白頭翁湯通過保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性及PMNs遷移殺菌功能的影響

王明明，楊　舒，董　虹，穆　祥

(北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

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白頭翁湯通過保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性及PMNs遷移殺菌功能的影響

王明明，楊舒，董虹*，穆祥*

(北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

摘要：本研究旨在研究白頭翁湯(PD)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，從而揭示白頭翁湯的藥理作用。分別采用水溶性四氮唑(WST-1)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘇木素伊紅(HE)和Hoechst33342染色法檢測(cè)PD和LPS對(duì)大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RIMVECs)增殖、細(xì)胞毒性、細(xì)胞連接和細(xì)胞核變化的影響；建立中性粒細(xì)胞(PMNs)跨RIMVECs遷移的Transwel模型，檢測(cè)PD對(duì)LPS損傷的RIMVECs后PMNs細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外細(xì)菌數(shù)量的影響。結(jié)果顯示，LPS(1 μg·mL-1)致RIMVECs細(xì)胞核萎縮、細(xì)胞膜損壞，細(xì)胞毒性百分比達(dá)53.2%；細(xì)胞連接破壞導(dǎo)致細(xì)胞脫落，脫落率為39.6%。PD(20 μg·mL-1)對(duì)上述損傷有明顯的保護(hù)作用。在20 μg·mL-1PD作用下，LPS誘導(dǎo)的跨內(nèi)皮遷移的PMNs細(xì)胞內(nèi)外細(xì)菌的存活明顯減少(P<0.01)。結(jié)果揭示PD可以有效保護(hù)LPS損傷的RIMVECs從而增強(qiáng)PMNs的殺菌能力，為臨床治療動(dòng)物細(xì)菌性疾病用藥提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：白頭翁湯；大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞；脂多糖；中性粒細(xì)胞

微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells，MVECs)作為裱襯于血管內(nèi)部的一層扁平細(xì)胞[1]，最初被認(rèn)為只是一種屏障細(xì)胞，但隨著近年來研究的深入，發(fā)現(xiàn)它是各種致病因子的靶點(diǎn)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞[2]。內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，ECs)的完整性對(duì)于機(jī)體發(fā)揮固有免疫具有至關(guān)重要的作用。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌裂解出來的細(xì)胞壁脂多糖，釋放到介質(zhì)中攻擊機(jī)體免疫屏障。中性粒細(xì)胞(polymorph nuclear neutrophils，PMNs)作為固有免疫執(zhí)行者需要跨越內(nèi)皮細(xì)胞才能達(dá)到病灶組織，從而發(fā)揮其抗菌作用[3]。因此，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是提高免疫調(diào)節(jié)的途徑之一。

目前中藥復(fù)方有效保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的報(bào)道甚多[4-6]，但是保護(hù)和提高機(jī)體免疫機(jī)能的方式有待進(jìn)一步研究。白頭翁湯(Pulsatillae decoction，PD)出自張仲景的《傷寒論》，是經(jīng)典的清熱涼血中藥復(fù)方[7]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)白頭翁湯具有抗菌消炎、愈合結(jié)節(jié)性潰瘍以及促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等現(xiàn)代藥用價(jià)值[8-9]。作為天然中草藥組成的復(fù)方，低毒性、低殘留、低抗藥性的特點(diǎn)使其擁有深入研究的意義。

本試驗(yàn)以PD為契機(jī)，在細(xì)胞水平上深入研究PD的藥理作用，通過體外培養(yǎng)的大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat microvascular endothelial cells，RIMVECs)，建立LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，檢測(cè)LPS及PD對(duì)RIMVECs細(xì)胞增殖、毒性及形態(tài)變化的影響，并考察PD對(duì)跨內(nèi)皮遷移的PMNs細(xì)胞內(nèi)外殺菌情況的影響，為進(jìn)一步研究PD治療細(xì)菌性疾病提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

