美洲水貂刺鼠信號(hào)蛋白基因SNPs檢測(cè)及其與毛色表型的關(guān)聯(lián)分析

宋興超，徐　超，劉宗岳，岳志剛，叢　波，劉琳玲，楊福合

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112)

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美洲水貂刺鼠信號(hào)蛋白基因SNPs檢測(cè)及其與毛色表型的關(guān)聯(lián)分析

宋興超，徐超，劉宗岳，岳志剛，叢波，劉琳玲，楊福合*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112)

摘要：旨在檢測(cè)刺鼠信號(hào)蛋白(Agouti signaling protein，Agouti)基因外顯子2、內(nèi)含子2、外顯子3及部分內(nèi)含子3的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)在不同毛色美洲水貂群體中的分布，探討該基因變異與水貂被毛顏色表型的相關(guān)性。以金州黑水貂、吉林白水貂、銀藍(lán)水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂共計(jì)430個(gè)樣本的血液基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增和Sanger雙脫氧鏈終止測(cè)序技術(shù)，對(duì)Agouti基因序列進(jìn)行SNPs檢測(cè)，并將突變位點(diǎn)與水貂毛色表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，獲得的美洲水貂Agouti基因長(zhǎng)度為2 510 bp，內(nèi)含子2存在4個(gè)SNPs：g.18G>A、g.159A>G、g.235G>T和g.1189C>T，部分內(nèi)含子3檢測(cè)到6個(gè)SNPs：g.252C>T、g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C，在外顯子2和3區(qū)域并未檢測(cè)到SNPs位點(diǎn)。關(guān)聯(lián)分析表明，Agouti基因7個(gè)SNPs(內(nèi)含子2：g.1189C>T；內(nèi)含子3：g.252C>T、g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C)位點(diǎn)的基因型均與水貂毛色表型極顯著相關(guān)(P<0.000 1)，且部分內(nèi)含子3中的5個(gè)SNPs位點(diǎn)(g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C)可能處于緊密連鎖狀態(tài)。研究結(jié)果初步表明，Agouti基因可能是影響美洲水貂被毛顏色的候選基因或與決定毛色性狀主效基因相連鎖的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：美洲水貂；Agouti基因；毛色表型；單核苷酸多態(tài)性；關(guān)聯(lián)分析

哺乳動(dòng)物皮膚、被毛的顏色和鳥(niǎo)類的羽色是一種重要的質(zhì)量性狀，也是動(dòng)物形態(tài)選擇、品種歸屬識(shí)別及鑒定的重要依據(jù)之一[1]。野生美洲水貂(Neovisonvison)全身被毛一致，呈深褐色，在家養(yǎng)條件下稱為標(biāo)準(zhǔn)貂，彩色水貂是深褐色標(biāo)準(zhǔn)貂的突變型，目前已出現(xiàn)30多個(gè)毛色突變基因(包括復(fù)等位基因)，并通過(guò)各種組合，已增加至100余種[2]。彩色水貂皮色澤鮮艷、絢麗多彩，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，根據(jù)毛色可以分為黑色系、白色系、淺褐色系和灰藍(lán)色系4大類[3]。水貂作為一種小型珍貴毛皮動(dòng)物，其被毛顏色是決定貂皮質(zhì)量及價(jià)值最重要的指標(biāo)，培育出新穎美觀的彩貂新品種是當(dāng)前水貂的主要育種方向之一，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆水貂毛色相關(guān)基因，篩選與水貂被毛顏色表型相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇(Marker assisted selection，MAS)可以加快彩貂良種的選育進(jìn)度。

