日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)組織蛋白酶D基因克隆及表達(dá)分析

張曼 ，程光平，蘇永全，徐伊樺，馮文榮，王軍，宋曉紅，毛勇

(1. 廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實驗室，廣西 南寧 530005；2. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005)

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日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)組織蛋白酶D基因克隆及表達(dá)分析

張曼1，2，程光平1，蘇永全2*，徐伊樺2，馮文榮2，王軍2，宋曉紅2，毛勇2

(1. 廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實驗室，廣西 南寧 530005；2. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005)

摘要：組織蛋白酶D是溶酶體天冬氨酸蛋白酶家族的主要成員，廣泛參與動物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過程，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常代謝具有重要的作用。為研究組織蛋白酶D在甲殼動物非特異性免疫和幼體發(fā)育過程中的作用，本研究采用RACE技術(shù)首次克隆得到日本囊對蝦組織蛋白酶D基因cDNA序列，命名為MjCatD，其中開放閱讀框長為1 161 bp，編碼386個氨基酸殘基。序列分析和同源建模顯示該基因編碼的蛋白含有保守的N-糖基化位點(diǎn)、天冬氨酸蛋白酶簽名序列、酶活化位點(diǎn)和非消化性組織蛋白酶D的特征序列，并且呈保守的雙葉形結(jié)構(gòu)。同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，MjCatD與斑節(jié)對蝦、美洲螯龍蝦和脊尾白蝦相似性較高，并且與它們緊密聚為一支。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，MjCatD基因在日本囊對蝦多個組織中均有表達(dá)，其中肝胰腺中表達(dá)量最高。在白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus， WSSV)感染后3～24 h日本囊對蝦肝胰腺中MjCatD的表達(dá)量逐漸下降，而在48 h急劇上調(diào)至最高表達(dá)量并且與對照組差異極顯著(P<0.01)。此外，MjCatD基因在幼體發(fā)育不同階段中也表現(xiàn)出明顯的變化趨勢。以上研究表明，MjCatD基因可能參與日本囊對蝦先天免疫反應(yīng)和幼體發(fā)育過程。

關(guān)鍵詞：日本囊對蝦；組織蛋白酶D；基因克隆；基因表達(dá)

1引言

日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亞目(Natantia)、對蝦科(Penaeidae)、囊對蝦屬(Marsupenaeus)，是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蝦類。然而，近年來日本囊對蝦養(yǎng)殖深受病害的困擾，尤其是白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)嚴(yán)重影響了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

組織蛋白酶是真核細(xì)胞溶酶體中參與蛋白降解和抗原呈遞的蛋白酶超家族，根據(jù)活性位點(diǎn)里氨基酸殘基的不同可大致分為3類：半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶[2—3]。組織蛋白酶D是天冬氨酸蛋白酶家族的主要成員，通常以前酶原的形式合成于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后轉(zhuǎn)移至高爾基體進(jìn)行多次蛋白質(zhì)水解切割，最后得到分子量約為40 kDa的活性酶[4]。

組織蛋白酶D廣泛存在于各種生物體中，屬于酸性溶酶體內(nèi)切蛋白酶，能夠水解胞內(nèi)蛋白和多肽，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[5]。在人和哺乳動物中，組織蛋白酶D參與激活酶原和生長因子、大腦抗原呈遞、表皮分化及細(xì)胞凋亡等多種機(jī)體生理活動[6]。近年來對水產(chǎn)動物組織蛋白酶D的報道主要集中在硬骨魚類，發(fā)現(xiàn)其還與免疫應(yīng)答、卵泡發(fā)育和成熟及胚胎發(fā)育等有著一定的關(guān)聯(lián)[7—9]。而組織蛋白酶D在低等無脊椎動物如甲殼動物中的研究較少，僅在斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)、美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)和脊尾白蝦(Palaemoncarinicauda)等3個物種中發(fā)現(xiàn)[10—11]，目前尚未見到日本囊對蝦組織蛋白酶D基因的研究報道。

本研究采用RACE技術(shù)成功獲得日本囊對蝦組織蛋白酶D(MjCatD)基因cDNA序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)和三維結(jié)構(gòu)分析。通過實時熒光定量PCR初步研究了WSSV感染后MjCatD基因在日本囊對蝦肝胰腺中的表達(dá)特征及其在幼體發(fā)育不同階段的表達(dá)變化，為進(jìn)一步探索日本囊對蝦組織蛋白酶D生物學(xué)功能提供依據(jù)。

