海洋球石藻(Emiliania huxleyi)通用表達載體的構建與電轉化

王薛婷，郭強強，蔡藝欽，陳志福，李健，劉靜雯*

(1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門361021)

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海洋球石藻(Emiliania huxleyi)通用表達載體的構建與電轉化

王薛婷1，郭強強1，蔡藝欽1，陳志福1，李健1，劉靜雯1*

(1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門361021)

摘要：海洋球石藻Emiliania huxleyi是一種全球廣泛分布的真核浮游植物，該種不僅是海洋碳、硫循環(huán)和全球氣候變化的重要指示物種，而且能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝生物活性物質(zhì)，在生物技術領域也具有很好的應用前景。本文通過分析氨芐青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、鏈霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7種常用抗生素對海洋球石藻生長的影響，確定G418可作為該藻陽性轉化藻株的抗性篩選試劑，其對應的抗性基因neo則作為該藻表達載體構建中的抗性篩選標記。在此基礎上克隆了綠色熒光蛋白基因gfp、抗性標記基因neo及E. huxleyi BOF92內(nèi)源性巖藻黃素-葉綠素a/c結合蛋白基因的啟動子fcp，以pUC18為基礎載體，構建了pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo兩個重組表達載體，以電轉化方法共轉化球石藻細胞并結合選擇性固體培養(yǎng)基篩選，成功獲得了被轉化的球石藻細胞。海洋球石藻遺傳轉化系統(tǒng)的建立為進一步開展該種相關的基礎生物學研究及其在生物技術領域的應用奠定了基礎。

關鍵詞：海洋球石藻；通用表達載體；neo標記基因；電轉化

1引言

海洋微藻是海洋生物的重要餌料來源之一，具有種類多、繁殖快、數(shù)量大等特點，是海洋生物資源的重要組成部分。許多海洋微藻能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝活性物質(zhì)，可用于食品、醫(yī)藥、能源及化工領域，特別是有些海洋微藻細胞中總脂類的含量可高達80%(干質(zhì)量)，在脂類生物活性物質(zhì)及能源開發(fā)利用中具有很好的前景和優(yōu)勢[1—4]。微藻遺傳工程是操縱微藻代謝通路的強有力工具，利用基因工程改造微藻生物代謝途徑，可大大提高目標活性物質(zhì)的合成和積累[5—8]。

海洋球石藻Emilianiahuxleyi是一種全球廣泛分布且具有重要生態(tài)功能的真核微型浮游植物。其獨特的生物礦化作用和高產(chǎn)DMSP能力已成為影響全球碳、硫生物地化循環(huán)及氣候變化的一個關鍵物種[9]。除此之外，該種還能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝生物活性物質(zhì)，在生物技術研究領域具有廣闊的應用前景。如，能有效合成和累積Ω-3長鏈多元不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)，具有防止心血管疾病等藥理功能；能夠合成大量聚酮類化合物，具有良好的抗菌、抗蟲、抗腫瘤等生物學活性[10—11]。

自然海域中，某些海洋球石藻E.huxleyi能夠被其特異的dsDNA病毒感染，且病毒感染和裂解被確認是終止該藻赤潮的一個重要因素。海洋球石藻E.huxleyiCCMP1516及其特異性裂解病毒EhV86的全基因組測序注釋結果顯示，該藻擁有類似于其他生物完整的鞘脂類物質(zhì)生物合成途徑；而令人驚奇的是，EhV86基因組中存在編碼一系列可能參與宿主鞘脂類合成途徑的多種酶的基因[12—14]。病毒與宿主基因組間可能通過基因橫向轉移而共享這些代謝酶并可能在一定程度上掌控了宿主鞘脂類代謝，大量合成、積累病毒新型鞘脂類物質(zhì)并誘導宿主細胞凋亡[15—16]。然而，盡管病毒與宿主具有非常相似的鞘脂類代謝調(diào)控系統(tǒng)，但病毒與宿主基因組中同源基因表達的酶在鞘脂類代謝途徑中并不具有完全同源的功能[13，16]。病毒基因組中這些酶在宿主鞘脂類代謝途徑中的確切位置及功能目前尚不清楚?；诤Ｑ笄蚴錏.huxleyi及其特異性病毒的全基因組已被全部測序和注釋，通過建立該藻的遺傳轉化系統(tǒng)，可從分子水平深入研究病毒與宿主間復雜的相互作用關系，特別是病毒介導的宿主鞘脂類代謝調(diào)控機制；同時，在此基礎上可以采用基因工程技術改造球石藻鞘脂類合成代謝途徑的關鍵環(huán)節(jié)，以期通過病毒介導的鞘脂類代謝過程合成新型的鞘脂類活性物質(zhì)。目前，有關海洋球石藻E.huxleyi遺傳轉化系統(tǒng)的研究國內(nèi)外尚未見報道。