多功能酶標(biāo)儀(BIOTEK，型號(hào)SYNERGY4)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO，型號(hào)MCO-17AC)；奧林巴斯研究顯微鏡(OLYMPUS，型號(hào)IX71)；Transwell 通透性支持物(Corning，批號(hào)：3421)等。WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天，批號(hào)：C0035)；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天，批號(hào)C0017)；蘇木素伊紅染色試劑盒(碧云天，批號(hào)C0105)；LPS(SIGMA，批號(hào)L2880)；Hoechst 33342(SIGMA，批號(hào)B2261)；Cell Proliferation Reagent(Roche，批號(hào)：11644807001)；Percoll (GE Healthcare公司，批號(hào)：170891-01-100mL)；葡聚糖Dextran T500(Pharmacia公司，批號(hào)17032001)；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株O101(CVCC1525，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；白頭翁、黃連、黃柏、秦皮購自北京同仁堂藥店。

1.2試驗(yàn)材料

將本實(shí)驗(yàn)室凍存的第11代RIMVECs復(fù)蘇后傳代，試驗(yàn)所用為13～14代。本試驗(yàn)將白頭翁150 g、黃連60 g、黃柏120 g、秦皮120 g參照獸藥典制備白頭翁湯水煎劑，濃縮成生藥濃度為1 g·mL-1，滅菌處理后4 ℃冰箱保存[10]。本試驗(yàn)應(yīng)用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度及細(xì)胞脫落率。

1.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

為了觀察LPS對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及PD對(duì)其保護(hù)情況，本試驗(yàn)通過HE、Hoechst33342染色觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核的變化。將RIMVECs以1×105·mL-1密度接種于24孔板并按照表1進(jìn)行細(xì)胞分組處理，細(xì)胞分為對(duì)照組、PD組、LPS組、預(yù)防組、治療組。其中對(duì)照組為含有2%胎牛血清的DMEM。

試驗(yàn)中HE染色嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，通過Image J軟件及計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中脫落細(xì)胞數(shù)并計(jì)算細(xì)胞脫落率。試驗(yàn)所用Hoechst33342的終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1，室溫避光染色20 min，PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察，并通過Image J軟件分析細(xì)胞平均光密度。

1.4細(xì)胞增殖率及細(xì)胞毒性的檢測(cè)

分別利用WST-1和LDH法檢測(cè)PD和LPS對(duì)RIMVECs增殖、細(xì)胞毒性及細(xì)胞膜完整性進(jìn)行評(píng)價(jià)。RIMVECs生長(zhǎng)至70%～80%匯合狀態(tài)，以1×105·mL-1的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為對(duì)照組、PD組、LPS組、預(yù)防組、治療組，并按照表1進(jìn)行細(xì)胞處理，每組重復(fù)三次。

表1細(xì)胞分組與處理

Table 1Cell groups and treaments

分組Group預(yù)處理Pre-treatment處理Treatment處理時(shí)間/hHours對(duì)照組等體積培養(yǎng)基等體積的培養(yǎng)基24PD組等體積培養(yǎng)基PD(0.2、2、20、200μg·mL-1)24LPS組等體積培養(yǎng)基LPS(0.1、1、10、100μg·mL-1)24預(yù)防組PD:20μg·mL-1LPS(0.1、1、10、100μg·mL-1)24治療組LPS:1μg·mL-1PD(0.2、2、20、200μg·mL-1)24

嚴(yán)格按照WST-1細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明書，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。通過公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：增殖率=(樣品組-空白對(duì)照)/(對(duì)照組-空白對(duì)照)×100%，其中空白對(duì)照為無細(xì)胞的培養(yǎng)基。嚴(yán)格按照LDH檢測(cè)試劑盒說明書，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。通過公式計(jì)算：細(xì)胞毒性百分比=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)/(最大酶活性吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100%。