2材料與方法

2.1實驗材料及取樣

攻毒實驗用日本囊對蝦采自福建省東山縣赤山茂鑫水產(chǎn)有限公司的養(yǎng)殖基地，體長(8.72±0.59)cm，體質(zhì)量(7.88±1.28)g，蓄養(yǎng)于2.5 m×2 m×1.5 m水泥池，期間持續(xù)充氣和正常投喂，日換水1/4體積。隨機(jī)挑選個體均勻、活力強(qiáng)的蝦，經(jīng)巢式PCR檢測確定無病毒后用于感染實驗。新鮮WSSV病毒懸液(108粒子/μL)由國家海洋局第三海洋研究所楊豐研究員提供，實驗前用0.9%無菌生理鹽水稀釋104倍。實驗組和對照組日本囊對蝦均為50尾，前者每尾在第4腹節(jié)部位注射100 μL病毒稀釋液(約106個拷貝)，后者每尾注射等體積的0.9 %無菌生理鹽水。注射前隨機(jī)取4尾健康對蝦抽取血淋巴，800×g，4℃離心 5 min收集血淋巴細(xì)胞，同時收集肝胰腺、鰓、腸、胃、眼柄、心和肌肉等組織樣品；注射后實驗組和對照組分別于3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取肝胰腺，每個時間點(diǎn)取樣3尾。以上組織迅速置于液氮保存?zhèn)溆?，用?RNA 的提取。

日本囊對蝦親蝦捕自臺灣海峽南部(福建東山)自然海域，體長(18.72±0.75)cm，體質(zhì)量(80.63±8.34)g。適應(yīng)性暫養(yǎng)1周后，挑選1尾已經(jīng)交配、性腺發(fā)育良好且附肢完整的健康日本囊對蝦為實驗用親蝦，以鑷燙法摘除單側(cè)眼柄并逐日提高水溫至25℃，5～7 d后移至單獨(dú)的產(chǎn)卵池。產(chǎn)卵池水溫保持27～28℃，待受精卵孵化出無節(jié)幼體，按育苗標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行日常管理。從蚤狀幼體開始投喂餌料：蚤狀幼體至仔蝦第10天(P10)每隔4 h投喂一次蝦片，P10后改投喂粒徑合適的福星牌顆粒飼料。育苗期間，分別取4期(N)無節(jié)幼體、1期(Z1)、2期(Z2)、3期(Z3)蚤狀幼體、1期(M1)、2期(M2)、3期(M3)糠蝦幼體，以及第1天至第17天(P1、P2、P3、P4、P5、P8、P11、P14、P17)仔蝦樣品，迅速置于液氮保存，用于 RNA 的提取。

2.2實驗方法

2.2.1總RNA提取及cDNA的合成

提取日本囊對蝦各組織總RNA，微量紫外分光光度計與1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量和完整度。用于基因擴(kuò)增的cDNA第一鏈的合成參照孫田田等[12]的方法制備。

2.2.2 cDNA克隆及序列測定

根據(jù)3種已知蝦類CatD基因序列的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物CatD-F1/R1(表1)，以稀釋10倍的日本囊對蝦肝胰腺cDNA為模板進(jìn)行中間片段擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化和克隆后送至深圳華大基因公司測序。以獲得的MjCatD部分序列為模板，分別設(shè)計5′和3′-RACE引物CatD-5′、CatD-3′(表1)，合成5′和3′-RACE cDNA模板，分別使用特異性引物和通用引物配對，擴(kuò)增目的基因并測序。

2.2.3生物信息學(xué)分析

用DNAStar軟件中的SeqMan程序去除重疊序列并進(jìn)行序列拼接；用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性比對；ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)分析開放閱讀框并預(yù)測氨基酸序列；以Expasy程序(http://web.expasy.org/protparam/)在線預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，用SignalP 4.1程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽序列，以SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1)預(yù)測蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，用NetNGlyc l.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測可能存在的糖基結(jié)合位點(diǎn)，用ClustalW對氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對。運(yùn)用MEGA 4.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置重復(fù)500次計算各分支的置信度；Swiss-model(http://beta.swissmodel.expasy.org/)工具在線模擬蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，應(yīng)用PyMOL 1.5軟件查看模型與標(biāo)注[13]。