本研究以海洋球石藻E.huxleyiBOF92(Eh-BOF92)為材料，通過抗生素抗性基因篩選、啟動子及標記基因的克隆，構建用于海洋球石藻的通用表達載體，建立適合該藻的電轉化方法及固體培養(yǎng)基篩選方法，構建該藻的遺傳轉化系統(tǒng)，為進一步開展海洋球石藻E.huxleyi相關的基礎生物學研究及其在生物技術領域的應用奠定基礎。

2材料與方法

2.1實驗材料

2.1.1海洋球石藻

實驗用海洋球石藻E.huxleyi為Eh-BOF92株系，分離自挪威海域，由挪威卑爾根大學生物系Gunnar Bratbak教授贈送并保存于本實驗室。

2.1.2菌種和試劑

Top10大腸桿菌(本實驗室保存)，pUC18基礎載體、pMD-19T(TaKaRa公司產(chǎn)品)，pGFP載體(攜帶綠色熒光蛋白gfp基因，由中國海洋大學潘克厚教授贈送)，pSELECT質(zhì)粒(攜帶抗性基因neo，購自廈門泰京生物科技有限公司)。

氨芐青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、鏈霉素、新生霉素、嘌呤霉素、G418、X-gal(鷺隆生物科技有限公司)，ExTaq○R Hot Start Version試劑盒，限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ、PstⅠ、SacⅠ、EcoR Ⅰ、XbaⅠ)、T4DNA連接酶、rTaq酶、DNA marker(TaKaRa公司產(chǎn)品)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒；MES(2-N-嗎啉代-乙磺酸)、Hepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)(上海生工BBI分裝)；甜菜堿為美國Sigma公司產(chǎn)品；瓊脂糖為西班牙進口分裝；MES-NaOH緩沖液(2-N-嗎啉代-乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液，0.5 mol/L，pH5.5)；Hepes (4-羥乙基哌嗪乙磺酸)電極緩沖液(0.080 mol/L KCl，0.005 mol/L CaCl2，0.2 mol/L甘露醇，0.2 mol/L山梨酸，0.01 mol/L Hepes，pH 7.2)，球石藻固體培養(yǎng)基所用瓊脂糖為Sigma Aldrich產(chǎn)品；PCR引物合成及基因測序均由英俊捷基(廣州)貿(mào)易有限公司完成。

2.2實驗方法

2.2.1微藻生長及抗生素篩選

液體培養(yǎng)采用70%海水配置的f/2-Si培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)采用70%海水配置的f/50培養(yǎng)基[17]，瓊脂糖濃度為1.5%(Sigma Aldrich)。培養(yǎng)條件為：溫度16℃，光照強度40 μmol/(m2·s)，光周期為14L∶10D(光∶暗)。

將對數(shù)期的藻種接種于50 mL的三角瓶中，接種量為20 mL，起始細胞密度約為1×104cell/mL，然后加入不同濃度的抗生素(表1)，抗生素濃度梯度由多次預實驗確定，每個濃度設置3個平行組，培養(yǎng)條件同上。每24 h取樣一次，每次取樣200 μL，用盧氏碘液固定樣品，血球計數(shù)板計數(shù)細胞密度。

