HPLC法測定熊膽汁中牛磺熊去氧膽酸含量的研究

李家泉 鄭昆芳

摘要：目的建立熊膽汁中?；切苋パ跄懰岷康腍PLC測定方法。方法用甲醇前處理熊膽汁；以十八烷基鍵合硅膠為填料；甲醇-磷酸二氫鈉溶液（0.03 mol/L）（68：32）為流動相，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.4；柱溫40℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)檢測波長為210 nm。結(jié)果牛磺熊去氧膽酸進(jìn)樣濃度在0.1045 mg/mL～1.045 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999，回收率在98%～102%之間，回收率RSD<1.5%。結(jié)論方法準(zhǔn)確、簡便、快速，可為熊膽汁的檢測及監(jiān)控提供技術(shù)依據(jù)和支持。

關(guān)鍵詞：熊膽汁；HPLC法；牛磺熊去氧膽酸；含量測定

中圖分類號：284文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2016）10-0078-03

Study on Taurocholate Ursodeoxycholic Acid Content in Bear Bile by HPLC

LI Jia-quan， ZHENG Kun-fang

（Dali Ruipin Junge Pharmaceutical Co.， Ltd.， Dali 671099， Yunnan）

【Abstract】Objective： To establish a HPLC method to determine taurocholate ursodeoxycholic acid content in bear bile. Methods： Bear bile was pre-treated with methanol. Octadecyl bonded silica was taken as a filler， methanol-sodium dihydrogen phosphate solution （0.03 mol/L） （68：32） as mobile phase， and phosphoric acid was used to adjust to pH 4.4. The column temperature was 40℃， with 1.0 mL/min of flow rate， 210 nm of detection wavelength. Results： The sample concentration of taurocholate ursodeoxycholic acid showed a good linear relationship between 0.1045 mg/mL and 1.045 mg/mL， r=0.9999， with the recovery rate between 98% to 102% and recovery rate RSD <1.5%. Conclusion： The method is accurate， simple and rapid， and can provide a technical base and support for the detection and monitoring of bear bile.

【Key words】bear bile， HPLC method， taurocholate ursodeoxycholic acid， determination

熊科動物黑熊經(jīng)膽囊手術(shù)引流而得熊膽汁經(jīng)干燥制成的熊膽粉，已收載于1989年試行、1996年轉(zhuǎn)為國家正式實(shí)行的藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]，并收載于2015年版《中國藥典》附錄，作為天然熊膽的替代品入藥。?；切苋パ跄懰幔═CDCA）是熊膽粉主要有效和特有成分，故熊膽粉藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定TUDCA的含量不得低于23%。但熊膽粉藥品標(biāo)準(zhǔn)中未對其原料熊膽汁中TUDCA含量的測定方法作出規(guī)定。而熊膽汁和熊膽粉中TUDCA含量的測定方法有一定的差異。熊膽汁原料關(guān)乎到所制成熊膽粉的質(zhì)量，對熊膽汁質(zhì)量的分析和控制是十分重要的，而其TUDCA含量的測定方法沒有報道。本文建立熊膽汁中?；切苋パ跄懰岷康腍PLC測定方法。方法準(zhǔn)確、簡便、快速，為熊膽汁的檢測及監(jiān)控提供技術(shù)依據(jù)和支持。

1儀器與試藥

LC98Ⅰ型、LC99Ⅱ型高效液相色譜儀（北京溫分分析技術(shù)有限公司）、7725Ⅰ型手動進(jìn)樣閥、雙通道色譜軟件工作站（浙大智達(dá)）、UV98I可變波長紫外檢測器、C18 5μShodex ID4.6×250mm色譜柱（原裝進(jìn)口）、BCD-176SQMK型美的電冰箱（合肥美的電冰箱有限公司）、SK3300H型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）、微孔濾膜（上海津騰）、色譜甲醇（fisher）、牛磺熊去氧膽酸鈉（中國食品藥品檢定研究院，110816-201208，含量91.7%，?；切苋パ跄懰釗Q算因子為0.9578）、分析純磷酸二氫鈉（國藥）、分析純甲醇（國藥）、熊膽汁（云南大理瑞品金閣藥業(yè)有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件 以十八烷基鍵合硅膠為填料；甲醇-磷酸二氫鈉溶液（0.03 mol/L）（68：32）為流動相，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.4，柱溫40℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，檢測波長為210 nm。理論板數(shù)按牛磺熊去氧膽酸峰計算不低于2500。在上述條件下，TUDCA與樣品中其它成分均能完全分離，分離度大于1.5。對照品與樣品圖譜見圖1A、B。

圖1對照品（A）和樣品（B）色譜圖

2.2樣品制備 取新鮮熊膽汁，過120目標(biāo)準(zhǔn)篩，精密量取續(xù)濾液0.5 mL置50 mL量瓶中。第一份加甲醇稀釋至刻度，搖勻；第二份加乙醇，稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜法過濾后，進(jìn)樣5μL測定，圖譜見圖2—A、B。

圖2乙醇為稀釋劑對照品（A）和甲醇為稀釋劑對照品（B）色譜圖

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用乙醇作為稀釋劑存在拖尾，n<2000；而甲醇作為稀釋劑，峰型尖銳，無拖尾及前沿現(xiàn)象，n>4500，故選擇甲醇作為稀釋劑。