表1　實驗所用引物

圖2　日本囊對蝦MjCatD序列同源性分析Fig.2　Homology analysis of MjCatD sequenceA. MjCatD氨基酸序列與其他物種CatD氨基酸序列比對。一致的氨基酸殘基用黑底白字表示，結(jié)構(gòu)保守性氨基酸殘基以粗體黑字加方框表示；2個天冬氨酸蛋白酶簽名序列由實框標(biāo)出，其中的催化基序用菱形(◆)表示；酶活化位點(diǎn)用下劃線表示；非消化性組織蛋白酶D特征序列由虛框標(biāo)出；2個N-糖基化位點(diǎn)用黑色箭頭標(biāo)注。 B. 基于CatD氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ樹)。根據(jù)多序列比對結(jié)果，MEGA4.0軟件以鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。標(biāo)尺長度為0.05，設(shè)置重復(fù)500次計算各分支的置信度，日本囊對蝦CatD用菱形(◆)表示A.Multiple alignments of amino acid sequence of MjCatD with other species. Shading indicated residues that are identical (black background-white lettered) whereas black letter in black box indicates higher levels of amino acid similarity. Two solid boxed area represent the aspartyl protease signature sequence and the catalytic motif is marked with ◆. The active site is underlined. The characteristic sequence of non-digestive cathepsin Ds is enclosed by a dashed box. Two N-glycosylation sites are represented by the black arrow. B. Phylogenetic tree (NJ) based on CatD amino acid sequences. The tree is constructed by the neighbor-joining (NJ) algorithm using the MEGA 4.0 program based on the multiple sequence alignments. The scale bar corresponds to 0.05 estimated amino-acid substitutions per site. The reliability of the branching is tested by bootstrap re-sampling (500 pseudo-replicates). The ca-thepsin D from M. japonicus is marked with ◆

2.2.4MjCatD基因的表達(dá)分析

根據(jù)獲得的MjCatD cDNA序列設(shè)計一對qRT-PCR特異性引物CatD-RT-F/R(表1)，以日本囊對蝦β-actin(AB055975.1)作為內(nèi)參基因，設(shè)計引物β-actin-F/R(表1)。參照SYBR?Premix Dimer EraserTM(TaKaRa)試劑盒的操作說明進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，所有擴(kuò)增均在ABI 7900實時PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBR?Premix Dimer EraserTM(2×)10 μL，引物(10 μmol/L)各0.6 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序采用3步法，即升溫95℃ 30 s；40個循環(huán)：95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；熔解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，進(jìn)而判斷PCR反應(yīng)的特異性。

每個組織樣品重復(fù)3次，同時設(shè)置陰性對照。數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法，用SPSS11.0軟件對不同樣本的表達(dá)量進(jìn)行配對t檢驗，差異性顯著分析結(jié)果以P值表示，P<0.05為顯著差異，P<0.01為顯著極差異。

3實驗結(jié)果

3.1MjCatD基因序列特征分析

RACE擴(kuò)增產(chǎn)物拼接后，獲得日本囊對蝦CatD基因的部分cDNA序列，命名為MjCatD(GenBank登錄號：KF900154)。MjCatD序列共1 325 bp，包括完整開放閱讀框(ORF)1 161 bp，部分5′非編碼區(qū)域(UTR)43 bp和部分3′UTR(121 bp)。其中，ORF編碼386個氨基酸，理論分子量和等電點(diǎn)分別為42.0 KDa和6.23，包含信號肽(Met1-Glu17)、前體域(Leu18-Arg45)和成熟域(Gln64-Lys386)3部分(圖1A)。進(jìn)一步分析顯示MjCatD成熟肽的理論分子量和等電點(diǎn)分別為34.9 KDa和5.12，不穩(wěn)定指數(shù)為39.94，是一種穩(wěn)定蛋白。

MjCatD一級結(jié)構(gòu)包含2個N-糖基化位點(diǎn)(Asn120和Asn255)、2個天冬氨酸蛋白酶簽名序列(-80VVFDTGSSNLWV91-，-268AIADTGTSLIAA279-)和1個酶活化位點(diǎn)(-125DIQYGSGSLSG135-)(圖1A)?；谕唇?，以豬胃蛋白酶(2psg.1.A)X-射線結(jié)構(gòu)為模板，日本囊對蝦CatD呈現(xiàn)出高度保守的雙葉形結(jié)構(gòu)，其中在酶活化位點(diǎn)兩側(cè)各自環(huán)繞著1個保守的催化基序(-83DTGS86-，-271DTGT274-)，并且1個以聚脯氨酸環(huán)空間結(jié)構(gòu)形式存在的非消化性組織蛋白酶D特征序列(-350DVPPPMGP357-)也分布在酶活化位點(diǎn)附近[14](圖1B)。