2.2.2引物設計

基于抗生素篩選實驗結果，G418作為球石藻適宜抗性篩選標記，其對應的抗性基因為neo。分別根據(jù)質(zhì)粒pSELECT和pGFP中的neo和gfp基因序列設計特異引物，根據(jù)E.huxleyiCCMP1516全基因組信息(http://genome.jgi-psf.org/Emihu1.home.html)查找球石藻基因組中巖藻黃素-葉綠素a/c結合蛋白基因的啟動子序列，設計特異性引物。利用PLACE 數(shù)據(jù)庫(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioniformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對E.huxleyi內(nèi)源性fcp啟動子序列中的順式作用元件、增強子和阻遏因子等進行預測和分析。分別以質(zhì)粒pSELECT，pGFP及Eh-BOF92基因組為模板擴增抗性基因neo、報告基因gfp和啟動子基因fcp。采用CTAB法提取海洋球石藻基因組DNA[18]。采用GeneDoc軟件和Primer Premier 5.0軟件設計引物，本研究所用引物見表2。

表1　液體培養(yǎng)基中7種抗生素的實驗濃度

表2　本實驗所用引物

2.2.3Neo， gfp及fcp基因的擴增

所有PCR反應均分別在25 μL反應體系中進行。Neo/gfp基因(無菌ddH2O 17.2 μL，rTaq DNA聚合酶0.3 μL，模板1 μL，引物F和R各1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL)的擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃ 30 s，58℃/52℃ 30 s，72℃ 60 s，擴增30個循環(huán)，72℃延伸10 min；啟動子fcp基因(無菌ddH2O 11.05 μL，rTaq DNA聚合酶0.3 μL，模板1 μL，引物F和R各1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，5% DMSO 5 μL，5 mol/L Betaine 1.25 μL)的擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，擴增30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用TIANGEN通用DNA純化試劑盒回收各段PCR產(chǎn)物，連接到載體pMD19-T(16℃，8 h)。采用熱激法轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選、質(zhì)粒小抽、PCR及雙酶切驗證、測序。

2.2.4雙元表達載體的構建

以pUC18為基礎載體，重組表達載體pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo的構建過程如圖1a、1b所示。用質(zhì)粒PCR和雙酶切方法驗證載體構建成功后分別提取質(zhì)粒pUC18-fcp-neo和pUC18-fcp-gfp進行共轉化。

圖1　雙元表達載體pUC18-fcp-gfp(a)和pUC18-fcp-neo(b)的構建過程圖Fig.1　Construction of plasmids pUC18-fcp-gfp (a) and pUC18-fcp-neo (b)

2.2.5重組質(zhì)粒的電轉化及陽性藻株的篩選

采用電轉化方法進行共轉化(電轉儀為美國BTX，ECM830)。離心收集處于對數(shù)生長期的藻液100 mL(1 500×g，4℃，5 min)，將收集的細胞沉淀重懸于5 mL MES-NaOH緩沖液中，置于16℃培養(yǎng)箱反應2 h，離心，棄廢液，用Hepes電極緩沖液洗滌細胞1次，離心，棄廢液。將細胞重新懸于Hepe緩沖液中，調(diào)整藻細胞密度為5×107cells/mL，再加入上述兩種重組質(zhì)粒充分混勻(重組質(zhì)粒的終濃度均分別為10 μg/mL)，用1 mL寬口吸頭充分混勻，冰浴15 min，以備電擊。吸取100 μL混合液，加入到0.2 cm冰浴的點擊杯中。根據(jù)臨界電場強度計算海洋球石藻細胞的臨界電場強度[19]，結果得出：球石藻理論臨界電場強度約為1 333～4 444 V/cm，因此電場強度范圍設置為1 600～4 000 V/cm，變化梯度為200 V/cm；電擊時間范圍為1.0～4.0 ms，變化梯度為1.0 ms，最終確定最佳電場強度和電擊時間，提高轉化效率。電擊后的樣品冰浴10 min，然后轉移到10 mL不含G418抗生素的培養(yǎng)基中，靜止恢復培養(yǎng)24 h(連續(xù)光照)，再向培養(yǎng)基中加入抗生素G418(終濃度為100 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞轉化情況(日本Olympus，BX51)。低速離心濃縮細胞，涂布于含有G418(終濃度為100 μg/mL)抗性的f/50固體選擇性培養(yǎng)基中(設置野生型對照組)，倒置平板進行培養(yǎng)，觀察微藻克隆的生長情況。

