高效液相色譜法同時測定糕點中富馬酸二甲酯與納他霉素

劉　琦，高志瑩，洪　霞，吳永寶，馬　燕，周鑫魁，鄧麗娟，何海寧

（甘肅省商業(yè)科技研究所甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司，甘肅蘭州730010）

高效液相色譜法同時測定糕點中富馬酸二甲酯與納他霉素

劉琦，高志瑩，洪霞，吳永寶，馬燕，周鑫魁，鄧麗娟，何海寧

（甘肅省商業(yè)科技研究所甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司，甘肅蘭州730010）

建立高效液相色譜法同時測定糕點中富馬酸二甲酯與納他霉素的檢測方法。樣品經(jīng)10 mL甲醇溶解、超聲提取后，采用Phenomenex Gem ini C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）分離，以甲醇與20 mmol/L乙酸銨溶液（50∶50，V/V）為流動相，兩者分離效果較好。富馬酸二甲酯與納他霉素在0.5～20.0 μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 9），檢出限（LOD）（S/N=3）分別為0.04 mg/kg與0.20 mg/kg。加標(biāo)回收率分別為94.430%～99.616%和95.860%～101.968%，精密度試驗結(jié)果變異系數(shù)（CV）分別為1.09%～2.02%和1.54%～2.66%。該方法與國標(biāo)方法測定樣品中富馬酸二甲酯與納他霉素含量的相對標(biāo)準偏差（RSD）分別為0.789%和0.918%，符合方法學(xué)要求，表明該方法準確可靠、精密度良好，可用于實際樣品中富馬酸二甲酯與納他霉素的同時測定。

高效液相色譜；同時測定；糕點；富馬酸二甲酯；納他霉素

糕點類食品在生產(chǎn)和銷售過程中容易霉變、酸敗。生產(chǎn)企業(yè)為了保證質(zhì)量和風(fēng)味，延長貨架期，往往過量添加允許范圍內(nèi)的防腐劑，甚至添加禁止使用的防腐劑，如富馬酸二甲酯（dimethy fumarate，DMF）［1］、納他霉素（natamycin）等。富馬酸二甲酯又稱反丁烯二酸二甲酯，俗名霉克星1號和防霉保鮮劑［2］，具有廣譜高效的抗菌特性，對30多種霉菌、酵母菌和細菌都有很好的抑菌效果，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和皮革等產(chǎn)品的防霉［3］。研究表明，食品中的富馬酸二甲酯易水解生成甲醇，對人體腸道、內(nèi)臟造成損害，長期食用還會對肝、腎有很大的副作用，尤其對兒童的生長發(fā)育造成極大危害［4］。納他霉素也稱游鏈霉素、匹馬霉素或海松素，是一種天然的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［4］，能有效的抑制酵母菌等真菌的生長［5］。作為一種新型防腐劑，納他霉素已被廣泛應(yīng)用于乳酪、果汁、肉制品和糕點等食品中［6］。國標(biāo)GB 2760—2011《食品安全國家標(biāo)準食品添加劑使用標(biāo)準》中明確規(guī)定富馬酸二甲酯不允許使用在食品中，同時，納他霉素的最大使用量為0.3 g/kg［7］。因此，為了確保糕點制品的安全，對富馬酸二甲酯與納他霉素的使用進行有效地檢測、監(jiān)控是非常必要的。

目前，對食品中富馬酸二甲酯的檢測方法主要有薄層法［8］、氣相色譜（gas chromatography，GC）法［9-10］、液相色譜（liquid chromatogram，LC）法［11-12］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）法［13-15］，食品中納他霉素的檢測方法主要有高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）法［16-19］、液相色譜-質(zhì)譜法［20］、分光光度法［21］、電化學(xué)法［22］等。本研究旨在探索用甲醇-水提取糕點中的富馬酸二甲酯及納他霉素，處理后利用高效液相色譜法同時測定糕點中的富馬酸二甲酯及納他霉素的含量，以期建立一種準確、可靠、快速、簡便的分析方法檢測糕點中的富馬酸二甲酯與納他霉素，保障糕點制品安全。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