3.2MjCatD基因序列同源性分析

通過與斑節(jié)對蝦(P.monodon，ABQ10738.1)、脊尾白蝦(P.carinicauda，AGJ03549.1)、美洲海螯蝦(H.americanus，ACV53024.1)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum，XP_966517.1)、鼎突多刺蟻(Polyrhachisvicina，AEC03508.1)、大珠母貝(Pinctadamaxima，AEI58896.1)、企鵝珍珠貝(Pteriapenguin，AEI58895.1)、文昌魚(Branchiostomafloridae，XP_002599971.1)、尖吻鱸(Latescalcarifer，ABV59077.1)、小家鼠(Musmusculus，NP_034113.1)和人(Homosapiens，NP_001900.1)CatD蛋白的同源比對結(jié)果顯示，日本囊對蝦CatD較為保守，與其他物種的CatD有較高的同源性(圖2A)。MjCatD與斑節(jié)對蝦的同源性最高(97%)，其次是脊尾白蝦和美洲螯龍蝦，同源性依次為87%、83%，而與脊椎動物如硬骨魚類、兩棲動物、鳥類和哺乳動物的一致性較低，僅為55%～57%。

將上述物種與四紋豆象(Callosobruchusmaculatus，ACO56332.1)、達(dá)氏按蚊(Anophelesdarlingi，ETN60836.1)、埃及伊蚊(Aedesaegypti，XP_001657556.1)、長牡蠣(Crassostreagigas，XP_011440854.1)、櫛孔扇貝(Azumapectenfarreri，ACL13150.1)、紅鰭東方魨(Takifugurubripes，NP_001072052.1)、斑點(diǎn)雀鱔(Lepisosteusoculatus，XP_006642526.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis，BAC57431.1)、原雞(Gallusgallus，NP_990508.1)的CatD蛋白和MjCatD進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示組織蛋白酶D可分為脊椎動物和無脊椎動物兩大類群：脊椎動物類群包括硬骨魚類、兩棲動物、鳥類和哺乳動物，無脊椎動物類群則由甲殼動物、昆蟲類和軟體動物組成。MjCatD首先與斑節(jié)對蝦、脊尾白蝦和美洲螯龍蝦等甲殼動物的CatD基因聚類，再與昆蟲類、軟體動物相聚，說明它們進(jìn)化關(guān)系較近，隨后與脊椎動物聚合(圖2B)。

3.3MjCatD基因的表達(dá)分析

3.3.1MjCatD基因在不同組織中的表達(dá)

以β-actin為內(nèi)參基因，對日本囊對蝦肝胰腺、肌肉、腸、血淋巴細(xì)胞、鰓、心臟、眼柄和胃等8個組織中的MjCatD基因進(jìn)行相對表達(dá)量分析，如圖3所示，MjCatD基因在8個組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在肝胰腺的相對表達(dá)量最高，其次為血淋巴細(xì)胞，在鰓、肌肉、胃、腸和心臟中也有一定量的表達(dá)，在眼柄中的表達(dá)水平最低。

圖3　MjCatD基因在日本囊對蝦不同組織中的表達(dá)情況Fig.3　Expression characterization of MjCatD in various tissues of M.japonicus以β-actin為內(nèi)參基因，血淋巴細(xì)胞的表達(dá)量為校正樣進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，柱狀圖代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差Kuruma shrimp β-actin served as an internal control to calibrate the cDNA template for all the samples. Tissue mRNA expression values were presented relative to that of the haemocyte. The bars indicated the means ± SE

圖4　日本囊對蝦肝胰腺M(fèi)jCatD基因在WSSV感染不同時間相對表達(dá)量的變化Fig.4　The relative expression of MjCatD gene in the hepatopancreas of M. japonicus infected by WSSV at different time以β-actin為內(nèi)參基因，柱狀圖代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同一時間，與對照組相比，*代表組間差異顯著(P<0.05)，**代表組間差異極顯著(P<0.01)Kuruma shrimp β-actin served as an internal control to calibrate the cDNA template for all the samples. The bars indicated the means ± SE. The significant differences of MjCatD expression between the challenged groups and the con-trol were indicated by asterisks (*: P<0.05; **: P<0.01)