2.3對照品溶液制備取?；切苋パ跄懰徕c對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解并定量稀釋制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.4供試品制備取熊膽汁不少于25 mL，過120目標(biāo)準(zhǔn)篩，精密量取續(xù)濾液1 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5線性關(guān)系考察精密稱取?；切苋パ跄懰徕c對照品28.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。再分別精密吸取上述對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0 mL置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻得系列濃度對照品溶液。取系列濃度對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按上述方法測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程為：

A=281822.207.C-1614.773r=0.9999

結(jié)果表明：TUDCA進(jìn)樣濃度在0.1045 mg/mL～1.045 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。

2.6準(zhǔn)確度考察取新鮮熊膽汁，照供試品制備方法制備并測定樣品中牛磺熊去氧膽酸的含量，作為已知濃度的供試品。精密量取已知濃度的供試品溶液0.5 mL置50 mL量瓶中，分別制作3組，每組3份，第1組每份精密加入對照品溶液（精密稱取牛磺熊去氧膽酸鈉對照品284.6 mg，置250 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。）10.00 mL；第2組每份精密加對照品溶液15.00 mL；第3組每份精密加入對照品溶液20.00 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取5 μL注入液相色譜儀測定，測得供試品中TUDCA的含量為45.22 mg/mL。回收率結(jié)果見下表。

2.7.1重復(fù)性取新鮮熊膽汁照供試品制備方法制備6份，進(jìn)樣檢測，測定結(jié)果TUDCA的含量分別為45.88、46.01、45.82、45.20、45.94、45.92 mg/mL。平均值為45.8 mg/mL，測定值的RSD為0.59%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.7.2中間精密度取同一均質(zhì)熊膽汁，由兩個分析員分別測定，每人測定6份，TUDCA的含量結(jié)果如下。

2.8專屬性考察按照供試品制備方法對空白溶液（甲醇）進(jìn)行處理作為空白組，照上述方法分別測定對照品組、熊膽汁供試品組與空白溶液組，檢測結(jié)果顯示，在該方法下，在供試品主峰保留時間±1.0 min內(nèi)無干擾峰。結(jié)果表明，該方法專屬性良好。圖譜見圖3—A、B、C。

2.9耐用性實(shí)驗(yàn)

2.9.1流動相比例變化±5%照供試品制備方法制備供試品，流動相比例按甲醇：磷酸二氫鈉溶液（0.03mol/L）比例變化為：63：37、68：32、73：27分別進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示在不同比例下，主峰保留時間分別為13.9～14.0、8.2～8.3、5.9～6.0 min之間。n均大于4000，R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結(jié)果分別為43.4、43.0、43.6 mg/mL，三者RSD為0.69%。結(jié)果表明，該方法流動相比例耐用性良好。

2.9.2流動相pH值變化±0.2照供試品制備方法制備供試品，流動相用磷酸調(diào)節(jié)PH值分別為4.2、4.4、4.6進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示在不同PH值下，主峰保留時間分別為9.2～9.3、9.5～9.7、9.3～9.5 min之間。n均大于4000，R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結(jié)果分別為39.3、39.1、40.0 mg/mL，三者RSD為1.20%。結(jié)果表明，該方法流動相PH值耐用性良好。

2.9.3柱溫變化±5℃照供試品制備方法制備供試品，在柱溫35℃、40℃、45℃下分別測定。檢測結(jié)果顯示在不同柱溫下，主峰保留時間分別為10.2～10.3、9.7～9.9、8.4～8.6 min之間。n均大于4000，R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結(jié)果分別為45.4、45.6、46.1 mg/mL，三者RSD為0.79%。結(jié)果表明，該方法柱溫耐用性良好。

2.9.4流速相對值變化±20%照供試品制備方法制備供試品，，在流速為0.8 mL/min、1.0 mL/min 與1.2 mL/min下分別測定。檢測結(jié)果顯示在不同流速下，主峰保留時間分別為11.2～11.4、9.9～10.1、7.8～7.9 min之間。n均大于4000，R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結(jié)果分別為44.4、45.0、43.8 mg/mL，三者RSD為1.35%。結(jié)果表明，該方法流速耐用性良好。

2.10樣品檢測根據(jù)上述方法，對連續(xù)10天內(nèi)產(chǎn)出的10批次熊膽汁TUDCA的含量進(jìn)行了檢測，其結(jié)果如下。

3討論

3.1樣品處理方式的選擇本項(xiàng)研究中，熊膽汁樣品分別用甲醇和乙醇進(jìn)行處理。經(jīng)對比實(shí)驗(yàn)，得到用甲醇處理優(yōu)于乙醇處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。熊膽汁樣品處理沒有明確的方法，有的文獻(xiàn)認(rèn)為需用某些蛋白沉淀劑處理。本項(xiàng)研究用甲醇處理并獲得較好的結(jié)果，操作方便快速，簡化了樣品前處理過程，降低了檢測成本，又提高了檢測效率。

3.2流動相組分比例的選擇流動相采用甲醇-磷酸二氫鈉溶液（0.03 mol/L）的比例為68：32，試驗(yàn)結(jié)果TUDCA與樣品中其它成分均能完全分離，分離度大于1.5，主峰保留時間適中，表明流動相的這一組分比例可用于熊膽汁樣品中TUDCA的含量測定。這一組分比例與熊膽粉檢測流動相組分的比例是有一定差異的，比例差異的原因可能與熊膽汁未經(jīng)過熱處理而熊膽粉受過熱烘干有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)，熊膽粉，第十一冊，1996，WS3-09（B-09）-96（Z）.