1.5Transwell體系的建立

利用Transwell通透性支持物，建立跨RIMVECs的PMN遷移Transwell體系。取生長(zhǎng)匯合的RIMVECs(3×104·mL-1·well-1)接種于膜孔徑為5.0 μm的Transwell小室中，并在下室加入600 μL 2%DMEM，37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層匯合狀態(tài)。利用Millicell ERS-2系統(tǒng)檢測(cè)Transwell小室中內(nèi)皮細(xì)胞電阻，通過公式計(jì)算：區(qū)域面積電阻值(Ω·cm2)= 電阻值×Transwell小室膜面積，確定細(xì)胞培養(yǎng)至單層匯合狀態(tài)。將細(xì)胞分為對(duì)照組、PD組、LPS組、預(yù)防組、治療組，按照表1進(jìn)行試劑處理，處理時(shí)間為4 h。在小室中加入利用葡聚糖及Percoll梯度離心分離，并用臺(tái)盼藍(lán)染色調(diào)整懸液密度為1×106·mL-1的PMNs，放入37 ℃的5%CO2中靜置培養(yǎng)4 h。

1.6跨內(nèi)皮遷移的中性粒細(xì)胞殺菌功能檢測(cè)[11-12]

慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)按照文獻(xiàn)描述進(jìn)行。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌菌株用PBS洗滌并在培養(yǎng)液中重懸，37 ℃培養(yǎng)30 min備用。“1.5”中各組孵育完成后在下室中加入10 μL大腸桿菌(1×103·mL-1)繼續(xù)培養(yǎng)3 h。收集下室中的培養(yǎng)基并用PBS稀釋，取100 μL涂于麥康凱瓊脂平板檢測(cè)細(xì)胞外活菌數(shù)。加入300 μg·mL-1慶大霉素作用20 min殺死胞外菌，破碎PMNs后取100 μL涂于麥康凱瓊脂平板檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)，37 ℃孵育過夜。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果用Graphpad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*P<0.05、**P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PD及LPS對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

通過HE染色觀察內(nèi)皮細(xì)胞連接的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD組細(xì)胞增多，細(xì)胞脫落率呈負(fù)值。LPS組細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)拉伸等狀態(tài)(如圖1C箭頭所指)并出現(xiàn)大批量的細(xì)胞脫落，脫落率達(dá)到39.6%。預(yù)防組與治療組細(xì)胞脫落顯著低于LPS組(P<0.05，圖1)。

細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊熒光，甚至可見DNA熒光碎片。本試驗(yàn)通過Hoechst33342對(duì)各組細(xì)胞核染色，發(fā)現(xiàn)LPS組呈現(xiàn)明顯致密濃染(圖2C)，通過Image J軟件對(duì)圖片中細(xì)胞熒光分析平均光密度達(dá)到0.14 pixel，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，PD組、預(yù)防組、治療組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示1 μg·mL-1LPS可造成微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及細(xì)胞核損傷，20 μg·mL-1PD可緩解該損傷。

2.2PD對(duì)LPS損傷RIMVECs的保護(hù)作用

WST可以被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜，可用來反映細(xì)胞活性與增殖。結(jié)果表明，LPS(0.1、1、10、100 μg·mL-1)可使內(nèi)皮細(xì)胞的甲臜呈現(xiàn)濃度依賴性減少，細(xì)胞增殖率分別為97.2%、53.5%、35.3%、15.1%。PD預(yù)防組細(xì)胞增殖率極顯著高于LPS組 (0.1、1、10、100 μg·mL-1；P<0.01 圖3A)。PD治療組(0.2、2、20、200 μg·mL-1)與1 μg·mL-1LPS相比細(xì)胞增殖率均極顯著增高(P<0.01 )，當(dāng)PD質(zhì)量濃度高于2 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞增殖率高于100%(圖3B)。