圖5　日本囊對蝦MjCatD基因在不同幼體發(fā)育階段相對表達(dá)量的變化Fig.5　The relative expression of MjCatD gene at different stages of larval development in M. japonicus以β-actin為內(nèi)參基因，無節(jié)幼體的表達(dá)量為校正樣進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，柱狀圖代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。不同字母代表組間差異顯著(P<0.05)，相同字母代表組間差異不顯著(P>0.05)。N：無節(jié)幼體；Z1～Z3：蚤狀幼體1～3期；M1～M3：糠蝦幼體1～3期；P1～P17：仔蝦第1～17天Kuruma shrimp β-actin served as an internal control to calibrate the cDNA template for all the samples. The mRNA expression value in each development stage was presented relative to that of the nauplius. The bars indicated the means ± SE. Statistical significance was represented by different letters (P<0.05)， whereas same letters indicated no significant differences (P>0.05). N: nauplius; Z1-Z3: zoea 1-3; M1-M3: mysis 1-3; P1-P17: postlarvae 1-17

3.3.2MjCatD基因在WSSV感染后的表達(dá)變化

日本囊對蝦在感染W(wǎng)SSV后，肝胰腺中MjCatD基因的表達(dá)時序變化見圖4，與對照組相比，實驗組在感染早期(0～24 h)表達(dá)量逐漸降低并在24 h降至最低點(diǎn)，之后在48 h表達(dá)量急劇升高，達(dá)到最大值并且與對照組差異極顯著(P<0.01)，感染后期(72～96 h)基因表達(dá)量恢復(fù)至正常水平。對照組MjCatD基因總體表達(dá)變化趨勢較為平緩，均無明顯顯著變化。

3.3.3MjCatD基因在幼體發(fā)育階段的表達(dá)變化

MjCatD基因在日本囊對蝦不同幼體發(fā)育階段的表達(dá)量差異明顯，如圖5所示，MjCatD mRNA從無節(jié)幼體開始表達(dá)，到Z1開口攝食后，MjCatD mRNA的相對表達(dá)量逐步增高，然后在P1到P3階段有明顯的下調(diào)；而后，從P4開始MjCatD mRNA的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢，并且P8至P17時期表達(dá)量維持在較高水平。

4討論

本研究首次克隆得到日本囊對蝦CatD基因序列，完整開放閱讀框全長1 161 bp，編碼386個氨基酸。序列特征和同源性分析顯示，CatD在從無脊椎動物到脊椎動物的進(jìn)化上較為保守，MjCatD與已知3種蝦類的CatD高度相似，由信號肽、前體域和成熟域3個部分組成，并且具有天冬氨酸蛋白酶典型的2個簽名序列、1個酶活化位點(diǎn)、1個非消化性組織蛋白酶D特征序列和雙葉形空間結(jié)構(gòu)，是天冬氨酸蛋白酶家族新成員[10—11，14]。研究表明組織蛋白酶D在胞漿中合成后，會被糖基化然后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)移途徑定位到溶酶體，N-糖基化位點(diǎn)在此過程中起關(guān)鍵作用[15]。本文通過比較發(fā)現(xiàn)，MjCatD的第1個N-糖基化位點(diǎn)(Asn120)在各物種間非常保守，第2個N-糖基化位點(diǎn)(Asn255)與斑節(jié)對蝦、脊尾白蝦、美洲螯龍蝦和企鵝珍珠貝一致，而在其他物種中缺失或被替代，糖基化位點(diǎn)保守程度的差異可能與其在糖基化過程中發(fā)揮作用的不同有關(guān)[7]。

組織蛋白酶D是一種內(nèi)切蛋白酶，能夠降解蛋白以清除多余的胞內(nèi)蛋白，廣泛存在于真核生物的幾乎所有細(xì)胞[16—17]。熒光定量PCR結(jié)果表明，日本囊對蝦MjCatD基因在8種組織中均有表達(dá)，組織分布的廣泛性說明其對維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及正常代謝的重要性。此外，日本囊對蝦肝胰腺和血淋巴細(xì)胞中的MjCatD基因表達(dá)量較高，這與脊尾白蝦組織蛋白酶D組織表達(dá)情況相似[11]，考慮到上述兩種組織在蝦類非特異性免疫中的重要作用[18]，MjCatD基因的高表達(dá)量表明它可能與免疫響應(yīng)密切相關(guān)。

