優(yōu)化陳米糖化液提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的研究

李嘉宇，盧紅梅*，姜曉琳，張　媛，周　悅，金　葉

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

優(yōu)化陳米糖化液提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的研究

李嘉宇，盧紅梅*，姜曉琳，張媛，周悅，金葉

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

以木醋桿菌（Acetobacterxylinum）為發(fā)酵菌種，通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了陳米糖化液培養(yǎng)基中酵母膏、KH2PO4、FeSO4、乙醇對木醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素具有顯著影響，并采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對各顯著影響因子進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)的陳米糖化液發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：在陳米糖化液培養(yǎng)基基料中加入酵母膏13.1 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO45.7 g/L、MgSO43.1 g/L、FeSO40.3 g/L、檸檬酸0.3 g/L、無水乙醇4.0%。在此優(yōu)化條件下，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為7.08 g/L，是陳米糖化液培養(yǎng)基基料發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素（0.38 g/L）的18.6倍，比基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（4.80 g/L）提高了47.5%。

陳米；糖化液；細(xì)菌纖維素；木醋桿菌

陳米為隔年米，在存儲過程中，因氣溫、濕度、氧化、蟲蝕等因素的影響，無論是在外觀、營養(yǎng)方面，還是口感和味道都較之新米相差許多。近幾年來，我國糧食連年豐收，而且隨著人們生活水平不斷提高，對糧食的消費(fèi)也在逐漸下降，導(dǎo)致大量陳米積壓。調(diào)查顯示，市場上陳米多過新米、散裝大米［1］。因此有必要對陳米、碎米及低品質(zhì)秈米進(jìn)行深加工、高值化利用。目前對陳米的研究有陳米粉可食性包裝薄膜［2］、陳米用于釀酒［3］、陳米造塑料［4］、大米粉液化糖化液發(fā)酵井岡霉素A［5］等。利用陳米生產(chǎn)細(xì)菌纖維素可以大幅度提高陳米附加值。

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為代表的少數(shù)微生物發(fā)酵而成的具有廣闊開發(fā)前景的生物材料［7］，如作為保健品和食品添加劑；提高紙張性能；用做生物醫(yī)學(xué)材料、多種組織器官（皮膚、血管、軟骨組織、骨組織、泌尿系統(tǒng)等組織）的重建材料、燃料電池、緩釋劑、復(fù)合材料等；還可應(yīng)用在聲學(xué)器材、非織造布、離子交換膜和膜分離等諸多領(lǐng)域［8-11］。椰子水是最早用于生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的原料，也是目前普遍使用的原料［12］，以椰子水為主要原料具有地域性和季節(jié)性限制，無法滿足市場擴(kuò)增的需要。尋找替代椰子水的細(xì)菌纖維素原料成為研究的一大熱點(diǎn)［13-14］。

前期研究表明，陳米糖化液可用于培養(yǎng)細(xì)菌纖維素，但用陳米糖化液培養(yǎng)基基料為發(fā)酵培養(yǎng)基時，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量較低。因此，有必要通過優(yōu)化陳米糖化液發(fā)酵培養(yǎng)基提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。本研究通過Plackett-Burman及Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化陳米糖化液發(fā)酵培養(yǎng)基，以期提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量并拓寬發(fā)酵細(xì)菌纖維素的原料范圍。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種及材料

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）：貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；陳米：市售。

1.1.2試劑

α-1，4-葡萄糖水解酶（酶活力為50 000 U/g）：上海佳和生物科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津市登科化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、氫氧化鉀（分析純）：重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；苯酚（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸、乙酸（分析純）：重慶川江化學(xué)試劑廠。

1.1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，檸檬酸1 g/L，KH2PO42 g/L，瓊脂20 g/L，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蔗糖20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO41 g/L，121℃滅菌20 min，滅菌冷卻后無菌條件下加入無水乙醇3%。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖50 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨8.0 g，KH2PO44.3 g/L，MgSO42.5 g/L，121℃滅菌20 min，滅菌冷卻后無菌條件下加入無水乙醇3%。

