反相離子對色譜法測定不同茶葉中茶氨酸

蔡金巖，趙唯雯，黃漢昌，2，姜招峰，2，常 平，2

（1.北京聯(lián)合大學應(yīng)用文理學院保健食品功能檢測中心，北京 100191；2.北京聯(lián)合大學生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

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反相離子對色譜法測定不同茶葉中茶氨酸

蔡金巖1，趙唯雯1，黃漢昌1，2，姜招峰1，2，常 平1，2

（1.北京聯(lián)合大學應(yīng)用文理學院保健食品功能檢測中心，北京 100191；2.北京聯(lián)合大學生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

［摘 要］建立一種可適用于不同品種的茶及茶葉制品中茶氨酸含量的高效液相色譜法。特點是通過在傳統(tǒng)流動相中添加離子對試劑（1-癸烷磺酸鈉），以改進不同加工方式的茶葉中茶氨酸測定過程中極性強、保留差、抗干擾能力弱等問題。流動相：0.005 mol/L癸烷磺酸鈉水溶液（含0.05%三氟乙酸）∶乙腈=75∶25（v/v），色譜柱：C18（5 μm，250×4.6 mm），流速：1.0 mL/min，檢測波長：203 nm，柱溫：35℃，進樣體積：10 μL。茶氨酸在0.05 mg/mL到0.50 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為1.996 ng，定量限為7.984 ng，回收率為102.2%，精密度為0.7%。本方法適用于多品種茶葉中茶氨酸含量的測定，操作簡便，分離快速，結(jié)果準確。

［關(guān)鍵詞］茶氨酸；離子對色譜法；高效液相色譜法；茶

L-茶氨酸（L-theanine，γ-glutamylethylamide），屬于酰胺類化合物（N-乙基-r-谷氨酰胺），極易溶于水，為茶葉中特有的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，其含量直接影響茶葉的品質(zhì)，是茶葉中的主要呈味物質(zhì)之一。同時，將茶氨酸視為茶葉中的主要活性成分之一，其藥理學研究已經(jīng)深入開展多年，主要集中在其抗焦慮［1-2］和集中精神［3］等作用。另一方面，茶氨酸對神經(jīng)中樞系統(tǒng)具有保護作用，能夠提高學習記憶［4］和免疫能力，并減輕炎癥反應(yīng)［5］等，這些作用已經(jīng)得到研究的充分肯定。因此，無論是對茶葉的品質(zhì)分析，還是以茶氨酸為主要的營養(yǎng)素補充劑或者功能食品進行研發(fā)，均需要對茶氨酸進行準確的定量分析。先后出現(xiàn)了紙層析分光光度法［6］、毛細管電泳法［7］、拉曼光譜分析法［8］和高效液相色譜法等［9-11］，但應(yīng)用最為廣泛的還是利用高效液相色譜法測定茶葉中的茶氨酸含量。但是由于茶氨酸的極性較強，茶葉品種繁多，而且產(chǎn)地和加工工藝的差異也比較大，各種復雜的因素給茶氨酸的定量測定帶來一定的困難，很難達到滿意的分離效果。

本文擬建立一種適用性更廣、相對簡便易操作的高效液相色譜分析方法。通過向反相流動相中添加離子對試劑（癸烷磺酸鈉）來改善茶氨酸在反相柱上保留能力差的問題，同時可以滿足多種茶葉中茶氨酸含量分析的要求。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

三氟乙酸（色譜純，美國SIGMA），1-癸烷磺酸鈉（色譜純，美國 Fisher），乙腈（色譜純，美國Fisher），L-茶氨酸標準品（純度>98.0%，東京化成工業(yè)株式會社）。

樣品1～4分別為市場購置的袋泡茶（綠茶）、鐵觀音、紅茶、白茶。

1.2主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（Waters 2695-2996系統(tǒng)），電子分析天平，電熱板，超純水機。

1.3色譜條件

色譜柱:C18柱（5 μm，250×4.6 mm），流動相:0.005 mol/L癸烷磺酸鈉水溶液（含0.05% TFA）∶乙腈=75∶25（v/v），流速:1.0 mL/min，檢測波長:203 nm，柱溫:35℃，進樣體積:10 μL。

1.4樣品處理

稱取樣品1.0 g（精確至0.1 mg）于50 mL容量瓶中，加入新煮沸的超純水約30 mL，搖勻，放至常溫后以超純水定容，混合均勻后，茶湯均用0.45 μm濾膜過濾，濾液待測。

1.5線性關(guān)系及最低檢出限實驗

稱取適量茶氨酸標準品，以超純水溶解定容，配制成標準儲備液。測定前以超純水稀釋不同濃度的茶氨酸標準溶液，在上述色譜條件下進行測定，制作標準曲線。

經(jīng)10次空白流動相進樣，獲得基本噪音值。在此基礎(chǔ)上，分別測定S/N=3及S/N=10下的茶氨酸最低檢出限。

1.6精密度實驗

同日內(nèi)平行稱取6份茶葉樣品1，進行方法精密度實驗，按1.4的方法進行樣品處理，液相分析結(jié)果。

1.7回收率實驗

稱取4份適量樣品1至10 mL容量瓶中，其中2份加入茶氨酸標準儲備液，并按1.4的方法進行樣品處理，液相分析結(jié)果。

2　結(jié)果和討論

2.1流動相的選擇

有研究顯示，采用流動相為三氟乙酸水溶液（pH=3）進行樣本的分離測定，但是由于茶氨酸具有較強極性，茶氨酸在色譜柱上很快就被洗脫出來，保留時間約為3.5 min，并且色譜峰發(fā)生輕微變形（如圖1中A所示）。