3結果

3.1海洋球石藻Eh-BOF92對各種抗生素的敏感性

綜合分析本研究所用的7種抗生素對海洋球石藻Eh-BOF92生長影響結果如圖2所示。不同濃度的氨芐青霉素、卡那霉素及鏈霉素對海洋球石藻生長均無明顯抑制作用，表明該藻對上述3種抗生素不敏感；而不同濃度的氯霉素和新生霉素對海洋球石藻生長均有一定程度的抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用增強，當濃度大于等于100 μg/mL時，細胞停止生長，可見球石藻Eh-BOF92對氯霉素和新生霉素有一定的敏感性；不同濃度的嘌呤霉素和G418對球石藻Eh-BOF92生長均具有顯著的抑制作用，但抑制程度不同，當濃度大于等于25 μg/mL時，在含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第10天致使細胞徹底死亡，而在含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)至第3天即可導致細胞全部死亡，可見球石藻Eh-BOF92對G418的抑制作用非常敏感，因此G418可作為該藻陽性轉化藻株的抗性篩選試劑，其對應的抗性基因neo則作為該藻表達載體構建中的抗性篩選標記。

圖2　7種抗生素對海洋球石藻E. huxleyi BOF92生長的影響Fig.2　Effects of seven antibiotics on the growth of E. huxleyi BOF92

3.23種功能元件的PCR擴增結果

分別以pSELECT質(zhì)粒、pGFP質(zhì)粒和海洋球石藻E.huxleyiBOF92基因組為模板，PCR擴增及測序驗證獲得的目的基因片段大小分別為：neo/797 bp、gfp/717 bp和fcp/483 bp(圖3)，測序驗證結果正確。

圖3　3種功能元件neo， fcp和gfp基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3　Agarose gel electrophoresis of neo， fcp and gfp genes cloninga. M 為 100 bp DNA 分子量標記，泳道1為 neo (797 bp) 基因的PCR產(chǎn)物；b. M 為 100 bp DNA 分子量標記，泳道1為 gfp(717 bp) 基因的PCR產(chǎn)物； c. M 為100 bp DNA分子量標記， 泳道1為 fcp(483 bp) 基因的PCR產(chǎn)物a. M represents 100 bp DNA Ladder Marker， line 1 PCR product of neo(797 bp)； b. M represents 100 bp DNA Ladder Marker， line 1 PCR product of gfp(717 bp)； c. M represents 100 bp DNA Ladder Marker， line 1 PCR product of fcp(483 bp)

圖4　海洋球石藻E. huxleyi BOF92 fcp啟動子基因預測結果Fig.4　Prediction results of the promoter fcp gene in E. huxleyi BOF92

3.3海洋球石藻Eh-BOF92內(nèi)源性fcp啟動子序列的分析

利用在線生物信息學軟件對Eh-BOF92內(nèi)源性fcp啟動子483 bp序列中的順式作用元件、增強子和阻遏因子等進行了預測分析(圖4)。該啟動子序列含有豐富的順式作用元件，除含有基本的順式作用元件TATA-box和CAAT-box外，還包含有光響應順式作用元件MNF1、Sp1以及MeJA響應能力相關的順式作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif[20—21]，胚乳表達需要的順式作用元件Skn-1-motif[20]，胚乳表達相關的順式作用元件GCN4-motif[22]，分生組織表達相關的順式作用元件CAT-box[23]，生理節(jié)奏控制相關的順式作用元件Circadian[24]，此外還存一些未命名的順式作用元件如CCCCGG和CTCC等。大量啟動子順式作用元件的存在，說明本研究所選擇的Eh-BOF92內(nèi)源性fcp啟動子序列具有潛在的強啟動子活性，可用于調(diào)控內(nèi)源或外源基因的表達。