A、B、C、D、E分別為對(duì)照組、PD組、LPS組、預(yù)防組、治療組HE染色圖片(100×)，F(xiàn)為各組細(xì)胞脫落率。與LPS組比較*P<0.05A，B，C，D，E.Figures in the control group，PD group，LPS group，prevention group，treatment group(100×)，respectively.F.The rate of cell loss in each gorup.Compared with the LPS group，*P<0.05圖1　LPS及PD對(duì)RIMVECs細(xì)胞連接的影響Fig.1　The impact of LPS and PD on the cell junction of RIMVECs

A、B、C、D、E為對(duì)照組、PD組、LPS組、預(yù)防組、治療組Hoechest染色(200×)；F為采用Image J軟件分析各組平均光密度。與對(duì)照組比較**P<0.01A，B，C，D，E.Figures in the control group，PD group，LPS group，prevention group，treatment group (200×)，respectively；F represents the average optical density by Image J.Compared with the control group，**P<0.01圖2　LPS及PD對(duì)RIMVECs細(xì)胞核的影響Fig.2　The impact of LPS and PD on the nuclei of RIMVECs

當(dāng)細(xì)胞膜破壞后細(xì)胞質(zhì)中活性比較穩(wěn)定的LDH會(huì)釋放出來，因此通過檢測(cè)培養(yǎng)液中的LDH釋放量可以定量分析細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，LPS(1、10、100 μg·mL-1)LDH釋放量高于50%，相對(duì)應(yīng)的PD預(yù)防組LDH釋放量極顯著降低(P<0.01 圖4A)；PD治療組LDH釋放量極顯著低于1 μg·mL-1LPS刺激時(shí)釋放的LDH量(P<0.01 圖4B)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD可以預(yù)防LPS損傷微血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)可以改善LPS損傷內(nèi)皮細(xì)胞后的細(xì)胞增殖。

A為不同濃度LPS組、PD預(yù)防組細(xì)胞增殖情況，預(yù)防組與LPS組相比**P<0.01；B為PD治療組細(xì)胞增殖情況，與1 μg·mL-1LPS作用時(shí)相比**P<0.01A is the cell proliferation of LPS group and prevention group，compared with the LPS group，**P<0.01；B is the cell proliferation of treatment group，compared with the LPS in 1 μg·mL-1**P<0.01圖3　PD對(duì)LPS損傷RIMVECs細(xì)胞增殖的影響Fig.3　The impact of PD on cell proliferation of LPS-injured RIMVECs

A為L(zhǎng)PS組、預(yù)防組細(xì)胞毒性情況，預(yù)防組與LPS組相比*P<0.05，**P<0.01；B為治療組細(xì)胞毒性情況，與1 μg·mL-1LPS作用相比**P<0.01A is the LDH release of LPS group and prevention group，compared with the LPS group *P<0.05，**P<0.01；B is the LDH release of treatment group，compared with the LPS in 1 μg·mL-1**P<0.01圖4　PD對(duì)LPS損傷RIMVECs LDH釋放量的影響Fig.4　The impact of PD on the LDH release of LPS-injured RIMVECs

2.3跨內(nèi)皮遷移PMNs殺菌能力評(píng)價(jià)

與LPS損傷RIMVECs后，PMNs穿越不完整RIMVECs的LPS組相比PD預(yù)防組與PD治療組細(xì)胞內(nèi)外細(xì)菌量均極顯著降低(P<0.01，表2)。提示LPS對(duì)RIMVECs造成損傷，而PD對(duì)這種損傷有較好的預(yù)防及治療效果，并且可以通過改善RIMVECs以增強(qiáng)PMNs殺菌功能的效果。

表2跨內(nèi)皮遷移的PMNs殺菌情況

Table 2Transendothelial migration of PMNs sterilization case

分組Group胞內(nèi)Intracellular胞外Extracelluar對(duì)照組46.33±2.52150.66±8.50LPS153.33±8.55185.66±16.04預(yù)防組15.33±1.15**26.66±0.57##治療組37.00±6.55**136.33±7.76##