陳米糖化液發(fā)酵培養(yǎng)基：在大米糖化液培養(yǎng)基基料中加入適量的酵母膏、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、檸檬酸、無水乙醇。

1.2儀器與設(shè)備

SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；FA2004N型精密電子天平：上海菁海儀器有限公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-2550紫外-可見光分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3方法

1.3.1總糖含量的測定

（1）試劑配制

1 mg/m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取105℃下烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖1.000 0 g，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至1 000 m L容量瓶中，用蒸餾水定容至1 000 m L，混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑的配制：（1）甲液：將6.9 g重蒸酚溶解于15.2 m L 100g/LNaOH溶液中，并稀釋到70 m L，加入6.9 g亞硫酸鈉；（2）乙液：稱取255 g酒石酸鉀鈉，加入到300 m L 100 g/L NaOH溶液中，再加入880 m L 10 g/L 3，5-二硝基水楊酸溶液。將甲液與乙液混合即得黃色試劑，貯于棕色瓶中，在室溫下放置7～10 d后使用［15］。

（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L、1.2 m L、1.4 m L、1.6 m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于25 m L比色管中，各加入2 m L DNS試劑，置于沸水浴中2 min，進(jìn)行顯色，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至25 m L，搖勻，以空白試劑調(diào)零，在波長540 nm處測定吸光度值，以葡萄糖含量（C）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程A=0.914 5C-0.004 93（R2=0.999 63）計(jì)算樣品中葡萄糖含量。

（3）樣品處理

將發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/m in離心20 min，取上清液5 m L于250 m L容量瓶中加入30 m L的蒸餾水，5 m L 6 mol/L HCl，在70℃水浴15 min，冷卻至室溫，調(diào)pH值至7～8，并定容至250 m L，作為試樣水解液備用。

（4）樣品測定

吸取水解液1.0 m L，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作方法測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算水解液中葡萄糖含量，發(fā)酵液中總糖含量計(jì)算公式如下：

式中：C為由樣品吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖含量，mg/m L；K為樣液的稀釋倍數(shù)，50。

1.3.2陳米糖化液培養(yǎng)基基料制備

將一定量的陳米粉碎，按照料液比1∶12（g∶m L）加入蒸餾水，于80～90℃水浴鍋中糊化30 min，降溫至60℃，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4.0～4.5，添加300 U/g α-1，4-葡萄糖水解酶進(jìn)行糖化（取少量試液于試管中，滴加少量碘液觀察是否變藍(lán)，如不變色即已糖化完全。），糖化完全后靜置，取上層澄清液［16］，經(jīng)DNS法測定糖化液中總糖含量，添加蒸餾水將糖化液稀釋至總糖含量為50 g/L。即為陳米糖化液培養(yǎng)基基料。

1.3.3培養(yǎng)方法

菌種活化：挑取適量原代木醋桿菌（A.xylinum）接種于斜面培養(yǎng)基中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

液體種子培養(yǎng)：準(zhǔn)確量取50 m L液體種子培養(yǎng)基于250 m L的三角瓶中，取三環(huán)活化好的木醋桿菌接入種子培養(yǎng)基中，28℃、100 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：準(zhǔn)確量取50 m L發(fā)酵培養(yǎng)基于250 m L三角瓶中，冷卻后接入木醋桿菌種子液13.5%，置于30℃下靜置培養(yǎng)192 h。

