Key words：Phenolic acids；Bamboo extract；High pressure liquid chromatography

竹葉提取物又稱(chēng)竹葉抗氧化物，是一種新型的植物提取制劑。竹葉抗氧化物作為天然抗氧化劑已被列入到我國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760）中，允許在食用油脂、肉制品、水產(chǎn)品、膨化食品、油炸食品、焙烤食品、即食谷物及果蔬汁飲料和茶飲料等幾大類(lèi)食品中使用。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑竹葉抗氧化物》（GB30615）已在2014年11月1日起實(shí)施。

竹葉提取物具有優(yōu)良的抗氧化、抗自由基、抗疲勞、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂和增強(qiáng)免疫等作用[1-5]。龔金炎等[6]采用液相色譜法測(cè)定了竹葉抗氧化劑中綠原酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷等8種酚酸類(lèi)化合物的含量。基于竹葉提取物具有良好的抗氧化等藥理功效，有必要對(duì)其活性成分進(jìn)行系統(tǒng)的研究，尤其是酚酸類(lèi)化合物在竹葉提取物中的存在形式及分布特征等進(jìn)行系統(tǒng)的研究。但文獻(xiàn)中鮮有竹葉中其他種類(lèi)的酚酸類(lèi)化合物測(cè)定的報(bào)道，本研究在上述8種酚酸類(lèi)化合物的基礎(chǔ)上，建立了竹葉提取物中14種酚酸類(lèi)化合物含量測(cè)定的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Aliance e2695高效液相色譜，配光電二極管陣列檢測(cè)器和Empower 3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；AG285精密電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；5810R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；KQ-100DE數(shù)控超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。甲醇（色譜純）購(gòu)自德國(guó)Merck公司；甲酸（分析純）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸和芥子酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司；竹葉（金剛竹）采自當(dāng)?shù)?；竹葉抗氧化劑（1#）樣品購(gòu)自浙江圣氏生物科技有限公司；竹葉抗氧化劑（2#）樣品由浙江大學(xué)張英課題組提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 分別稱(chēng)取適量原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品，加適量甲醇漩渦震蕩、超聲溶解，配制濃度均為2.00mg/mL的母液；再用超純水序列稀釋?zhuān)渲茲舛确謩e為0.250、0.350、0.500、0.750、1.00、2.50、5.00、10.0、25.0、50.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 竹葉樣品的提取 采摘新鮮竹葉適量，用自來(lái)水清洗泥污，再用超純水沖洗數(shù)次，瀝干，置于40℃烘箱干燥過(guò)夜；取出分揀，丟棄干枯枝葉，去枝除梗；將干燥竹葉置于粉碎機(jī)打碎，干燥保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取適量干燥粉碎后的竹葉樣品，按照1∶20的料液比，加入60%的甲醇溶液，超聲提取30min，取出于4 000r離心10min，倒出上清液；殘?jiān)侔凑丈鲜龇椒ㄌ崛?次；合并上清液，混勻，用超純水稀釋2倍后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 竹葉抗氧化劑樣品的配制 稱(chēng)取適量竹葉抗氧化劑樣品，加入適量甲醇，配制濃度為10mg/mL的溶液；并于4 000r離心10min，吸出上清液，用超純水稀釋4倍后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 色譜分析條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm）；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；流動(dòng)相A：含0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫：5%B（1min）～12%B（3min）～15%B（13min）～19%B（15min）～21%B（25min）～26%B（26min）～29%B（32min）～30%B（45min）～45%B（55min）～98%B（56min）～98%B（60min）～5%B（61min）～5%B（65min）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：274/324nm；進(jìn)樣體積：10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化 植物提取物成分復(fù)雜，既有極性較大的糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)和酚酸類(lèi)等，又有極性較小的黃酮類(lèi)和葉綠素等化合物，為了有效地進(jìn)行組分的分離，應(yīng)當(dāng)選擇較長(zhǎng)的色譜柱[7-11]，實(shí)驗(yàn)中采用柱長(zhǎng)為250mm的色譜柱，各組分得到了較好的分離。在流動(dòng)相中添加酸性添加劑，可以調(diào)節(jié)酚酸類(lèi)化合物的解離，添加0.1%的甲酸有效地抑制了酸性化合物的解離，從而提酚酸類(lèi)高化合物在反相色譜的保留能力，色譜峰型也較好。14種酚酸類(lèi)化合物中以羥基苯甲酸為母核的酚酸類(lèi)化合物在250～290nm有最大吸收，而以羥基肉桂酸為母核的酚酸類(lèi)化合物及綠原酸、碳苷黃酮等在310～330nm有最大吸收。因此，對(duì)原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸采用274nm的波長(zhǎng)進(jìn)行定量分析，而對(duì)其他化合物則采用324nm的波長(zhǎng)進(jìn)行定量分析。14種酚酸類(lèi)化合物在274nm和324nm的色譜如圖1所示。