與LPS組胞內(nèi)比較**P<0.01。與LPS組胞外比較##P<0.01

Compared with the intracellular of LPS group **P<0.01.Compared with the extracelluar of LPS group ##P<0.01

3討論

MVECs是構(gòu)成血液與組織間屏障的重要組成部分，是功能活躍的內(nèi)分泌細(xì)胞[13]；作為病原在體內(nèi)擴(kuò)散造成全身感染的必經(jīng)之路，暴露在循環(huán)介質(zhì)中的MVECs易被損傷進(jìn)而引發(fā)多種微血管相關(guān)疾病[14]。其中RIMVECs是細(xì)菌內(nèi)毒素的靶細(xì)胞，是腸黏膜免疫屏障的重要組成部分，是腸道疾病甚至全身疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)[15]。研究顯示LPS會(huì)導(dǎo)致RIMVECs形態(tài)變形、黏附分子及細(xì)胞因子增加、大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等病理表現(xiàn)。所以改善MVECs功能，預(yù)防毒素?fù)p傷MVECs對(duì)研究因MVECs受損而導(dǎo)致的疾病具有重要意義。本試驗(yàn)通過細(xì)胞形態(tài)染色觀察發(fā)現(xiàn)，1 μg·mL-1LPS可造成RIMVECs細(xì)胞連接破壞，脫落率可達(dá)36.2%。PD預(yù)防與治療能夠明顯改善LPS導(dǎo)致的細(xì)胞脫落。對(duì)于1 μg·mL-1LPS導(dǎo)致的細(xì)胞核皺縮濃染，PD可以通過保護(hù)RIMVECs的細(xì)胞膜進(jìn)而降低LPS繼續(xù)對(duì)其細(xì)胞核的損傷。

現(xiàn)階段研究證明，MVECs完整性是組織器官發(fā)揮其正常生理功能的必要條件，受損MVECs的增殖修復(fù)對(duì)維持其完整性至關(guān)重要，部分中藥可以通過降低MVECs脂質(zhì)過氧化損傷、調(diào)節(jié)MVECs活性物質(zhì)的釋放、提高M(jìn)VECs存活率抑制其凋亡等方式逆轉(zhuǎn)或者改變其相應(yīng)的病理狀態(tài)[16]。研究發(fā)現(xiàn)丹參麥冬水溶性部位能夠明顯改善損傷后ECs的增殖，增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)活力進(jìn)而達(dá)到保護(hù)ECs的作用[17]。張磊等研究發(fā)現(xiàn)黃芪水煎液能夠促進(jìn)RIMVECs增殖并增強(qiáng)細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌γ-干擾素[18]。PD具有抗菌消炎、燥濕除熱、瀉火止痢等作用，被廣泛應(yīng)用于治療動(dòng)物腸道細(xì)菌性疾病。韓捷等通過動(dòng)物試驗(yàn)觀察PD對(duì)體液免疫、細(xì)胞因子及自由基的影響發(fā)現(xiàn)PD具有抗炎殺菌和修復(fù)潰瘍的作用[19]。胡屹屹等通過體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD可以通過直接抑殺細(xì)菌起治療作用且有抗細(xì)菌內(nèi)毒素的作用[20-21]。探討PD對(duì)RIMVECs細(xì)胞增殖率及細(xì)胞毒性的影響，發(fā)現(xiàn)預(yù)防組細(xì)胞增殖率明顯高于LPS組，且其LDH釋放量明顯低于LPS組，提示PD的預(yù)防作用可以增強(qiáng)RIMVECs的細(xì)胞活力，降低LPS所導(dǎo)致的損傷；治療組較LPS組細(xì)胞增殖率顯著增高，LDH釋放量顯著降低，提示PD的治療作用可以改善LPS損傷RIMVECs后的細(xì)胞增殖和損傷。