為了改善峰形，嘗試采用少量有機溶劑，即10%乙腈TFA水溶液（pH3）作為流動相。峰形有所改善，但茶氨酸在色譜柱上的保留行為依然沒有改進，反而提前至2.45 min，有可能會給樣品分離帶來更大困難（如圖1中B所示）。

在此種情況之下，實驗采用了1-癸烷磺酸鈉作為離子對試劑加入到流動相中，并對離子對試劑、水、三氟乙酸（TFA）、乙腈的比例進行調(diào)整，得到較滿意結(jié)果（如圖1中C所示）。

通過以上比對實驗，加入離子對試劑后，再適當調(diào)整流動相比例即可獲得比較滿意的保留時間和峰形。在此條件下測定了樣品1～4，茶氨酸得到良好的分離（如圖2所示）。

2.2線性關(guān)系及最低檢出限實驗

線性實驗結(jié)果表明:L-茶氨酸濃度在0.05 mg/mL～0.5 mg/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。回歸方程為:y=1.13×107x+2.21×104，R2= 0.999 9，如圖3所示。

檢出限結(jié)果為S/N=3時，檢出限為1.996 ng；S/N=10時，定量限為7.984 ng。

2.3方法精密度實驗

實驗結(jié)果表明，經(jīng)多次重復，精密度良好，表明測定結(jié)果可靠（如表1所示）。

表1　方法的精密度結(jié)果Table 1 Precision of the analyzed method results

2.4方法的回收率測定

4份樣品同時進行樣品測定，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，該方法的回收率穩(wěn)定，其間無含量損失。

表2　方法的回收率結(jié)果Table 2 Recoveries of the analyzed method

2.5樣品測定

在本實驗條件下測定了4種不同種類的茶葉樣品，茶氨酸均得到良好的分離（如圖2所示），測定結(jié)果準確，結(jié)果如表3所示。

表3　不同樣品茶氨酸的測定結(jié)果Table 3 Results of L-theanine in different samples

3　結(jié)束語

本實驗成功建立了利用高效液相色譜法測定茶葉中茶氨酸含量的分析方法，可適用于不同加工方法的茶葉樣本，該方法精密度高、回收率良好、結(jié)果準確。同時，本實驗的特色是利用反相離子對色譜法，把離子對試劑添加到流動相中，使被分析的樣品離子在流動相中與離子對試劑生成不帶電的中性離子對，從而增加了樣品離子在非極性固定相中的溶解度，使分離系數(shù)增加，改善了分離效果，加大了抗干擾的能力。在其他較復雜的樣品測定中，只需要根據(jù)樣品中雜質(zhì)的干擾程度，適當調(diào)整乙腈的比例，就可達到茶氨酸與雜質(zhì)有效分離的目的。而且本次研究使樣品處理過程變得簡單，不需要對茶氨酸進行衍生處理，避免了操作的復雜性和不穩(wěn)定性，適用的樣品范圍更加廣泛，可以為茶葉類食品及保健食品的分析檢測提供有效幫助。

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（責任編輯 柴 智）

RPIC Determination of L-Theanine in Different Tea

CAI Jin-yan1，ZHAO Wei-wen1，HUANG Han-chang1，2，JIANG Zhao-feng1，2，CHANG Ping1，2
（1.Testing Center of Health Food Function Determination，College of Applied Arts and Science of Beijing Union University，Beijing 100191，China；2.Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Food，Research Institute of Science and Technology of Functional Food，Beijing Union University，Beijing 100191，China）

Abstract:L-theanine（L-theanine，γ-glutamylethylamide），belonging to the amide（N-ethyl-r-glutamine），easily soluble in water，is a kind of peculiar non-protein amino acid.It is a common content that directly affects the quality and taste of tea，can relieve the bitter tea taste.Theanine has many beneficial effects，such as the effect of central nervous system has been fully studied，also the role of lowering blood pressure and anti tumor effect etc..However，fast detection method for the level of L-theanine in tea is not available for now.Based on the above reasons，a RP-HPLC method for the determination of L-theanine was set up，and detailed by adding ion pair reagent（1-decane sodium sulfonate）into the traditional RP mobile phase.Mobile Phase:0.005 mol/L Sodium 1-Decanesulfonate solution with 0.05%TFA and 15～30%acetonitrile；the column:C18（5 μm，250× 4.6 mm）；flow rate:1.0 ml/min；detective wavelength:203 nm；column temperature:35℃，injection volume: 10 μ L.The range of L-theanine linear relationship is 0.05mg/mL to 0.50mg/mL，y=1.13×107x+2.21× 104，R2=0.9999.S/N=3，the minimum detectable concentration limit was 1.996ng.S/N=10，the quantification limit was 7.984 ng.The method recovery is 94.9%and 102.2%，and the precision is 0.7%.Theestablished method is simple，rapid，accurate，and multiple suitable for theanine analysis in tea.

Key words:L-theanine；Ion-Pair Chromatography；HPLC；Tea

［中圖分類號］S 571.1

［文獻標志碼］A

［文章編號］1005-0310（2016）02-0083-05

DOI：10.16255/j.cnki.ldxbz.2016.02.015

［收稿日期］2015-09-09

［基金項目］國家自然科學基金面上項目（31471587），北京市教委科技發(fā)展面上項目（KM201311417013）。

［作者簡介］蔡金巖（1981-），女，北京市人，北京聯(lián)合大學應(yīng)用文理學院保健食品功能檢測中心工程師，研究方向為生物活性物質(zhì)。

［通訊作者］常平（1978-），女，北京市人，北京聯(lián)合大學功能食品科學技術(shù)研究院高級實驗師，研究方向為生物活性物質(zhì)。E-mail:changping@buu.edu.cn