某品牌糕點：市售。

富馬酸二甲酯標(biāo)準品（純度99.0%）、納他霉素標(biāo)準品（純度89.9%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸銨（色譜純）：美國Thermo Fisher公司；磷酸氫二銨（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：北京百靈威科技有限公司；丙酮（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯（色譜級）：山東禹王實業(yè)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；Phenomenex GeminiC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美國菲羅門公司；XS225A-SCS電子天平：瑞士普利賽斯公司；VORTEX GENIUS3渦旋器：德國IKA公司；SB-5200DTN超聲波機：寧波新芝生物科技股份有限公司；CF16RXⅡ離心機：日本日立公司；UPH-1超純水儀：四川優(yōu)譜超純科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準儲備液的配制

標(biāo)準儲備液：分別稱取富馬酸二甲酯、納他霉素標(biāo)準品10.00mg于10m L容量瓶中，分別用純甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/m L的富馬酸二甲酯和納他霉素的標(biāo)準儲備液，于4℃冷藏備用。

1.3.2色譜條件

Phenomenex Gem ini C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，B為20 mmol/L乙酸銨溶液，流動相梯度洗脫程序見表1；流速1.0 m L/min；進樣量10 μL；柱溫30℃；檢測波長：0～6.0 min為220 nm，6.0 min～20.0 min為305 nm。

表1　梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.3.3樣品前處理

樣品經(jīng)均勻粉碎后，稱取5.00g樣品于25m L比色管中，用少量水溶解樣品后，加入10m L甲醇提取，渦旋混合3 m in后，超聲提取30 min，用水定容至25 m L，搖勻，轉(zhuǎn)入50 m L離心管中，5℃、10 000 r/m in離心5 m in，上層清液過0.22 μm有機濾膜過濾，濾液供HPLC檢測分析。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

2.1.1流動相的選擇

參考相關(guān)文獻［17，23-25］，本研究選用甲醇與20 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，固定其他色譜條件不變的情況下，不斷改變流動相甲醇與20 mmol/L乙酸銨的起始比例40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40（V/V）。經(jīng)實驗得出，當(dāng)流動相甲醇與20 mmol/L乙酸銨的起始比例為40∶60（V/V）和45∶55（V/V）時，富馬酸二甲酯出峰響應(yīng)不高且雜峰較多，55∶45（V/V）時納他霉素的響應(yīng)過低且峰型不好，流動相起始比例為60∶40（V/V）時富馬酸二甲酯與納他霉素峰型均不對稱，但是甲醇與20mmol/L乙酸銨比例為50∶50（V/V）時富馬酸二甲酯與納他霉素兩者均完全分離且峰型較好。因此確定流動相甲醇與20mmol/L乙酸銨的起始比例為50∶50（V/V）。

2.1.2檢測波長的選擇

分別取10 μg/m L富馬酸二甲酯與納他霉素標(biāo)準儲備液，在波長200～400 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，富馬酸二甲酯在波長210 nm處有最大吸收，納他霉素在波長305 nm處有最大吸收。因此，設(shè)定波長為210 nm，在富馬酸二甲酯完全出峰后將檢測波長設(shè)置為305 nm。

2.2提取條件的選擇

2.2.1提取溶劑的選擇

據(jù)文獻報道，常用甲醇［11，23，26］、乙酸乙酯［27-29］、乙腈［30］、丙酮［31］等溶劑提取富馬酸二甲酯；用甲醇［16-19］、丙酮［16］、乙酸乙酯和乙腈［32］等溶劑提取納他霉素。本研究在樣品中分別添加25 mg/kg富馬酸二甲酯與納他霉素的標(biāo)準品，加入少量水溶解后，再分別加入10 m L的甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮進行提取，考察4種提取劑對富馬酸二甲酯與納他霉素回收率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　不同溶劑提取效果Fig.1 Effect of different solvents on the extraction

由圖1可知，甲醇對富馬酸二甲酯與納他霉素的回收率均明顯高于其他溶劑，其次是丙酮和乙腈，乙酸乙酯的回收率最低。根據(jù)提取效率結(jié)合經(jīng)濟性與安全性，選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2.2提取溶劑體積的選擇

選用甲醇作為提取溶劑，考察提取劑提取體積5 m L、10 m L、15 m L、20 m L對樣品中富馬酸二甲酯與納他霉素的回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　提取液體積對富馬酸二甲酯與納他霉素提取效果的影響Fig．2 Effect of extraction solution volume on extraction of dimethyl fumarate and natam ycin