近年來(lái)，關(guān)于水貂毛色發(fā)生的分子遺傳學(xué)機(jī)理研究備受關(guān)注。S.Cirera等[4]研究表明，銀藍(lán)水貂黑素親和素(Melanophilin，MLPH)蛋白缺失肌動(dòng)蛋白Va (MYO5A)結(jié)合域可導(dǎo)致稀釋色型。R.Anistoroaei等[5]報(bào)道，酪氨酸酶(Tyrosinase)基因外顯子1的錯(cuò)義突變(g.138T>A)可能與水貂的白化表型相關(guān)。宋興超等[6]對(duì)美洲水貂黑色素皮質(zhì)激素受體-1(Melanocortin-1 receptor，MC1R)基因完整編碼區(qū)進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析。被毛顏色的形成主要受控于毛囊中黑色素細(xì)胞合成及分泌的真黑色素(Eumelanin)和褐黑色素(Pheomelanin)的比例及分布，是涉及多個(gè)基因與位點(diǎn)共同進(jìn)行調(diào)控的復(fù)雜信號(hào)通路，該通路涉及黑色素細(xì)胞發(fā)育、黑色素小體形成與轉(zhuǎn)運(yùn)、黑色素合成與類型轉(zhuǎn)變等生物學(xué)過(guò)程，其中，刺鼠信號(hào)蛋白(Agouti signal protein gene，Agouti)基因是參與調(diào)控大多數(shù)脊椎動(dòng)物毛色性狀的一個(gè)主效基因，該基因主要通過(guò)調(diào)控色素合成過(guò)程中真黑色素和褐黑色素之間的轉(zhuǎn)換來(lái)控制毛色的發(fā)生[7]。Agouti基因外顯子與非編碼區(qū)突變對(duì)小鼠[8]、家貓[9]、山羊[10]和驢[11]毛色的影響機(jī)制已有相關(guān)報(bào)道。但是該基因?qū)λ趺誀畹恼{(diào)控方式還不清楚，因此，研究探討Agouti基因變異與水貂毛色表型的相關(guān)性，對(duì)于進(jìn)一步揭示水貂毛色形成的分子遺傳學(xué)機(jī)制尤為重要。本研究以5個(gè)不同毛色水貂群體為研究對(duì)象，通過(guò)PCR擴(kuò)增及Sanger雙脫氧鏈終止測(cè)序技術(shù)對(duì)Agouti基因外顯子2、內(nèi)含子2、外顯子3和部分內(nèi)含子3區(qū)域進(jìn)行SNPs位點(diǎn)檢測(cè)，并對(duì)該基因突變位點(diǎn)與水貂毛色表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在篩查與水貂被毛顏色相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以期為深入研究Agouti基因調(diào)控水貂毛色性狀的功能提供參考。

1材料與方法

1.1血液采集及基因組DNA提取

以2個(gè)培育品種和3個(gè)引進(jìn)品種共計(jì)5種毛色表型430個(gè)樣本為研究對(duì)象(圖1)。其中培育品種包括金州黑水貂(圖1A，JZH，120只)和吉林白水貂(圖1B，JLB，86只)，引進(jìn)品種包括銀藍(lán)水貂(圖1C，YL，95只)，咖啡水貂(圖1D，KF，86只)和珍珠色水貂(圖1E，ZZ，43只)。樣本取自大連名威貂業(yè)有限公司和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動(dòng)物試驗(yàn)基地7月齡左右、雄性家養(yǎng)美洲水貂血液，水貂取皮時(shí)用一次性無(wú)菌注射器心采血5.0 mL置于真空采血管中，參考文獻(xiàn)[12]中酚-氯仿抽提法提取水貂血液基因組DNA，滅菌超純水溶解，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)完整性、含量及純度，稀釋為70 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

DNA提取所用試劑購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，DL2000 DNA Marker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、ExTaqDNA聚合酶和dNTPs均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自Promega公司。

A.金州黑水貂；B.吉林白水貂；C.銀藍(lán)水貂；D.咖啡水貂；E.珍珠色水貂A.Jinzhou black mink；B.Jilin white mink；C.Silverblue mink；D.Coffee mink；E.Pearl mink圖1　不同被毛顏色的美洲水貂Fig.1　Different coat color in American mink

1.3引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

因GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中未公布美洲水貂Agouti基因序列信息，所以本研究以與水貂同屬鼬科動(dòng)物的雪貂(序列號(hào)：XM_004785317)Agouti基因mRNA序列作為參考，將該序列在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中雪貂全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，獲得一段4 321 bp雪貂Agouti基因核苷酸序列，以該序列作為假定的美洲水貂Agouti基因，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件篩選3對(duì)引物(表1)，擴(kuò)增水貂Agouti基因。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

反應(yīng)體系25 μL：ExTaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，模板DNA 1.0 μL(70 ng·μL-1)，上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1 μL，滅菌超純水17.25 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，Tm(表1)退火30 s，72 ℃延伸30～82 s(表1)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的片段經(jīng)過(guò)切膠、回收純化后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1擴(kuò)增美洲水貂Agouti基因序列引物信息