MVECs不僅是LPS的靶細(xì)胞，同時(shí)也是一種效應(yīng)細(xì)胞，可以通過分泌功能影響炎癥反應(yīng)。PMNs需要跨越ECs，經(jīng)歷白細(xì)胞募集、黏附、游出、通過阿米巴樣運(yùn)動(dòng)穿過血管壁滲到炎癥部位才可以發(fā)揮其殺菌功能[22-23]。有研究發(fā)現(xiàn)，PMNs溶菌酶的激活與RIMVECs的細(xì)胞活性密切相關(guān)，PD與LPS作用可以顯著增加跨內(nèi)皮PMNs溶菌酶濃度[24]。本試驗(yàn)通過建立PMNs跨RIMVECs模型，檢測(cè)PD作用下跨RIMVECs遷移的PMNs殺菌情況。發(fā)現(xiàn)PMNs穿越LPS損傷后不完整的RIMVECs殺菌效果顯著降低，PD預(yù)防與治療可以明顯改善PMNs的殺菌情況。推測(cè)RIMVECs結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)PMNs的激活和發(fā)揮殺菌功能至關(guān)重要，而PD能夠有效降低RIMVECs細(xì)胞膜及細(xì)胞核的損傷，通過保護(hù)RIMVECs完整性，使PMNs穿過完好的RIMVECs并且被激活從而發(fā)揮其殺菌功能。綜上所述PD不僅有利于細(xì)胞增殖，還能夠通過有效保護(hù)LPS損傷的RIMVECs從而增強(qiáng)PMNs的殺菌能力。本試驗(yàn)在細(xì)胞水平上對(duì)PD藥理作用進(jìn)行探討，為獸醫(yī)臨床使用和研究PD防治細(xì)菌性疾病提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]婁晉寧.微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2004，14(3)：5-8.

LOU J N.Cuture of microvascular endothelial cells and the application in medicine researches[J].ChineseJournalofMicrocirculation，2004，14(3)：5-8.(in Chinese)

[2]索占偉，穆祥.從微血管內(nèi)皮細(xì)胞角度淺談防治細(xì)菌內(nèi)毒素病的新思路[Z].武漢：2006：519-522.

SUO Z W，MU X.New ideas of bacterial endotoxin disease from the perspective of prevention of microvascular endothelial cells[Z].Wuhan：2006：519-522.(in Chinese)

[3]BORREGAARD N.Neutrophils，from marrow to microbes[J].Immunity，2010，33(5)：657-670.

[4]高琳琳，王浩.中藥保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2006，14(10)：907-910.

GAO L L，WANG H.Advances in vascular endothelial cell structure and function of medicine to protect[J].ChineseJournalofArteriosclerosis，2006，14(10)：907-910.(in Chinese)

[5]馬妍，郭利平.芪參益氣滴丸預(yù)適應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷的延遲保護(hù)作用[J].西部中醫(yī)藥，2015，28(5)：11-14.

MA Y，GUO L P.QiShen YiQi dripping pills-induced delayed preconditioning of endothelial cells to hypoxic injury of myocardial cells[J].WesternJournalofTraditionalChineseMedicine，2015，28(5)：11-14.(in Chinese)

[6]明松林，何冬梅，王鳳英，等.清源生化湯對(duì)創(chuàng)傷后膿毒癥患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2015，27(4)：536-538.

MING S L，HE D M，WANG F Y，et al.Protective effects of Qingyuan Shenghua Decoction of post-traumatic vascular endothelial cells in patients with sepsis[J].ClinicalJournalofTraditionalChineseMedicine，2015，27(4)：536-538.(in Chinese)

[7]朱杰.白頭翁湯研究近況[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2005，3(1)：40-42.

ZHU J.Recent situation in research of the Windflower Decoction[J].ChineseMedicineModernDistanceEducationofChina，2005，3(1)：40-42.(in Chinese)

[8]孫俊穎，彭新宇，魏光偉，等.白頭翁湯的藥理作用研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(12)：112-113.