由圖2可知，甲醇體積為5 m L時，富馬酸二甲酯和納他霉素的回收率較低，由于水相比例較大，富馬酸二甲酯在甲醇、乙醇中具有一定的溶解度，在水中溶解度較低［33-34］，同時，納他霉素在水中溶解度也較低［17］；甲醇為10 m L時，富馬酸二甲酯與納他霉素的回收率均達到了最大值；甲醇體積為15 m L時，富馬酸二甲酯回收率較低；甲醇體積為20 m L時，納他霉素回收率較低且甲醇溶解出樣品中較多雜質(zhì)，容易產(chǎn)生干擾峰并污染色譜柱。因此，綜合考慮選用10 m L甲醇作為提取液。

2.3標(biāo)準品和樣品的高效液相色譜檢測

將富馬酸二甲酯與納他霉素標(biāo)準溶液和樣品在確定的色譜條件下進行檢測，得到2種標(biāo)準品及樣品的色譜圖分別如圖3、圖4所示。

圖3　標(biāo)準溶液的高效液相色譜圖Fig．3 HPLC chromatogram of standard solution

由圖3可知，在已確定的洗脫條件下，即甲醇與20mmol/L乙酸銨50∶50（V/V）作為起始比例進行梯度洗脫，富馬酸二甲酯與納他霉素標(biāo)準均能完全分離且分離度高，峰型較好。

圖4　樣品的高效液相色譜圖Fig．4 HPLC chromatogram of the sam ple

由圖4可以看出，樣品中的雜質(zhì)峰與富馬酸二甲酯標(biāo)準峰完全分離，未干擾目標(biāo)物出峰，樣品中富馬酸二甲酯與納他霉素峰完全分離，說明在此條件下可以完全分離兩個目標(biāo)物，分離效果較好。

2.4標(biāo)準曲線及檢出限

分別吸取富馬酸二甲酯與納他霉素的標(biāo)準儲備液各0.05 m L、0.10 m L、0.20 m L、0.50 m L、1.00 m L、2.00 m L于6個10 m L容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5μg/m L、1.0μg/m L、2.0μg/m L、5.0μg/m L、10.0μg/m L、20.0μg/m L的系列濃度梯度溶液，在色譜條件下進行測定，以標(biāo)準溶液質(zhì)量濃度（x）和峰面積（y）制作標(biāo)準曲線。富馬酸二甲酯與納他霉素在0.5～20.0 μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限結(jié)果見表2。

表2　富馬酸二甲酯和納他霉素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Regression equation，correlation coefficient and lim it of detection of dimethyl fumarate and natam ycin

由表2可知，富馬酸二甲酯與納他霉素的線性相關(guān)系數(shù)R2均為0.999 9，表明2種化合線性關(guān)系良好。以儀器測量時3倍信噪比，測得方法檢出限分別為0.04mg/kg和0.20mg/kg，均低于國標(biāo)方法檢出限0.05 mg/kg和0.50 mg/kg，此方法能滿足富馬酸二甲酯與納他霉素的定量分析要求。

2.5方法回收率試驗

在糕點樣品分別添加10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg3個水平的富馬酸二甲酯與納他霉素標(biāo)準品進行加標(biāo)回收率試驗，每個水平設(shè)置6個平行樣，并計算其加標(biāo)回收率，結(jié)果如表3所示。

表3　加標(biāo)回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 3 Results of adding standard recovery rates and precision tests（n=6）

由表3可知，富馬酸二甲酯的回收率為94.430%～99.616%，納他霉素的回收率為95.860%～101.968%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中要求的被測組分含量為1～100 mg/kg樣品回收率范圍為90%～110%的要求，說明本試驗方法的測定結(jié)果準確可靠，可用于糕點中富馬酸二甲酯與納他霉素含量的檢測。同時，本試驗中富馬酸二甲酯與納他霉素的實驗室內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）分別是1.09%～2.02%和1.54%～2.66%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢驗》中要求的被測組分含量≤100 mg/kg時，實驗室內(nèi)變異系數(shù)（CV）≤5.3%，表明該方法精密度良好，能滿足定量分析要求。

2.6糕點中富馬酸二甲酯和納他霉素的測定

采用NY/T 1723—2009《食品中富馬酸二甲酯的測定高效液相色譜法》和GB/T 21915—2008《食品中納他霉素的測定液相色譜法》中的方法與該方法分別測定樣品中富馬酸二甲酯和納他霉素的含量，驗證本試驗方法的準確性，結(jié)果見表4。