1.3.4細(xì)菌纖維素產(chǎn)量測定

細(xì)菌纖維素膜的處理：收集細(xì)菌纖維素膜，用蒸餾水反復(fù)沖洗除去膜表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)后，置于80℃，0.1 m ol/L的NaOH溶液中，維持2 h（若膜較厚可以適當(dāng)延長時間，每2 h更換一次NaOH溶液），以除去菌體蛋白和殘余培養(yǎng)基，至膜呈乳白色半透明狀，冷卻至室溫后用0.5%（V/V）乙酸中和30 min，蒸餾水充分洗滌，至膜呈中性，貼至塑料板上，在80℃條件下干燥至恒質(zhì)量［17］。細(xì)菌纖維素產(chǎn)量計(jì)算公式如下：

1.3.5Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)微生物發(fā)酵細(xì)菌纖維素的一般影響因素和前期的初步試驗(yàn)，選取蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、檸檬酸、無水乙醇為試驗(yàn)因素，以細(xì)菌纖維素干質(zhì)量（Y）為評價指標(biāo)，設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，利用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及模型建立。Placktt-Burman試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Fac tors and levels of Plackett-Burm an experim ents

1.3.6Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的關(guān)鍵因素與水平，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行響應(yīng)面分析，以獲得細(xì)菌纖維素高產(chǎn)量的培養(yǎng)基組成成分。Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2　結(jié)果與分析

2.1陳米糖化液培養(yǎng)基基料發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素

在優(yōu)化培養(yǎng)基前，使用陳米糖化液培養(yǎng)基基料培養(yǎng)木醋桿菌生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，30℃培養(yǎng)8 d，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為0.38 g/L，利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基時細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為4.80 g/L。陳米糖化液基料發(fā)酵的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的產(chǎn)量。由于陳米糖化液基料培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的總糖含量都為50 g/L，說明導(dǎo)致陳米糖化液基料培養(yǎng)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量低的原因是除糖類外的其他營養(yǎng)成分不足，用陳米糖化液培養(yǎng)木醋桿菌生產(chǎn)細(xì)菌纖維素時，應(yīng)該對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

2.2Plackett-Burman試驗(yàn)篩選陳米糖化液培養(yǎng)基主要因素

以細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行12組試驗(yàn)，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。利用Design Expert 7.0對Plackett-Burman試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各個因素的效應(yīng)及顯著性如表4所示。

表3　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burm an experiments

表4　Plackett-Burman試驗(yàn)主效應(yīng)分析Table 4 Analysis of main effects for the Plackett-Burm an experim ents

由表4中P值的大小可知，陳米糖化液培養(yǎng)基中各因素對菌株發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素顯著影響的有：酵母膏（P=0.068 3）、KH2PO4（P=0.076 5）、FeSO4（P=0.051 1）和無水乙醇（P=0.001 8），可以作為進(jìn)一步優(yōu)化的關(guān)鍵因素。

2.3Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在Plackett-Burm an試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對影響木醋桿菌在陳米糖化液培養(yǎng)基中合成細(xì)菌纖維素的效應(yīng)顯著因素按Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行29組試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。利用Design-Exper 7.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（Y）對自變量酵母膏（X1）、KH2PO4（X2）、FeSO4（X3）、無水乙醇（X4）的多元回歸方程：Y=6.59+0.28X1-0.23X2-0.014X3+0.075X4-0.027X1X2-9.500E-003X1X3-9.000E-003X1X4+0.030X2X3+ 0.25X2X4+0.012X3X4-0.65X12-0.36X22-0.23X32-0.87X42。對模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果見表6。

由表6可知，此模型P＜0.000 1說明該回歸方程極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.272 1），說明模型與實(shí)際擬合良好，自變量與響應(yīng)值有顯著線性關(guān)系，預(yù)測值和試驗(yàn)值之間具有高度的相關(guān)性（R2=0.930 6），可以應(yīng)用于細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)的理論預(yù)測。

表5　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results Box-Behnken experim ents