3.4海洋球石藻雙元真核表達載體成功構建確認

分別將構建的重組質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp(圖1a)和pUC18-fcp-neo(圖1b)轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10，經(jīng)過PCR和雙酶切鑒定，結果表明雙元重組表達載體構建成功(圖5a，5b)。

圖5　重組質(zhì)粒pUC18-gfp-fcp(a)和pUC18-fcp-neo(b)雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5　Agarose gel electrophoresis of the digest products of the recombinant plasmids pUC18-fcp-gfp (a) and pUC18-fcp-neo (b)M1為λ-Hind Ⅲ 酶切片段分子量標記；M2為100 bp DNA 分子量標記. 泳道1分別為重組質(zhì)粒pUC18-gfp (a) 和pUC18-fcp (b) ；泳道2分別為Sal Ⅰ+Pst Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pUC18-gfp后的產(chǎn)物(a) 和Sac Ⅰ+EcoR Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pUC18-fcp后的產(chǎn)物 (b)；泳道3分別為以重組質(zhì)粒pUC18-gfp為模板(a) 和的以重組質(zhì)粒pUC18-fcp為模板(b)的PCR產(chǎn)物；泳道4分別為重組質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp (a) 和重組質(zhì)粒pUC18-fcp-neo (b)；泳道5分別為Sac Ⅰ+EcoR Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp和BamH Ⅰ+Xba Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pUC18-fcp-neo后的產(chǎn)物；泳道6分別為以重組質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp為模板(a)和重組質(zhì)粒pUC18-fcp-neo為模板(b)的PCR產(chǎn)物M1 representsλ-Hind Ⅲ digest DNA Marker; M2 represents 100 bp DNA Ladder Marker. line 1 pUC18-gfp (a) and pUC18-fcp recombinant plasmids; line 2 pUC18-gfp/Sal Ⅰ+Pst Ⅰ and pUC18-fcp/Sac Ⅰ+EcoR Ⅰ; line 3 PCR product of the pUC18-gfp (a) and pUC18-fcp (b) recombinant plasmids; line 4 pUC18-fcp-gfp (a) and pUC18-fcp-neo(b) recombinant plasmids; line 5 pUC18-fcp-gfp / Sac Ⅰ+EcoR Ⅰ (a) and pUC18-fcp-neo / BamH Ⅰ+Xba Ⅰ (b) ; line 6 PCR products of the pUC18-fcp-gfp (a) and pUC18-fcp-neo (b) recombinant plasmids

圖6　海洋球石藻E. huxleyi BOF92電擊轉化培養(yǎng)1周后于光學顯微鏡下的觀察結果Fig.6　The microscopical photographs of E. huxleyi BOF92 by electroporation and culturing for one weeka.光學顯微鏡觀察結果；b.熒光顯微鏡觀察結果(480 nm) a. Light microscopical photograph; b. fluorescent microscopical photograph(480 nm)

圖7　野生型(a)和轉化的海洋球石藻E. huxleyi BOF92(b)在含有G418(100 g/mL)選擇性固體培養(yǎng)基上的篩選生長結果Fig.7　The cultures of wild-type (a) and transgenic E.huxleyi BFO92 cells (b) streaked on the G418 (100 g/mL) containing medium after electroporation 20 days (f/50 medium)