1.原兒茶酸；2.龍膽酸；3.對(duì)羥基苯甲酸；4.綠原酸；5.香草酸；6.咖啡酸；7.丁香酸；8.香豆酸；9.阿魏酸；10.芥子酸；11.異葒草苷；12.葒草苷；13.牡荊苷；14.異牡荊苷

2.2 竹葉樣品提取條件的優(yōu)化

2.2.1 料液比的優(yōu)化 稱(chēng)取干燥粉碎后的竹葉樣品1g（精確至0.001g）5份，按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50的料液比，分別加入10mL、20mL、30mL、40mL和50mL的75%甲醇-水溶液（體積比），超聲提取30min；取出于4 000r離心10min，上清液用超純水稀釋2倍后，進(jìn)行液相色譜分析。以綠原酸為例，在不同料液比的情況下，其含量變化如圖2所示。從圖2可以看出，綠原酸的含量隨料液比的增加先減少后增大，但總體變化不大?？傮w來(lái)看，增大料液比，提取效率有所增加，但提取液中綠原酸的濃度變低?？紤]到竹葉提取物中酚酸類(lèi)化合物的含量較低，提取液濃度太低，不利于其中酚酸類(lèi)化合物的測(cè)定；但是減少料液比，如采用1∶10的料液比，雖然提取物中酚酸類(lèi)化合物的濃度增加，但是較小的料液比不利于酚酸類(lèi)化合物的浸出。因此，綜合考慮，實(shí)驗(yàn)中采用1∶20的料液比。

2.2.2 提取溶劑的優(yōu)化 稱(chēng)取干燥粉碎后的竹葉樣品1g（精確至0.001g）6份，按照1∶20的料液比，分別加入20mL 50%、55%、60%、70%、80%和90%的甲醇-水溶液（體積比），超聲提取30min；取出于4 000r離心10min，上清液用超純水稀釋2倍后，進(jìn)行液相色譜分析。以綠原酸為例，在不同提取溶劑的情況下，綠原酸提取含量的變化如圖3所示。從圖3可以看出，綠原酸的含量隨提取溶劑中甲醇含量的增加先增大后減少，在60%甲醇含量的情況下，綠原酸的提取含量最大。增加提取溶劑中甲醇的含量，有利于竹葉中綠原酸的浸出；但提取溶劑中甲醇含量太高，綠原酸的含量反而降低，其原因可能是酚酸類(lèi)化合物的極性較大，提取溶劑中水的比例減少，反而不利于其浸出。另外，增加甲醇的含量，竹葉中其他非極性雜質(zhì)如葉綠素等的浸出量也增加，不利于后續(xù)的分析。因此，實(shí)驗(yàn)中采用甲醇含量為60%的提取溶劑。

2.2.3 提取時(shí)間的優(yōu)化 稱(chēng)取干燥粉碎后的竹葉樣品1g（精確至0.001g）6份，按照1∶20的料液比，加入20mL 75%的甲醇-水溶液，分別超聲5、10、20、30、45、60min；取出于4 000r離心10min，上清液用超純水稀釋2倍后，進(jìn)行液相色譜分析。以綠原酸為例，其含量變化如圖4所示。從圖4可以看出，綠原酸的含量隨超聲時(shí)間的增加而增加，60min時(shí)最大，可能是由于隨著超聲時(shí)間的增加，超聲水浴溫度升高，導(dǎo)致60min時(shí)綠原酸的含量變化較大；但在45min前，綠原酸的含量緩慢增加。為了節(jié)省時(shí)間，以及由于后續(xù)需要多次提取的緣故，實(shí)驗(yàn)中選擇超聲30min。

2.2.4 提取次數(shù)的優(yōu) 稱(chēng)取干燥粉碎后的竹葉樣品1g（精確至0.001g），按照1∶20的料液比，加入20mL 75%的甲醇-水溶液，超聲提取30min，取出于4 000r離心10min，倒出上清液；殘?jiān)偌尤?0mL 75%的甲醇-水溶液提取3次。對(duì)每次提取離心后的上清液，用超純水稀釋2倍后進(jìn)行液相色譜分析。以綠原酸為例，其含量變化如圖5所示。從圖5可以看出，綠原酸的含量隨提取次數(shù)的增加而增加，提取2次后，提取回收率大于95%，實(shí)驗(yàn)中選擇提取2次。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系、線(xiàn)性范圍和檢出限 對(duì)1.2.1節(jié)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2.4節(jié)的色譜方法進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。以標(biāo)注曲線(xiàn)的最低點(diǎn)為最低定量濃度，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限。各化合物的回歸方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限如表1所示，結(jié)果表明各酚酸類(lèi)化合物在給定濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4 方法精密度 按照1.2.2節(jié)的方法，稱(chēng)取5份竹葉樣品，獨(dú)立進(jìn)行提取和分析，以綠原酸為指標(biāo)，考察提取方法的精密度，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于7.7%；對(duì)1.2.3節(jié)制備的竹葉抗氧化劑樣品，進(jìn)行5次重復(fù)進(jìn)樣，考察分析方法的精密度，對(duì)各酚酸類(lèi)化合物，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3.2%。

