HPLC法測定清熱解毒口服液中木犀草苷的含量

劉亞男

[摘 要]清熱解毒口服液是常見的清熱解毒藥物，藥物成分非常多，木犀草苷就是其中一種。本文應(yīng)用HPLC法來測定清熱解毒口服液中木犀草苷的含量，不僅具有非常好的回收率，而且擁有比較好的內(nèi)線性關(guān)系，還非常簡單，準(zhǔn)確。希望能夠為廣大的清熱解毒口服液研究者提供借鑒。

[關(guān)鍵詞]HPLC法；清熱解毒口服液；木犀草苷；含量測定

中圖分類號：TU366 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-914X（2016）04-0337-01

清熱解毒口服液主要用于治療發(fā)熱面赤、咽喉腫痛等病癥。很多學(xué)者都對清熱解毒口服液中的黃芩苷等含量測定方法進(jìn)行了研究，但是卻很少有學(xué)者對其木犀草苷的含量進(jìn)行測定研究，基于此本文研究者選擇使用HPLC法來對清熱解毒口服液中木犀草苷的含量進(jìn)行研究。中藥藥典明確規(guī)定金銀花以及山銀花是兩個藥材，同時規(guī)定木犀草苷含量測定屬于金銀花項目下的一項測定內(nèi)容。為了保證清熱解毒口服液產(chǎn)品質(zhì)量，所選擇的制劑以及藥材必須能夠一一對應(yīng)。所使用的HPLC法測定法，方便、準(zhǔn)確，具有非常好的重現(xiàn)性，因為可以用來對控制清熱解毒口服液的質(zhì)量。

一、儀器與試藥

戴安Ultimate3000高效液相色譜儀：紫外檢測器，四元泵，自動進(jìn)樣器；瑞士PrecisaXR205SM-DR電子分析天平。木犀草苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號111720-200604）；清熱解毒口服液為市售不同廠家的產(chǎn)品；水為高純水，乙腈、冰醋酸為色譜純，其余試劑均為分析純。聚酰胺，柱層析用，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠。金銀花藥材為藥材市場購買，河南省食品藥品檢驗所鑒定。

二、溶液制備

1、對照品溶液

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12h的木犀草苷對照品適量，用70%乙醇制成36.6μg·mL-1的對照品溶液。

2、供試品溶液

精密量取清熱解毒口服液25mL，加水25mL稀釋后全部上聚酰胺柱（玻璃柱，自行填裝，規(guī)格長29cm，內(nèi)徑1.1cm），先后用水、10%乙醇、20%乙醇各200mL洗滌除雜，再用35%乙醇200mL洗滌，收集該洗脫液，水浴揮干，用甲醇溶解并定容至10mL，搖勻，即得。

3、陰性樣品溶液

取不含金銀花的處方比例藥材，按照清熱解毒口服液生產(chǎn)工藝，制備陰性樣品。按清熱解毒口服液的供試品溶液的制備方法操作，即得。

三、結(jié)果

1、色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

采用Agilent ZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以0.2%磷酸為流動相A，以乙腈為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～30min，87%A、80%A；30～38min，80%A、63%A；38～40min，63%A；40～41min，63%A、87%A；41～60min，87%A），流速1.0mL·min-1，檢測波長350nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。以木犀草苷色譜峰計理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2000。用上述色譜條件分別對對照品溶液和清熱解毒口服液的供試品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果木犀草苷主峰與其他色譜峰分離良好，輔料和其他藥材不干擾測定。同時用缺金銀花的陰性樣品進(jìn)行分析，在與對照品主峰相應(yīng)的保留時間處未出現(xiàn)色譜峰，說明本法具有較強(qiáng)的專屬性。從清熱解毒口服液樣品的HPLC-PDA圖中可以看出，木犀草苷的最大吸收波長為350nm，峰純度0.995，提示其為單一峰；質(zhì)譜檢測[儀器：Waters公司ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，Quattro Premier串聯(lián)質(zhì)譜檢測器。色譜條件：采用Waters公司ACQUITY UPLCTM BEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）色譜柱，流動相為10mmol·L-1醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈（75∶25），流速0.13mL·min-1。質(zhì)譜條件：離子化方式，電噴霧（ESI）；離子極性，negative（-）；掃描范圍：50～1000；工作參數(shù)： Capillary（kV）3.50；Extrac-tor（V）4.00；SourceTemperature（℃）110；Desolva-tionTemperature（℃）350；ConeGasFlow（L·h-1）46；DesolvationGasFlow（L·h-1）500；GasCellPira-niPressure（Pa）0.3；