3.5電擊法成功轉化海洋球石藻BOF92

本文參考Muto等的方法[19]，對海洋球石藻的電轉化條件進行摸索。將構建好的含有抗性基因neo的質(zhì)粒pUC18-fcp-neo和含有報告基因gfp的質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp共轉化海洋球石藻細胞，將電擊后的E.huxleyi細胞置于不含抗生素G418的液體培養(yǎng)基中，在連續(xù)光照條件下培養(yǎng)24 h，經(jīng)過一段時間恢復后再向培養(yǎng)液中加入G418(終濃度為100 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)1周，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉化情況。結果顯示E.huxleyi培養(yǎng)液中存在發(fā)綠色熒光的藻細胞(圖6)，說明轉化組的藻細胞中同時含有gfp基因和neo基因并實現(xiàn)了瞬時表達。將在選擇性液體培養(yǎng)基中生長的藻細胞離心(1 300×g，4℃，2 min)濃縮后(8×107cells/mL)，取1 mL涂布到固體選擇性培養(yǎng)基上(G418終濃度為100 μg/mL)，于16℃培養(yǎng)，1周后可見白色陽性藻克隆的形式，3周后形成具有色素的藻克隆(圖7)。

4討論

選擇標記是微藻遺傳轉化系統(tǒng)的關鍵元素之一。常用于微藻篩選轉化子的選擇壓力試劑有氯霉素、G418、卡那霉素、潮霉素等，但不同的海洋真核微藻對各種抗生素的敏感性不同。例如杜氏鹽藻對鏈霉素、卡那霉素、潮霉素和G418不敏感，而對氯霉素高度敏感[25]；橢圓小球藻對氯霉素、鏈霉素、卡那霉素不敏感，對潮霉素較敏感，而對G418表現(xiàn)出高度敏感性[26]；金藻對潮霉素、G418和氯霉素有點敏感，對腐草霉素家族的Zeocin最為敏感[27]。目前人們已在許多模式藻株中進行抗生素敏感性研究，建立了一些模式藻株的選擇標記基因。其中適用于萊茵衣藻的有氨基葡萄糖苷腺苷轉移酶基因addA、乙酰乳酸合成酶基因Als、核糖體蛋白S14基因及氨基糖苷磷酸轉移酶基因aphVⅢ等[28—31]；適用于三角褐指藻的有氯霉素乙酰轉移酶基因cat、諾爾絲菌素乙酰轉移酶基因nat、鏈絲菌素乙酰轉移酶基因Sat-I、shble蛋白基因及草銨膦基因bar等[32—35]。目前，有關海洋球石藻E.huxleyi基因工程選擇標記篩選的研究國內(nèi)外尚未見報道，基于上述已有的研究報道，本研究選擇了常見的7種抗生素用于海洋球石藻生長抗性的篩選。G418是一種氨基糖苷類抗生素，其通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)的合成，對原核和真核等生物細胞都有毒性。在真核微藻遺傳轉化系統(tǒng)中，攜帶有抗性基因neo的轉基因藻株具有G418抗性[36]。本研究結果顯示，海洋球石藻對G418和嘌呤霉素均高度敏感，但嘌呤霉素價格昂貴、毒性較強且目前尚未報道其作為基因工程藻株的選擇標記使用。因此，從抗生素對細胞的敏感程度、所使用抗生素的劑量、經(jīng)濟效益以及細胞對抗生素的耐受程度等方面綜合考慮，我們選擇G418作為海洋球石藻基因工程藻株的選擇標記，其抗性基因neo可以作為構建海洋球石藻真核表達載體的選擇標記基因。綠色熒光蛋白gfp基因作為報告基因已廣泛用于各種海藻遺傳工程及亞細胞定位研究[37—38]，與其他報告基因相比，gfp結構穩(wěn)定，對細胞的生理毒害小且保留時間較長。本研究結果顯示在轉化的球石藻細胞中gfp基因至少在培養(yǎng)的7 d左右仍能有效表達，因此gfp基因可作為球石藻基因工程藻株構建中一種良好的報告基因。