Table 1Information of primer sequences for amplifying American minkAgoutigene

引物Primer序列(5'→3')Sequence退火溫度/℃Tm延伸時(shí)間/sExtendedtime擴(kuò)增區(qū)域AmplifiedregionAgouti-1F:CTATCGGAACACTTAGGAAATGGGTR:TTATTAAATTGGTGGTATACAGGGC57.530外顯子2Agouti-2F:TTGGATTTCCCTTCTGTCTCTATTGR:TCTTCTTTTCCGCCTCTTTTCTACT60.282內(nèi)含子2+外顯子3Agouti-3F:GAAGCACTGAACAAGAAATCCAAAR:CCATCCAGGTAAAATCCACTAACA59.562部分內(nèi)含子3

1.4數(shù)據(jù)分析

1.4.1SNPs位點(diǎn)識(shí)別與基因型判定利用BioEdit 7.0生物軟件的ClustalW Multiple alignment程序?qū)Λ@得的美洲水貂Agouti基因序列進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)SNPs位點(diǎn)；通過(guò)測(cè)序峰圖軟件Chromas 5.0判定SNPs位點(diǎn)的基因型，單一峰為純合基因型，套峰為雜合基因型。

1.4.2基因型、等位基因頻率統(tǒng)計(jì)及SNPs位點(diǎn)與毛色性狀關(guān)聯(lián)分析采用Popgene 1.32軟件計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率，并利用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件的χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)程序進(jìn)行SNPs位點(diǎn)基因型與毛色表型的關(guān)聯(lián)分析(P<0.05表示差異顯著，P<0.01為差異極顯著)。

2結(jié)果

2.1Agouti基因PCR產(chǎn)物檢測(cè)

利用設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行水貂Agouti基因擴(kuò)增，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)，3對(duì)引物均獲得特異性的產(chǎn)物，Agouti-1引物擴(kuò)增片段為494 bp(圖2A)，Agouti-2引物擴(kuò)增片段為1 335 bp(圖2B)，Agouti-3引物擴(kuò)增片段為1 032 bp(圖2C)，3個(gè)片段大小與預(yù)期設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度一致，單一無(wú)拖尾，表明引物特異性較好，適合進(jìn)行測(cè)序分析。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2～12.產(chǎn)物。A. Agouti-1；B. Agouti-2；C. Agouti-3M.DL2000 DNA marker；1.Negative control；2-12.The products of Agouti gene.A.Agouti-1；B.Agouti-2；C.Agouti-3圖2　水貂Agouti基因3對(duì)引物PCR產(chǎn)物電泳Fig.2　Electrophoresis of the products of Agouti gene in mink from 3 pairs primers

2.2SNPs位點(diǎn)篩查及基因型判定

參照雪貂Agouti基因序列結(jié)構(gòu)特征分析3對(duì)引物的測(cè)序結(jié)果，共獲得美洲水貂Agouti基因2 510 bp核苷酸序列，其中外顯子2、內(nèi)含子2、外顯子3和部分內(nèi)含子3長(zhǎng)度分別為160、1 256、62和967 bp(序列號(hào)KJ488543)。利用BioEdit 7.0軟件中的ClustalW Multiple alignment程序?qū)?個(gè)不同毛色水貂群體的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，篩查SNPs位點(diǎn)，結(jié)合測(cè)序峰圖判定每個(gè)位點(diǎn)的基因型。SNPs位點(diǎn)的命名原則：每個(gè)內(nèi)含子的第1個(gè)起始?jí)A基標(biāo)記為“1”，在不同毛色水貂Agouti基因內(nèi)含子2和3中，共檢測(cè)到10個(gè)SNPs(圖3和表2)，外顯子2和3區(qū)域均未檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)。內(nèi)含子2中檢測(cè)到4個(gè)SNPs，其中吉林白水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂僅檢測(cè)到3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異：g.18G>A、g.159A>G和g.1189C>T，每個(gè)位點(diǎn)均包括3種基因型；金州黑水貂僅檢測(cè)到1個(gè)變異位點(diǎn)：g.235G>T，包括2種基因型；銀藍(lán)貂這4個(gè)突變位點(diǎn)均存在。部分內(nèi)含子3上，在不同毛色水貂群體間檢測(cè)到6個(gè)SNPs：g.252C>T、g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C，6個(gè)SNPs位點(diǎn)在5種毛色水貂群體中分別存在3種基因型。