SUN J Y，PENG X Y，WEI G W，et al.Advances in the pharmacological effects of Pulsatilla soup[J].GuangdongAgriculturalSciences，2010(12)：112-113.(in Chinese)

[9]王瑞鋒，王雪.白頭翁湯的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，25(2)：270-271.

WANG R F，WANG X.Analysis on pharmacology and clinical application of pulsatilla decoction[J].ChinaJournalofChineseMedicine，2010，25(2)：270-271.(in Chinese)

[10]中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二○一○年版一部[M].2010：53-54，392.

CCVP.Veterinary Pharmacopoeia of the People’s Republic of China[M].2010：53-54，392.(in Chinese)

[11]STANDISH A J，WEISER J N.Human neutrophils kill Streptococcus pneumoniae via serine proteases[J].JImmunol，2009，183(4)：2602-2609.

[12]LEMON J K，WEISER J N.Degradation products of the extracellular pathogen Streptococcus pneumoniae access the cytosol via its pore-forming toxin[J].MBio，2015，6(1)：e02110-e02114.

[13]任冬娟.內(nèi)毒素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的研究進(jìn)展[J].中外健康文摘，2011，8(42)：223-225.

REN D J.Research endotoxin injury vascular endothelial cells[J].WorldHealthDigest，2011，8(42)：223-225.(in Chinese)

[14]張濤，穆祥，黃會(huì)嶺，等.微血管內(nèi)皮細(xì)胞在中醫(yī)學(xué)研究中的地位探討[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(5)：391-393，396.

ZHANG T，MU X，HUANG H L，et al.Discussion about the roles of microvascular endothelial cells in the studies of traditional Chinese medicine[J].ChineseJournalofBasicMedicineinTraditionalChineseMedicine，2005，11(5)：391-393，396.(in Chinese)

[15]楊雪靜，侯佳惠.姜黃素對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響及機(jī)制研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2015，27(8)：900-903.

YANG X J，HOU J H.Effect of curcumine on the expression of COX-2 induced by LPS in vascular endothelial cells[J].ChineseJournalofMicroecology，2015，27(8)：900-903.(in Chinese)

[16]郭曉辰，張軍平.中藥抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究概況[J].中醫(yī)雜志，2012，53(20)：1784-1786.

GUO X C，ZHANG J P.TCM inhibits apoptosis mechanism of action of vascular endothelial overview[J].JournalofTraditionalChineseMedicine，2012，53(20)：1784-1786.(in Chinese)

[17]趙宏宇，鄭璐玉，張旭，等.丹參麥冬水溶性部位對(duì)過氧化氫致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2010，30(3)：73-76.

ZHAO H Y，ZHENG L Y，ZHANG X，et al.The effect of water-soluble part of radix salviae miltiorrhizae and radix ophiopogonis on vacsular endotheliocyte apoptosis damaged by H2O2[J].ModernTraditionalChineseMedicine，2010，30(3)：73-76.(in Chinese)

[18]張磊，孫靜，張濤，等.黃芪水煎液誘導(dǎo)大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及分泌IFN-γ的研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36(3)：50-53.

ZHANG L，SUN J，ZHANG T，et al.Study onastragalusaqua induced proliferation and IFN-γ secretion intestinal mucosal micorvascular endothelial cells in rat[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2015，36(3)：50-53.(in Chinese)

[19]韓捷，梁華龍.白頭翁湯治療潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2001，16(3)：23-26.

HAN J，LIANG H L.Experimental study of the mechanism of ulcerative colitis Pulsatilla decoction[J].HenanJournalofTraditionalChineseMedicineandPharmacy，2001，16(3)：23-26.(in Chinese)

[20]胡屹屹，穆祥，胡元亮.中藥方劑白頭翁湯抗細(xì)菌內(nèi)毒素的作用研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，16(6)：132-136.