一個強的啟動子是真核微藻遺傳轉化系統(tǒng)的必要元件，以確保外源基因高效轉錄。硅藻的內(nèi)源性巖藻黃素-葉綠素a/c結合蛋白與高等植物和綠藻類的葉綠素a/b結合蛋白(CAB)的功能相同，主要在轉錄水平調(diào)控基因的表達。三角褐指藻內(nèi)源性巖藻黃素-葉綠素a/c結合蛋白基因啟動子fcp在硅藻及其他幾種海洋微藻中都能有效促使基因高效表達，如在三角褐指藻遺傳轉化系統(tǒng)中，采用內(nèi)源性fcp強啟動子能夠融合sat-I、nptⅡ、uidA和gfp等蛋白并穩(wěn)定表達外源基因[3，33，39—40]。fcp啟動子序列同源性比對發(fā)現(xiàn)，不同真核微藻來源的fcp序列具有較高的同源性和保守性，說明來源于不同真核微藻的fcp啟動子序列具有類似的功能。Eh-BOF92內(nèi)源性啟動子fcp序列含有豐富的順式作用元件如TATA-box和CAAT-box，說明該內(nèi)源性fcp啟動子序列具有潛在的強啟動子活性，可用于調(diào)控內(nèi)源或外源基因的表達(圖4)。通過電擊法對Eh-BOF92細胞進行電轉化，控制光照周期14L∶10D(光∶暗)條件下進行培養(yǎng)。在外界選擇壓力G418的作用下，Eh-BOF92轉化組細胞內(nèi)源性fcp啟動子調(diào)控neo基因的表達從而確保陽性細胞株正常生長。在G418選擇性液體和固體培養(yǎng)基上可以篩選到陽性藻株的生長，表明neo及gfp基因在球石藻細胞內(nèi)實現(xiàn)了瞬時的穩(wěn)定表達，Eh-BOF92內(nèi)源性fcp啟動子能夠高效轉錄外源基因。

合適的轉化方法也是外源基因能否在真核微藻細胞內(nèi)穩(wěn)定表達的關鍵因素之一。目前已經(jīng)建立了許多轉化真核微藻細胞的方法，主要有玻璃珠法、農(nóng)桿菌轉染法、基因槍法、超聲波轉化法和電擊轉化法等。電擊轉化法作為真核微藻遺傳轉化常用方法之一，已成功運用于多種微藻，如萊茵衣藻、小球藻、普通小球藻、紅藻和雨生紅球藻等[3]。一般情況下，電擊轉化微生物、植物和動物細胞時使用環(huán)狀或超螺旋質(zhì)粒能夠獲得更高的轉化效率，而使用線性化質(zhì)粒轉化能夠提高外源基因整合到宿主細胞基因組中的幾率，更易獲得穩(wěn)定轉化子，但線性化質(zhì)粒轉化效率極低且更易被細胞內(nèi)的核酸酶消化。真核微藻電擊轉化時高純度質(zhì)粒有利于獲得較高的轉化效率。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀質(zhì)粒轉化后，外源基因能夠在細胞內(nèi)瞬時表達，也存在整合到基因組中的幾率，但大部分攜帶外源基因的環(huán)狀質(zhì)粒會隨著細胞的分裂而稀釋，導致質(zhì)粒丟失。本研究采用高純度的環(huán)狀質(zhì)粒進行轉化，轉化后第7天在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)綠色熒光的藻細胞，并在選擇性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周左右長出具色素的藻克隆(圖7)，說明該環(huán)狀質(zhì)粒至少能在該藻細胞內(nèi)存在近一個月以上，或也有少量質(zhì)粒整合到了基因組上。另外，如何將外源基因和篩選標記基因同時導入微藻細胞，在操作上有兩種策略可以選擇：一是外源基因與篩選標記基因一起構建在同一個載體上[41]；另一個策略是將外源基因和篩選標記基因分別構建在不同載體上，然后兩種質(zhì)粒以共轉化方式轉化微藻[34]。我們比較了單轉化和共轉化，發(fā)現(xiàn)兩者之間的轉化效率沒有明顯差別，同時考慮到將來在構建轉基因藻株時，如果將將眾多元件同時克隆在一個啟動子下游，可能會影響外源基因的整合與表達，因此本研究選擇了雙元載體共轉化方法。