2.3Agouti基因內(nèi)含子2序列4個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分布

對(duì)獲得的5個(gè)不同毛色品種的430只水貂Agouti基因內(nèi)含子2序列進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)各毛色表型中4個(gè)SNPs的基因型和等位基因頻率。由表3可見(jiàn)，在g.18G>A和g.159A>G位點(diǎn)上，5種不同毛色水貂中G和A等位基因頻率均較高，為優(yōu)勢(shì)等位基因，其中金州黑水貂G和A等位基因的基因頻率最高，均為1.000 0，即金州黑水貂群體在這2個(gè)位點(diǎn)未發(fā)生變異；在其它毛色品種中，這2個(gè)等位基因的分布大致相似。對(duì)于g.235G>T位點(diǎn)，僅在金州黑水貂和銀藍(lán)水貂群體間檢測(cè)到變異位點(diǎn)，存在GG和TT兩種基因型，然而，對(duì)于位點(diǎn)g.1189C>T，金州黑水貂、吉林白水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂均存在CC、CT和TT 3種基因型，且CT基因型在吉林白水貂中為優(yōu)勢(shì)等位基因型，而銀藍(lán)水貂未檢測(cè)到TT基因型。由此推測(cè)，g.1189C>T位點(diǎn)可能與吉林白水貂的白色被毛表型相關(guān)。

圖3　美洲水貂Agouti基因SNPs位點(diǎn)測(cè)序Fig.3　Sequencing profiles of Agouti gene from American mink with different coat color

表2水貂Agouti基因10個(gè)SNPs的信息

Table 2The information of 10 SNPs in minkAgoutigene

項(xiàng)目ItemSNP1SNP2SNP3SNP4SNP5SNP6SNP7SNP8SNP9SNP10位置/bpPosition181592351189252290298340343379突變MutationG/AA/GG/TC/TC/TA/CG/CA/GT/CT/C分布DistributionIntron2Intron2Intron2Intron2Intron3Intron3Intron3Intron3Intron3Intron3

表3Agouti基因內(nèi)含子2序列4個(gè)SNPs在5個(gè)不同毛色水貂群體中的基因型與等位基因頻率

Table 3Genotype and allele frequency of 4 SNPs forAgoutigene intron 2 in 5 coat color mink breeds

突變位點(diǎn)SNPs基因型與等位基因Genotypeandallele不同毛色水貂群體Differentcoatcolorpopulationsofmink金州黑水貂JZH吉林白水貂JLB銀藍(lán)水貂YL咖啡水貂KF珍珠水貂ZZg.18G>AGG1.0000(120)0.7442(64)0.8211(78)0.8372(72)0.5349(23)GA0.0000(0)0.2209(19)0.1474(14)0.1512(13)0.4186(18)AA0.0000(0)0.0349(3)0.0315(3)0.0116(1)0.0465(2)G1.00000.85470.89470.91280.7442A0.00000.14530.10530.08720.2558g.159A>GAA1.0000(120)0.8256(71)0.8105(77)0.8837(76)0.5349(23)AG0.0000(0)0.1512(13)0.1684(16)0.1047(9)0.4186(18)GG0.0000(0)0.0232(2)0.0211(2)0.0116(1)0.0465(2)A1.00000.90120.89470.93610.7442G0.00000.09880.10530.06390.2558g.235G>TGG0.9333(112)1.0000(86)0.9368(89)1.0000(86)1.0000(43)GT0.0667(8)0.0000(0)0.0632(6)0.0000(0)0.0000(0)TT0.0000(0)0.0000(0)0.0000(0)0.0000(0)0.0000(0)G0.96671.00000.96321.00001.0000T0.03330.00000.03680.00000.0000g.1189C>TCC0.3583(43)0.3488(30)0.8211(78)0.6163(53)0.7442(32)CT0.4417(53)0.5349(46)0.1789(17)0.3139(27)0.2326(10)TT0.2000(24)0.1163(10)0.0000(0)0.0698(6)0.0232(1)C0.57920.61630.91050.77530.8605T0.42080.38370.08950.22670.1395