隨后的WSSV感染實驗顯示，肝胰腺中MjCatD基因表現(xiàn)出先降低后顯著上升，然后恢復(fù)的趨勢。WSSV經(jīng)肌肉注射侵入機(jī)體后，主要經(jīng)血液循環(huán)侵染到其他組織器官，然后在這些部位感染細(xì)胞進(jìn)行增殖[19]，其約在22～24 h完成整個繁殖周期，并且病毒基因組復(fù)制速率在12～24 h達(dá)到最高[20]。在這段時間中，一些宿主細(xì)胞的能量代謝可能被病毒調(diào)節(jié)并利用[20—21]，受此影響MjCatD基因的表達(dá)受到抑制，表達(dá)水平逐漸降低。然而，伴隨著肝胰腺受到病毒感染程度的加深以及新病毒粒子的不斷裝配釋放[22]，越來越多的細(xì)胞裂解死亡并最終導(dǎo)致宿主體內(nèi)激發(fā)大規(guī)模的免疫響應(yīng)。與脊尾白蝦EcCatD的表達(dá)變化相同[11]，WSSV刺激后48 h MjCatD表達(dá)水平顯著上調(diào)，考慮到CatD在抗原呈遞、細(xì)胞凋亡等過程中的重要作用[23—24]，推測MjCatD很可能直接參與了機(jī)體免疫防御過程。隨著時間的推移，MjCatD基因表達(dá)量在72 h和96 h恢復(fù)至正常水平。MjCatD基因在日本囊對蝦感染W(wǎng)SSV后的表達(dá)變化預(yù)示其可能在抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用，但具體的作用機(jī)制還需深入研究。

諸多研究表明組織蛋白酶D不僅參與先天免疫響應(yīng)，還在機(jī)體生長發(fā)育過程中具有重要作用。在金頭鯛(Sparusaurata)和草魚(Ctenopharyngodonidella)的胚胎發(fā)育時期，組織蛋白酶D表達(dá)量均呈上升趨勢，研究認(rèn)為它可能通過介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡參與機(jī)體發(fā)育[8—9]。本研究選取無節(jié)幼體、蚤狀幼體、糠蝦幼體和仔蝦等4個發(fā)育階段，對MjCatD基因在日本囊對蝦幼體發(fā)育過程中的作用進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)在早期發(fā)育時期即從無節(jié)幼體到糠蝦幼體階段，MjCatD基因表達(dá)量顯著上升，且維持在較高的表達(dá)水平。由于此階段日本囊對蝦幼體外部形態(tài)發(fā)生較大變化，細(xì)胞增殖生長及代謝速率達(dá)到最高水平，存在著強(qiáng)烈的能量轉(zhuǎn)換[25]，推測MjCatD mRNA表達(dá)的上調(diào)與幼體形態(tài)發(fā)育和旺盛的細(xì)胞代謝有關(guān)。經(jīng)歷早期快速發(fā)育時期后，日本囊對蝦在仔蝦第一周時食性和消化系統(tǒng)發(fā)生改變，發(fā)育速率也降至較低水平，生長放緩[25—27]，相應(yīng)的MjCatD基因表達(dá)量顯著下調(diào)。隨后，日本囊對蝦在P8～P10左右時期由浮游生活轉(zhuǎn)為底棲生活，期間需要尋找合適的棲息地，與之相適應(yīng)的重要生理結(jié)構(gòu)也在快速發(fā)育，故在生活習(xí)性的轉(zhuǎn)變過程中需要消耗大量能量，機(jī)體新陳代謝速率較快[26，28]。由此，本階段MjCatD基因的高量表達(dá)可能與生活習(xí)性轉(zhuǎn)變和形態(tài)發(fā)育有關(guān)，同時也是應(yīng)對仔蝦后期高耗能的一種適應(yīng)策略。

綜上所述，MjCatD作為一種重要的溶酶體天冬氨酸蛋白酶，推測其參與了日本囊對蝦先天免疫反應(yīng)和幼體發(fā)育過程，并且發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果為研究組織蛋白酶D在蝦類免疫和生長發(fā)育中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)，但關(guān)于其在這兩種過程中的具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu Haipeng， S?derh?ll K， Jiravanichpaisal P. Antiviral immunity in crustaceans[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2009， 27(2): 79-88.

[2]Honey K， Rudensky A Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation[J]. Nature Reviews Immunology， 2003， 3(6): 472-482.

[3]Hsing L C， Rudensky A Y. The lysosomal cysteine proteases in MHC class Ⅱ antigen presentation[J]. Immunological Reviews， 2005， 207(1): 229-241.

[4]Liaudet-Coopman E， Beaujouin M， Derocq D， et al. Cathepsin D: newly discovered functions of a long-standing aspartic protease in cancer and apoptosis[J]. Cancer Letters， 2006， 237(2): 167-179.