檢測方式：全掃描，結(jié)果顯示其母離子[M-1]的m/z為446.90，與木犀草苷相對分子質(zhì)量448一致，子離子[M-1]的m/z為285.10，木犀草苷脫去糖苷后的質(zhì)量數(shù)為286，與檢測到的子離子一致，說明檢測到的成分是木犀草苷。

2、線性關(guān)系考察

精密量取上述對照品溶液1，2，3，5，10μL，分別按上述色譜條件進(jìn)行測定，以木犀草苷進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：

A=45.04C-0.078r=0.9999

3、精密度試驗結(jié)果

研究者取相同批次溶液，之后進(jìn)行不間斷的進(jìn)樣，共6次，結(jié)果顯示木犀草苷峰面積達(dá)到了1.4%，這足以證明進(jìn)樣具有非常好的精度。

4、重復(fù)性試驗結(jié)果

研究者首先選擇相同批次的清熱解毒口服液樣品，共量取5份，測定樣品，結(jié)果顯示這5份樣品溶液中，木犀草苷的平均含量為4.2μg.ml-1，木犀草苷峰面積達(dá)到了1.9%，這足以證明高效液相色譜法具有非常好的重現(xiàn)性。

5、穩(wěn)定性試驗結(jié)果

研究者首先選擇相同批次的清熱解毒口服液樣品，共量取5份，測定樣品，測定時間分別為0h、4h、8h、12h、20h、24h，最終顯示木犀草苷峰面積達(dá)到了1.3%，這足以證明清熱解毒口服液樣品中的木犀草苷在24h保持著比較穩(wěn)定的狀態(tài)。

6、加樣回收率試驗結(jié)果

精密量取已知木犀草苷含量（4.19μg·mL-1）的清熱解毒口服液樣品12.5mL，共6份，每份精密加入木犀草苷對照品溶液（36.6μg·mL-1）1mL，按上述方法制備所需溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果木犀草苷的平均回收率（n= 6）為99.8%，RSD為3.4%。

7、樣品測定結(jié)果

取不同廠家的清熱解毒口服液，按上述方法制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣測定，用外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表1。

四、結(jié)論

首先，測定之前的方法選擇。因為熱解毒口服液構(gòu)成成分比較復(fù)雜，共有12味中草藥材，這些藥材再通過多道加工程序才獲得，成分非常復(fù)雜，因此會對HPLC法造成比較大的干擾，不能夠直接進(jìn)樣。這樣不僅會對色譜柱造成非常大的污染，也會導(dǎo)致色譜峰疊加，出現(xiàn)明顯的分離情況。研究者使用了不同種類的填料進(jìn)行除雜試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚酰胺柱具有非常好的除雜效果。研究者不同種類的洗脫溶劑進(jìn)行了除雜試驗研究，結(jié)果表明本文所應(yīng)用的洗脫溶劑效果的確非常好。

其次，對檢測波長進(jìn)行選擇。研究者取木犀草苷對照品溶液，使用紫外分光光度展開掃描，掃描范圍為200-400nm，最終波長在350nm吸收效果最好。研究者又借助液相色譜儀進(jìn)行測定，溶液的確是在350nm處擁有最佳的吸收率。所以研究者決定將350nm看作是檢測波長。

最后，流動相的選擇。因為清熱解毒口服液成分比較多，也比較復(fù)雜，所以研究者選擇使用了多種流動相系統(tǒng)以及多種梯度洗脫程序來進(jìn)行試驗研究，結(jié)果顯示此次研究所選擇應(yīng)用的AgilentZorbaxSB C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以0.2%磷酸（A）-乙腈（B）為流動相流動相效果最佳，具有非常好的分離效果，分離度也達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)要求。

綜上研究可以發(fā)現(xiàn)，清熱解毒口服液生產(chǎn)廠家不同，所使用的藥材不同，生產(chǎn)過程中所使用的工藝不同，導(dǎo)致了中木犀草苷的含量的差異，為了保證中清熱解毒口服液擁有比較好質(zhì)量，可以選擇使用本文使用的測定方法。

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