2.5 樣品的測(cè)定 對(duì)1.2.2和1.2.3節(jié)制備的竹葉提取物和竹葉抗氧化劑樣品，每個(gè)樣品重復(fù)制備3次，按照1.2.4節(jié)的色譜方法進(jìn)行分析，以竹葉抗氧化劑2#樣品為例，其色譜如圖6所示。

其中C表示竹葉干燥樣品或竹葉抗氧化劑產(chǎn)品中酚酸類(lèi)化合物的含量（g/kg），C'表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)讀出的含量（μg/mL），V表示樣品提取或溶解的總體積（mL），D表示進(jìn)樣前的稀釋倍數(shù)，m表示樣品的稱(chēng)取質(zhì)量（g）。

竹葉（干燥品）及竹葉抗氧化劑中各酚酸類(lèi)化合物的含量測(cè)定結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，竹葉提取物中各種酚酸類(lèi)化合物的含量差異較大。竹葉中酚酸類(lèi)化合物的含量較低，主要含有葒草苷、異葒草苷、龍膽酸和綠原酸等，而竹葉抗氧化劑產(chǎn)品中酚酸類(lèi)化合物的含量較高。竹葉抗氧化劑1#產(chǎn)品中酚酸類(lèi)化合物的總量占產(chǎn)品總質(zhì)量的54.0%，2#產(chǎn)品占36.3%；其中4種竹葉黃酮在竹葉抗氧化劑1#和2#產(chǎn)品中占酚酸類(lèi)化合物的總量90.9%、61.8%；竹葉黃酮中主要以葒草苷和異葒草苷存在，在兩種竹葉抗氧化劑中均占竹葉黃酮總量的80%。

對(duì)以羥基苯甲酸為母核和以羥基肉桂酸為母核的酚酸類(lèi)化合物，在兩種竹葉抗氧化劑中主要以龍膽酸、綠原酸、阿魏酸和芥子酸為主，并且與竹葉黃酮的分布存在明顯的差異。龔金炎等[6]指出，對(duì)大孔樹(shù)脂法制備的竹葉抗氧化劑產(chǎn)品，在大孔樹(shù)脂洗脫過(guò)程中會(huì)損失極性較大的酚酸類(lèi)化合物。本研究的竹葉抗氧化劑1#產(chǎn)品即為大孔樹(shù)脂法精制而得，而竹葉抗氧化劑2#產(chǎn)品為正丁醇液-液萃取法精制而得，表現(xiàn)出1#產(chǎn)品中竹葉黃酮的含量高于2#產(chǎn)品；相反，其他酚酸類(lèi)化合物在2#產(chǎn)品中的含量高于1#產(chǎn)品，如圖7所示。除制備工藝外，竹葉原料的差異也會(huì)影響竹葉提取物中酚酸類(lèi)化合物的分布。

文獻(xiàn)中常見(jiàn)對(duì)竹葉提取物中綠原酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷等化合物進(jìn)行分析，未見(jiàn)其他如以苯甲酸為母核和肉桂酸為母核的酚酸類(lèi)化合物測(cè)定的報(bào)道。本研究除上述8種酚酸類(lèi)化合物以外，還測(cè)定了原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸和芥子酸等，并探討了酚酸類(lèi)化合物在不同工藝制備的竹葉抗氧化劑產(chǎn)品中的分布，對(duì)全面了解竹葉提取物中的酚酸類(lèi)化合物提供新的思路。

3 結(jié)論

本研究建立了竹葉提取物中14種酚酸類(lèi)化合物的測(cè)定方法，通過(guò)色譜分離條件的優(yōu)化，各組分與雜質(zhì)取得了良好的分離度，該方法線(xiàn)性關(guān)系良好、檢出限低、精密度高。該方法用于竹葉提取物中酚酸類(lèi)化合物含量的測(cè)定，結(jié)果顯示竹葉及不同工藝制備的竹葉抗氧化劑產(chǎn)品中酚酸類(lèi)化合物的分布特征差異顯著。所建立的方法對(duì)竹葉抗氧化劑產(chǎn)品的原料選擇、質(zhì)量控制、制備工藝優(yōu)化及其基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)、保健和藥理研究等具有非常重要的意義。

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（責(zé)編：張宏民）