[5]曾廣智， 譚寧華， 賈銳銳， 等. 組織蛋白酶及其抑制劑研究進(jìn)展[J]. 云南植物研究， 2005， 27(4): 337-354．

Zeng Guangzhi， Tan Ninghua， Jia Ruirui， et al. Cathepsins: structures， functions and inhibitors[J]. Acta Botanica Yunnanica， 2005， 27(4): 337-354.

[6]張志林， 肖蓉， 李慶偉. 組織蛋白酶D的功能多樣性[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報， 2014， 30(7): 647-654.

Zhang Zhilin， Xiao Rong， Li Qingwei. Diversified functions of cathepsin D[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2014， 30(7): 647-654.

[7]Choi K M， Shim S H， An C M， et al. Cloning， characterisation， and expression analysis of the cathepsin D gene from rock bream (Oplegnathusfasciatus)[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2014， 40(1): 253-258.

[8]Carnevali O， Centonze F， Brooks S， et al. Molecular cloning and expression of ovarian cathepsin D in seabream，Sparusaurata[J]. Biology of Reproduction， 1999， 61(3): 785-791.

[9]Dong Zhongdian， Zhang Jiao， Ji Xiangshan， et al. Molecular cloning， characterization and expression of cathepsin D from grass carp (Ctenopharyngodonidella)[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2012， 33(5): 1207-1214.

[10]Rojo L， Sotelo-Mundo R， García-Carreo F， et al. Isolation， biochemical characterization， and molecular modeling of American lobster digestive cathepsin D1[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology， 2010， 157(4): 394-400.

[11]段亞飛， 劉萍， 李吉濤， 等. 脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)組織蛋白酶D基因的克隆及其表達(dá)分析[J]. 海洋與湖沼， 2013， 44(3): 599-605.

Duan Yafei， Liu Ping， Li Jitao， et al. Cloning and expression of cathepsin D gene inExopalaemoncarinicauda[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica， 2013， 44(3): 599-605.

[12]孫田田， 蘇永全， 洪婧妮， 等. 真蛸熱休克蛋白90基因(HSP90)的克隆及表達(dá)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2012， 36(9): 1367-1375.

Sun Tiantian， Su Yongquan， Hong Jingni， et al. Molecular cloning and feature analysis of heat shock protein 90 (HSP90) fromOctopusvulgaris[J]. Journal of Fisheries of China， 2012， 36(9): 1367-1375.

[13]Schwede T， Kopp J， Guex N， et al. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server[J]. Nucleic Acids Research， 2003， 31(13): 3381-3385.

[14]Xiao Rong， Zhang Zhilin， Wang Hongyan， et al. Identification and characterization of a cathepsin D homologue from lampreys (Lampetrajaponica)[J]. Developmental & Comparative Immunology， 2015， 49(1): 149-156.

[15]Fortenberry S C， Schorey J S， Chirgwin J M. Role of glycosylation in the expression of human procathepsin D[J]. Journal of Cell Science， 1995， 108(5): 2001-2006.

[16]Margaryan N V， Kirschmann D A， Lipavsky A， et al. New insights into cathepsin D in mammary tissue development and remodeling[J]. Cancer Biology & Therapy， 2010， 10(5): 457-466.

[17]Masson O， Prébois C， Derocq D， et al. Cathepsin-D， a key protease in breast cancer， is up-regulated in obese mouse and human adipose tissue， and controls adipogenesis[J]. PLoS One， 2011， 6(2): e16452.

[18]Gross P S， Bartlett T C， Browdy C L， et al. Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the Pacific White Shrimp，Litopenaeusvannamei， and the Atlantic White Shrimp，L.setiferus[J]. Developmental & Comparative Immunology， 2001， 25(7): 565-577.

[19]朱建中， 陸承平. 對蝦白斑綜合征病毒射陽株的分離及其在螯蝦體內(nèi)的動態(tài)分布[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2002， 25(3): 75-79.

Zhu Jianzhong， Lu Chengping. Isolation and dynamic distribution of white spot syndrome virus Sheyang strain in crawfishes[J]. Journal of Nanjing Agricultural University， 2002， 25(3): 75-79.

[20]Chen I T， Aoki T， Huang Y T， et al. White spot syndrome virus induces metabolic changes resembling the warburg effect in shrimp hemocytes in the early stage of infection[J]. Journal of Virology， 2011， 85(24): 12919-12928.

[21]Chang P S， Lo C F， Wang Y C， et al. Identification of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimpPenaeusmonodonbyinsituhybridization[J]. Diseases of Aquatic Organisms， 1996， 27(2): 131-139.