括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為該基因型個(gè)體數(shù)。下表同

Figures in brackets are the individual number of the genotype.The same as below

2.4Agouti基因部分內(nèi)含子3序列6個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分布

利用引物Agouti-3對(duì)5個(gè)不同毛色水貂品種的430個(gè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，獲得所有個(gè)體6個(gè)SNPs的基因型數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計(jì)各群體各位點(diǎn)的基因型與等位基因頻率(表4)。結(jié)果顯示，5個(gè)水貂群體的6個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了突變。g.252C>T位點(diǎn)的C等位基因在5個(gè)毛色水貂群體中為優(yōu)勢(shì)等位基因，其中金州黑水貂群體突變率最低，等位基因T頻率為0.222 2。除金州黑水貂品種外，g.290A>C位點(diǎn)的C等位基因在吉林白水貂、銀藍(lán)水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂群體中為優(yōu)勢(shì)等位基因。g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C位點(diǎn)在各群體中等位基因頻率與g.290A>C位點(diǎn)完全一致，初步推測(cè)，這5個(gè)變異位點(diǎn)在所有群體內(nèi)可能處于緊密連鎖狀態(tài)，或者與控制水貂毛色表型的位點(diǎn)連鎖。

表4Agouti基因內(nèi)含子3序列6個(gè)SNPs在5個(gè)不同水貂毛色群體中的基因型與等位基因頻率

Table 4Genotype and allele frequency of 6 SNPs forAgoutigene intron 3 in 5 coat color mink breeds

突變位點(diǎn)SNPs基因型與等位基因Genotypeandallele不同毛色水貂群體Differentcoatcolorpopulationsofmink金州黑水貂JZH吉林白水貂JLB銀藍(lán)水貂YL咖啡水貂KF珍珠水貂ZZg.252C>TCC0.6667(80)0.5000(43)0.5263(50)0.5116(44)0.2558(11)CT0.2222(27)0.4302(37)0.4526(43)0.3605(31)0.6279(27)TT0.1111(13)0.0698(6)0.0211(2)0.1279(11)0.1163(5)C0.77780.71510.75260.69190.5698T0.22220.28490.24740.30810.4302g.290A>CAA0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)AC0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)CC0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)A0.57920.49420.11050.24420.2093C0.42080.50580.88950.75580.7907g.298G>CGG0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)GC0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)CC0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)G0.57920.49420.11050.24420.2093C0.42080.50580.88950.75580.7907g.340A>GAA0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)AG0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)GG0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)A0.57920.49420.11050.24420.2093G0.42080.50580.88950.75580.7907g.343T>CTT0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)TC0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)CC0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)T0.57920.49420.11050.24420.2093C0.42080.50580.88950.75580.7907g.379T>CTT0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)TC0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)CC0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)T0.57920.49420.11050.24420.2093C0.42080.50580.88950.75580.7907

2.5Agouti基因SNPs位點(diǎn)與水貂毛色表型的關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)篩查到SNPs位點(diǎn)所形成的不同基因型及其在不同毛色群體中頻率的差異，由于個(gè)別毛色群體在g.18G>A、g.159A>G和g.235G>T位點(diǎn)處的基因型數(shù)量<5，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且位點(diǎn)g.290A>C與g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C、g.343T>C的等位基因頻率完全一致，因此選取3個(gè)SNPs，即g.1189C>T、g.252C>T、g.290A>C，分別進(jìn)行卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)(表5)，分析各位點(diǎn)基因型與毛色表型的相關(guān)性。結(jié)果表明，內(nèi)含子2中1 189位、內(nèi)含子3中252位、290位各基因型在不同毛色群體中差異極顯著(P<0.000 1)，另外，由于內(nèi)含子3中g(shù).298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C可能與g.290A>C位點(diǎn)處于緊密連鎖狀態(tài)，因此，筆者推測(cè)g.1189C>T、g.252C>T、g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C位點(diǎn)均可能與水貂毛色表型存在一定的相關(guān)性。