電場強度是影響電擊轉化效率的重要因素之一。電場強度過高或過低都未能獲得較高的轉化效率，原因是在單位電擊距離內(nèi)，電壓過高對細胞傷害較大，影響細胞存活率；電壓過低則不易在細胞膜表面產(chǎn)生短暫的可恢復小孔，外源基因很難進入細胞。針對本實驗材料Eh-BOF92優(yōu)化或的電轉化條件為：電場強度為2 000 V/cm、電擊時間為2 ms/次、共電擊2次時，轉化效率達到0.07%。在1 000 V/cm，2 ms的電擊條件下轉化萊茵衣藻細胞壁缺失的突變體細胞，獲得了1 000個轉化子/106個細胞的高轉化效率[42]。相比之下，球石藻轉化效率比萊茵衣藻低很多，原因可能是由于本實驗用的球石藻Eh-BOF92細胞表面覆含豐富的球石粒而導致細胞膜未能與質(zhì)粒DNA充分接觸。盡管在電擊轉化之前采用MES-NaOH緩沖液處理細胞表面，但反應時間過短或過長都將影響轉化效率高低。反應時間過短，球石藻表面的球石粒處理不徹底導致外源基因很難與細胞膜接觸而難于穿過細胞膜；反應時間過長則影響細胞活性，導致細胞死亡而使轉化效率較低。此外，由于球石藻E.huxleyi生活史中具有二倍體和單倍體世代，兩個不同時期的細胞大小存在差異也可能是導致轉化效率較低的原因。細胞大小存在差異將導致理論電場強度不同，最終將影響轉化效率較低。本文雖然是一個初步的研究，但作為具有重要生態(tài)學意義和生物技術應用前景的一種重要的海洋微藻，建立并進一步優(yōu)化該海洋球石藻的遺傳轉化系統(tǒng)將為后續(xù)一系列科學研究提供了良好的基礎。

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收稿日期：2015-12-11；

修訂日期：2016-03-03。

基金項目：國家自然科學基金(41576166)；福建省科技重點項目(2015Y0039)；廈門市南方海洋研究中心項目(14GZP71NF35)。

作者簡介：王薛婷(1991—)，女，山西省臨汾市人，主要從事海洋微生物分子生物學研究。E-mail:xuetingw1991@163.com *通信作者：劉靜雯(1965—)，女，山西省太原市人，教授，主要從事海洋微生物資源開發(fā)利用研究。E-mail：ljwsbch@163.com, jwliu@jmu.edu.cn

中圖分類號:Q78

文獻標志碼：A

文章編號：0253-4193(2016)08-0103-12

Construction of expression vector and transformation via electroporation in coccolithophore Emiliania huxleyi

Wang Xueting1， Guo Qiangqiang1， Cai Yiqin1， Chen Zhifu1， Li Jian1， Liu Jingwen1

(1.CollegeofFoodandBioengineering，JiMeiUniversity，Xiamen361021，China)

Abstract:The marine coccolithophore Emiliania huxleyi is a eukaryotic microalga species crucial to the study of global biogeochemical cycles and climate modeling and also much of interest to those in biotechnology due to the capable of abundant bioactive metabolites production. Here， seven different kinds of antibiotics including ampicillin， kanamycin， G418， chloramphenicol， streptomycin， novobiocin and puromycin were used for the screening of antibiotic resistance. G418 was chosen most suitable selective antibiotics and the corresponding resistance gene “neo” as the marker for E. huxleyi genetic system. The promoter of the endogenic fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein gene “fcp” was cloned from E. huxleyi BOF92 strain. A construct was made containing the green fluorescent protein reporter gene “gfp” and screened G418 resistance gene “neo”. The resultant recombinant transformation vectors pUC18-fcp-gfp and pUC18-fcp-neo were co-transferred into E. huxleyi by electroporation. Transformants were obtained upon G418 selection. The results presented the new genetic transformation system for E. huxleyi， providing additional genetic resource with potential for exploring basic biological questions and biotechnological applications.

Key words:Emiliania huxleyi; vector construction; neo marker gene; electroporation

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Wang Xueting， Guo Qiangqiang， Cai Yiqin， et al. Construction of expression vector and transformation via electroporation in coccolithophoreEmilianiahuxleyi[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(8)：103—114， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.011