[22]Zhang Man， Mao Yong， Wang Jun， et al. Molecular characterization and expression analysis of a novel dual-CRD C-type lectin in kuruma shrimp (Marsupenaeusjaponicus)[J]. Acta Oceanologica Sinica， 2015， 34(2): 74-83.

[23]Zuzarte-Luis V， Montero J A， Kawakami Y， et al. Lysosomal cathepsins in embryonic programmed cell death[J]. Developmental Biology， 2007， 301(1): 205-217.

[24]Cho J H， Park I Y， Kim H S， et al. Cathepsin D produces antimicrobial peptide parasinⅠfrom histone H2A in the skin mucosa of fish[J]. The FASEB Journal， 2002， 16(3): 429-431.

[25]Laubier-Bonichon A， Van Wormhoudt A， Sellos D. Croissance larvaire contrlée dePenaeusjaponicusBate. Enzymes digestives et changements de régimes alimentaires[C]// Proceedings of the 3rd Meeting of the I.C.E.S. Working Group on Mariculture. Brest， France， 1977: 131-145．

[26]Lemos D， Hernndez-Cortés M P， Navarrete A， et al. Ontogenetic variation in digestive proteinase activity of larvae and postlarvae of the pink shrimpFarfantepenaeuspaulensis(Crustacea: Decapoda: Penaeidae)[J]. Marine Biology， 1999， 135(4): 653-662.

[27]Ribeiro F， Jones D. Growth and ontogenetic change in activities of digestive enzymes inFenneroPenaeusindicuspostlarvae[J]. Aquaculture Nutrition， 2000， 6(1): 53-64.

[28]Mourente G， Medina A， Gonzlez S， et al. Variations in lipid content and nutritional status during larval development of the marine shrimpPenaeuskerathurus[J]. Aquaculture， 1995， 130(2/3): 187-199.

收稿日期：2015-12-15；

修訂日期：2016-03-31。

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-47)；廣西自然科學(xué)基金項目(2015GXNSFBA139066)。

作者簡介：張曼(1986—)，女，山東省禹城市人，講師，主要從事甲殼動物非特異性免疫研究。E-mail：sdyczm@163.com *通信作者：蘇永全，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事海洋生物遺傳育種研究。E-mail：yqsu@xmu.edu.cn

中圖分類號:Q95

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0253-4193(2016)08-0052-10

Molecular cloning and expression analysis of cathepsin D from kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus)

Zhang Man1，2， Cheng Guangping1， Su Yongquan2， Xu Yihua2， Feng Wenrong2， Wang Jun2，Song Xiaohong2， Mao Yong2

(1.GuangxiCollegesandUniversitiesKeyLaboratoryofAquaticHealthyBreedingandNutritionRegulation，CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530005，China; 2.CollegeofOceanandEarthSciences，XiamenUniversity，Xiamen361102，China)

Abstract:Cathepsin D is the principal member of lysosomal aspartic proteinase family which participates in various degradations of intracellular protein and plays important roles in normal metabolism for the maintenance of cellular homeostasis. In this current study， the cDNA sequence of kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus) cathepsin D (MjCatD) was cloned for the first time through RACE technology， including a 1 161 bp open reading frame encoding 386 amino acids. Both sequence analysis and homology modeling revealed that the deduced protein of MjCatD contained well conserved N-glycosylation site， aspartic proteinase signature sequence， active site and the characteristic sequence of non-digestive cathepsin D， as well as presented a conserved bilobal structure. MjCatD shared high similarity with those from Penaeus monodon， Homarus americanus， Palaemon carinicauda， and clustered together with above three cathepsin Ds. Real-time quantitative PCR demonstrated that MjCatD was ubiquitously expressed in all the examined tissues， predominantly in hepatopancreas. After challenging with white spot syndrome virus (WSSV)， the expression level of MjCatD in the hepatopancreas was gradually down regulated during 3 h to 24 h， then very significantly increased (P<0.01) and peaked at 48 h compared to the control. MjCatD also showed obvious changes during different larval stages. These findings indicated that MjCatD may play key roles in the innate immune response and larval development of kuruma shrimp．

Key words:Marsupenaeus japonicus; cathepsin D; gene cloning; gene expression

張曼，程光平，蘇永全，等. 日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)組織蛋白酶D基因克隆及表達(dá)分析[J].海洋學(xué)報，2016，38(8)：52-61， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.006

Zhang Man， Cheng Guangping， Su Yongquan， et al. Molecular cloning and expression analysis of cathepsin D from kuruma shrimp (Marsupenaeusjaponicus) [J]. Haiyang Xuebao，2016，38(8)：52-61， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.006