表5Agouti基因SNPs位點(diǎn)的各基因型分布及其與毛色的關(guān)聯(lián)分析

Table 5Association between genotype ofAgoutigene SNPs and coat color phenotype

位點(diǎn)SNPs基因型Genotype不同毛色群體頻數(shù)Numberofdifferentcoatcolor金州黑水貂JZH吉林白水貂JLB銀藍(lán)水貂YL咖啡水貂KF珍珠水貂ZZχ2PCC4330785332g.1189C>TCT534617271077.7501<0.0001TT2410061CC8043504411g.252C>TCT273743312734.6981<0.0001TT1362115AA5721562g.290A>CAC2543113014133.7328<0.0001CC3822795027

3討論

隨著測(cè)序成本的逐漸下降，在所有SNPs的檢測(cè)方法中，對(duì)欲檢測(cè)片段進(jìn)行擴(kuò)增、直接測(cè)序是最為準(zhǔn)確的方法，該方法主要用于SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)及分型，通常情況下，純合型SNPs位點(diǎn)的測(cè)序峰圖為單一峰型，而雜合型SNPs位點(diǎn)的測(cè)序峰為套峰，因而很容易將其區(qū)分，通過(guò)直接測(cè)序方法進(jìn)行SNPs篩查的檢出率接近100%[13]。本試驗(yàn)采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)，對(duì)5個(gè)不同毛色水貂群體Agouti基因進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，在內(nèi)含子2和部分內(nèi)含子3區(qū)域共檢測(cè)到10個(gè)SNPs位點(diǎn)。與非翻譯區(qū)相比，5個(gè)毛色水貂群體Agouti基因外顯子2和3未檢測(cè)到變異位點(diǎn)，這與M.Girardot等[14]在牛上和X.L.Li等[15]在山羊中的研究結(jié)果一致。J.Voisey等[16]也未檢測(cè)到人Agouti基因外顯子2和3具有多態(tài)性。初步推斷，Agouti基因外顯子2和3在所選取的水貂樣本中相對(duì)保守，應(yīng)進(jìn)一步增加樣本量或檢測(cè)更多的毛色類型個(gè)體，同時(shí)篩查其他外顯子區(qū)域以確保水貂Agouti基因編碼區(qū)是否存在與毛色表型相關(guān)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。

在內(nèi)含子2所檢測(cè)到的4個(gè)SNPs位點(diǎn)中，g.18G>A和g.159A>G位點(diǎn)僅存在于吉林白水貂、銀藍(lán)水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂群體中，且GG和AA為優(yōu)勢(shì)基因型，但是金州黑水貂群體中未見(jiàn)這兩個(gè)變異位點(diǎn)。g.235G>T位點(diǎn)僅在金州黑和銀藍(lán)水貂群體中存在少量GT基因型，因此推測(cè)這3個(gè)SNPs位點(diǎn)與水貂的毛色表型關(guān)系不大，可能是在個(gè)體自然進(jìn)化或品種選育過(guò)程中產(chǎn)生的稀有變異堿基。關(guān)于g.1189C>T位點(diǎn)，CT基因型在白色水貂群體頻率最高，且經(jīng)卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)表明，該位點(diǎn)形成的基因型與水貂毛色表型極顯著相關(guān)(P<0.000 1)，所以g.1189C>T位點(diǎn)的CT基因型可能與美洲水貂的白色被毛性狀存在關(guān)聯(lián)，該位點(diǎn)或者是控制水貂白色被毛表型的主控位點(diǎn)，或者是與控制水貂白色表型的位點(diǎn)存在連鎖關(guān)系，需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。部分內(nèi)含子3中的g.252C>T位點(diǎn)形成的CT基因型在珍珠色水貂群體中的頻率最高(0.627 9)，CT基因型可能與珍珠色水貂的毛色相關(guān)。g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C位點(diǎn)的突變純合子基因型頻率(0.831 6)在銀藍(lán)水貂群體中的頻率最高，與銀藍(lán)水貂的灰藍(lán)色被毛表型存在關(guān)聯(lián)(P<0.000 1)，也可能與控制銀藍(lán)水貂毛色表型的位點(diǎn)存在連鎖關(guān)系。