HU Y Y，MU X，HU Y L.Study on the antiendotoxin action of Pulsatillae Decoction[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity，2011，16(6)：132-136.(in Chinese)

[21]胡屹屹，穆祥，胡元亮.白頭翁湯及其主要成分對(duì)LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO、E-selectin和IL-8的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43(1)：145-151.

HU Y Y，MU X，HU Y L.Effects of Pulsatillae Decoction and its main ingredients on LPS-induced NO，E-selectin and IL-8 secretion of endothelial cells[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2012，43(1)：145-151.(in Chinese)

[22]SWERLICK R A，LAWLEY T J.Role of microvascular endothelial cells in inflammation[J].JInvestDermatol，1993，100(1)：111S-115S.

[23]MARKI A，ESKO J D，PRIES A R，et al.Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment[J].JLeukocBiol， 2015，98(4)：503-515.

[24]劉曉曄，張濤，董虹，等.白頭翁湯對(duì)大鼠跨內(nèi)皮遷移的中性粒細(xì)胞溶菌酶的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45(1)：142-146.

LIU X Y，ZHANG T，DONG H，et al.Effects of Pulsatilla Decoction on the lysozyme of transendothelial migration of polymorph nuclear neutrophils in rat[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica， 2014，45(1)：142-146.(in Chinese)

(編輯白永平)

Pulsatillae Decoction Improves the Bactericidal Capacity of Neutrophils by Protection of Integrity of Microvascular Endothelial Cells

WANG Ming-ming，YANG Shu，DONG Hong*，MU Xiang*

(BeijingKeyLaboratoryofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，BeijingUniversityofAgriculture，Beijing102206，China)

Abstract:The aims of this paper was to investigate the protective effect of pulsatillae decoction (PD) on endothelial cells injured by lipopolysaccharide (LPS) and to reveal the pharmacological of PD.The cell proliferation and cytotoxicity of the rat microvascular endothelial cells (RIMVECs) were determined by WST-1 ELISA kit and lactate dehydrogenase (LDH) assay.In addition，the RIMVECs damage stimulated by LPS was observed by hematoxylin-eosin (HE) and Hoechst 33342 staining.The transedothlial neutrophils killing was detected by gentamicin protection assay though the build of Transwell.The results showed that LPS (1 μg·mL-1) make the nuclei of RIMVECs shriveled and damage the cell membrane of RIMVECs and lead to cell fall off.The rate of cytotoxicity was 53.2%.The rate of separated cells wass 39.6%.PD(20 μg·mL-1)had the significant proliferative effect for that.LPS induced transendothelial migration of neutrophils can reduce the survival of bacteria in both intracellular and extracellular under the effect of 20 μg·mL-1PD (P<0.01).Results reveal that PD can improve the sterilization function of PMNs by the effective protection of LPS-induced injury of RIMVECs，and might improve the sterilization function of PMNs by protecting the integrity of the RIMVECs to provide a theoretical basis for the dose of clinical treatment of bacterial animal diseases.

Key words:pulsatillae decoction；microvascular endothelial cells；lipopolysaccharide；polymorph nuclear neutrophils

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.025

收稿日期：2015-10-16

基金項(xiàng)目：國家自然基金項(xiàng)目(31272144；31572558)；北京市科委科技計(jì)劃(Z121100007412004)；北京市科技新星(Z141105001814041);北京市自然科學(xué)基金(6132007)

作者簡(jiǎn)介：王明明(1990-)，女，遼寧沈陽人，碩士生，主要從事中獸醫(yī)藥及疾病防控方面研究，E-mail：592477872@qq.com *通信作者：穆祥，教授， Tel：010-80799515，E-mail：muxiang1109@sina.com；董虹，副教授，Tel：010-80799480, E-mail：donghong523@163.com

中圖分類號(hào)：S853.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0836-08