表4　本試驗方法與國標(biāo)方法測定的對比結(jié)果Table 4 Comparison results of the method w ith national standard m ethod

由表4可知，采用本試驗方法測得樣品中富馬酸二甲酯含量為2.765 mg/kg，納他霉素含量為10.220 m g/kg；國標(biāo)方法測得樣品中富馬酸二甲酯含量為2.787 mg/kg，納他霉素含量為10.127 mg/kg，相對偏差分別為0.789%和0.918%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢驗》附錄F中要求的含量為10～1 000 mg/kg樣品的檢測結(jié)果偏差范圍＜15%，說明該方法與國標(biāo)相比準確可靠，可用于糕點樣品中富馬酸二甲酯與納他霉素的測定。

3　結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法建立了同時測定糕點中富馬酸二甲酯與納他霉素的檢驗方法。選用10 m L甲醇作為提取液，Phenomenex Gem iniC18色譜柱（150mm×4.6mm，5 μm）分離，以甲醇-20 mmol/L乙酸銨（50∶50）為流動相，該方法分離效果較好，雜質(zhì)干擾少，能有效地將目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰分離。富馬酸二甲酯與納他霉素在0.5～20.0 μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好（R2均為0.999 9），方法檢出限分別為0.04 mg/kg和0.2 mg/kg，富馬酸二甲酯的回收率為94.430%～99.616%，納他霉素的回收率為95.860%～101.968%，精密度試驗結(jié)果CV值分別為1.09%～2.02%和1.54%～2.66%，該方法測定糕點樣品中富馬酸二甲酯和納他霉素含量分別為2.765 mg/kg和10.220 mg/kg。國家標(biāo)準方法測得結(jié)果為富馬酸二甲酯和納他霉素含量分別為2.787 mg/kg和10.127 mg/kg，相對標(biāo)準偏差分別為0.789%和0.918%，說明該方法測定結(jié)果準確可靠、精密度良好，結(jié)果偏差符合方法學(xué)要求，對于實際樣品中富馬酸二甲酯與納他霉素的同時測定具有重要意義。

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Simultaneous determ ination of dimethy fumarate and natamycin in cake by HPLC

LIU Qi，GAO Zhiying，HONG Xia，WU Yongbao，MA Yan，ZHOU X inkui，DENG Lijuan，HE Haining
（Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co.，Ltd.，Gansu Institute of Business and Technology，Lanzhou 730010，China）

The detection method was established for the simultaneous determ ination of dimethy fumarate and natamycin in food by HPLC.After dissolved in 10 m l methanol and extracted with ultrasonic，the sample was separated by Phenomenex Gemini C18chromatographic column（150 mm×4.6mm，5 μm）.W ith methanol and 20 mmol/L ammonium acetate solution（50∶50，V/V）as mobile phase，the separation efficiency of dimethy fumarate and natamycin was good.The dimethy fumarate and natamycin had a good linear relationship in the range of 0.5-20.0 μg/m l（R2=0.999 9），and the lim it of detection（S/N=3）were 0.04 mg/kg and 0.20 mg/kg，respectively.The coefficient of variation of precision tests results were 1.09%-2.02%and 1.54%-2.66%，respectively.The relative standard deviation（RSD）of the method and national standard method for determ ining the content of dimethy fumarate and natam ycin in sample was 0.789%and 0.918%，respectively，which was accorded w ith the requirements of the methodology. Due to its reliable accuracy and good precision，the method was suitable for simultaneous determ ination of dimethy fumarate and natamycin in actual sam ple.

HPLC；simultaneous determ ination；cake；dimethy fumarate；natamycin

O657．7

0254-5071（2016）05-0182-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．038

2016-01-11

流通領(lǐng)域動物源性制品質(zhì)量安全技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)平臺（1306TTPA036）；甘肅省動物源性制品安全分析與檢測技術(shù)重點實驗室（1309RTSA 025）；甘肅省動物源性制品快速檢測工程技術(shù)研究中心（1009FTGA 018）；中-馬清真食品國家聯(lián)合實驗室食品檢測平臺建設(shè)（1505JTCA017）

劉琦（1986-），女，工程師，碩士，研究方向為食品科學(xué)。