表6　回歸方程的方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

在模型參數(shù)中，X1、X2、X12、X22、X32、X42對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響極顯著。在獲得回歸非線性模型和響應(yīng)面之后，為得到培養(yǎng)基最佳的質(zhì)量濃度，對所得的回歸擬合方程各自變量分別求極值，得極值點(diǎn)分別為：X1=0.24，X2=-0.32，X3=1，X4=0.04，即酵母膏添加量為13.1g/L，KH2PO4添加量為5.7 g/L，F(xiàn)eSO4添加量為0.3 g/L無水，乙醇添加量為4.04%。最優(yōu)的培養(yǎng)基發(fā)酵條件下，理論細(xì)菌纖維素的最大產(chǎn)量為6.66 g/L。優(yōu)化后在陳米糖化液培養(yǎng)基基料中加入酵母膏13.1g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO45.7g/L、MgSO43.1g/L、FeSO40.3 g/L、檸檬酸0.3 g/L、無水乙醇4.0%配制成陳米糖化液培養(yǎng)基。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基細(xì)菌纖維素平均產(chǎn)量為7.08 g/L，接近預(yù)測值，是陳米糖化液培養(yǎng)基基料產(chǎn)細(xì)菌纖維素的18.6倍（0.38 g/L），比基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（4.80 g/L）提高了47.5%。

3　結(jié)論

結(jié)合陳米高值化利用和細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基質(zhì)更新的迫切需求，對陳米糖化液培養(yǎng)基產(chǎn)細(xì)菌纖維素進(jìn)行了試驗(yàn)，但僅用陳米糖化液基料培養(yǎng)細(xì)菌纖維素時，由于缺乏除碳源外的營養(yǎng)成分，產(chǎn)量僅為0.38 g/L，遠(yuǎn)低于基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量4.80 g/L。本研究通過采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對陳米糖化液培養(yǎng)基的主要組分進(jìn)行篩選，并優(yōu)化各組分的配比，獲得優(yōu)化的陳米糖化液培養(yǎng)基成分配比為：在陳米糖化液培養(yǎng)基基料中加入酵母膏13.1 g/L、蛋白胨10.0 g/L、磷酸二氫鉀5.7 g/L、硫酸鎂3.1 g/L、硫酸亞鐵0.3 g/L、檸檬酸0.3 g/L、無水乙醇4%。在優(yōu)化培養(yǎng)基條件，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為7.08 g/L，是陳米糖化液培養(yǎng)基基料發(fā)酵細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的18.6倍，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵細(xì)菌纖維素產(chǎn)量提高了47.5%。

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Optim ization of stocked rice saccharification liquid for im proving bacterial cellulose yield

LI Jiayu，LU Hongmei*，JIANG Xiaolin，ZHANG Yuan，ZHOU Yue，JIN Ye
（College of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using Acetobacter xylinum as fermentative strain，yeast extract，KH2PO4，F(xiàn)eSO4and ethanol had obvious effect on bacterial cellulose produced from A.xylinum by Plackett-Burman experiments.The factors were optim ized by Box-Behnken experiments，and the optimum formula of stocked rice saccharification liquid fermentation medium were yeast extract 13.1 g/L，peptone 10 g/L，KH2PO45.7 g/L，MgSO43.1 g/L，F(xiàn)eSO40.3 g/L，citric acid 0.3 g/L，absolute ethanol 4.0%.Under the conditions，the yield of bacterial cellulose was 7.08 g/L，which was 18.6 times of the bacterial cellulose yield（0.38 g/L）in the basic material of stocked rice saccharification liquid medium and was increased by 47.5%than that（4.80 g/L）of basis fermentation medium.

stocked rice；saccharification liquid；bacterial cellulose；Acetobacter xylinum

Q815

0254-5071（2016）05-0047-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．010

2016-02-14

國家自然科學(xué)基金（31160338）；貴州大學(xué)“SRT計(jì)劃”項(xiàng)目（貴大SRT字［2014］107號）

李嘉宇（1996-），女，本科生，研究方向?yàn)樯锊牧稀?/p>

盧紅梅（1967-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。