本研究檢測(cè)到的水貂Agouti基因7個(gè)SNPs位點(diǎn)中，內(nèi)含子2中與白色表型相關(guān)的g.1189C>T、內(nèi)含子3中與珍珠色表型相關(guān)的g.252C>T位點(diǎn)以及與銀藍(lán)色表型相關(guān)的g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C位點(diǎn)可能與某個(gè)等位基因連鎖，從而表現(xiàn)出不同的基因型，對(duì)應(yīng)不同的毛色表型。前人研究證實(shí)，Agouti基因表達(dá)的ASIP蛋白與α-MSH競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MC1R，進(jìn)一步導(dǎo)致真黑色素合成數(shù)量減少，生成淺色被毛[17]。根據(jù)彩貂毛色遺傳基因型可知[3]，吉林白水貂(基因型：bbcc)和珍珠色水貂(基因型：ppkk)都屬于兩對(duì)純合隱性基因組合色型，銀藍(lán)水貂的基因型為pp，這3種毛色均為淺色表型，與Agouti基因表達(dá)的ASIP蛋白拮抗α-MSH與MC1R相結(jié)合的理論相符。盡管本試驗(yàn)檢測(cè)的SNPs存在于內(nèi)含子中，但有研究表明Agouti基因內(nèi)含子的變異可以導(dǎo)致其編碼mRNA存在不同的剪接體，通過(guò)修復(fù)蛋白合成而影響相應(yīng)蛋白的調(diào)控功能[18]。

4結(jié)論

本研究對(duì)美洲水貂Agouti基因的SNPs進(jìn)行檢測(cè)并分析了內(nèi)含子2和3中的10個(gè)SNPs與水貂毛色性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNPs位點(diǎn)與水貂淺色被毛表型存在關(guān)聯(lián)。該結(jié)果提示，Agouti基因可作為影響美洲水貂被毛顏色的主效候選基因或與決定毛色性狀的主效基因連鎖的分子遺傳標(biāo)記，為解析Agouti基因調(diào)控水貂毛色性狀的分子遺傳學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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(編輯程金華)

Single Nucleotide Polymorphisms Detection of Agouti Gene and Its Association with Coat Color Phenotype in American Mink(Neovisonvison)

SONG Xing-chao，XU Chao，LIU Zong-yue，YUE Zhi-gang，CONG Bo，LIU Lin-ling，YANG Fu-he*

(StateKeyLaboratoryofSpecialEconomicAnimalMolecularBiology，InstituteofSpecialAnimalandPlantSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China)

Abstract:The aim of this study was to research single nucleotide polymorphisms of agouti signal protein(Agouti)gene and analyze the association of SNPs with coat color phenotype in American mink(Neovisonvison).The DNA of blood from 5 mink breeds(Jinzhou black，Jilin white，Silverblue，Coffee and Pearl mink)that possessed significant difference in coat color phenotype were selected as templates，SNP sites were screened by PCR and Sanger double chain termination sequencing technology，and then the relationship between the mutation sites ofAgoutigene and coat color phenotype were analyzed in 430 minks.The results showed that the obtained minkAgoutigene was 2 510 bp in length.Total 10 SNPs were screened from 430 individuals of 5 coat color breeds，of which 4 SNPs (g.18G>A，g.159A>G，g.235G>T and g.1189C>T)were located in intron 2 and 6 SNPs(g.252C>T，g.290A>C，g.298G>C，g.340A>G，g.343T>C and g.379T>C)were detected from partial intron 3 ofAgoutigene，while no SNPs was discovered in exon 2 and 3.Association analysis of 7 SNPs inAgoutigene with coat color phenotype indicated that all sites were very significantly(P<0.000 1)correlated with coat color phenotype of American mink.In addition，the 5 loci including g.290A>C，g.298G>C，g.340A>G，g.343T>C and g.379T>C might show closely linkaged phenomenon.Results of the present study indicated thatAgoutigene might be the candidate gene or linked with the major gene affecting the coat color phenotype of American mink.

Key words:American mink；Agoutigene；coat color phenotype；SNPs；correlation analysis

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.012

收稿日期：2015-06-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃-973項(xiàng)目(2012CB722907)；水貂優(yōu)良種質(zhì)資源及選育技術(shù)引進(jìn)-948項(xiàng)目(2014-Z8)

作者簡(jiǎn)介：宋興超(1982-)，男，河北保定人，博士生，助理研究員，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：songxingchao@caas.cn *通信作者：楊福合，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種質(zhì)資源收集、評(píng)價(jià)及遺傳育種研究，E-mail：yangfh@126.com

中圖分類號(hào)：S865.2+2.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0723-10