鼠傷寒沙門菌rpoN基因缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究

蘇洋洋，黃　駿，吳　白，印云聰，劉　珍，陳素娟，彭大新，劉秀梵

(揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

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鼠傷寒沙門菌rpoN基因缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究

蘇洋洋，黃駿，吳白，印云聰，劉珍，陳素娟，彭大新*，劉秀梵

(揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

摘要：為了探索σ因子RpoN在鼠傷寒沙門菌生物被膜形成過程中的作用，對兩株生物被膜形成能力較強的鼠傷寒沙門菌利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建rpoN基因缺失株，利用原核表達(dá)載體構(gòu)建回復(fù)株；比較野生株、缺失株和回復(fù)株的生物被膜形成能力和對環(huán)境應(yīng)激抵抗力的差異，并通過建立的csgA和bcsA基因?qū)崟r定量PCR方法檢測編碼生物被膜成分基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，與野生株相比，△rpoN缺失株生物被膜形成能力增強，主要由卷曲菌毛表達(dá)量顯著增加引起?；貜?fù)株生物被膜形成能力與野生株相似。△rpoN缺失株在酸性應(yīng)激和堿性應(yīng)激條件下對外界環(huán)境應(yīng)激的抵抗力均顯著增強。RpoN為鼠傷寒沙門菌中生物被膜形成相關(guān)σ因子之一，為進(jìn)一步研究沙門菌生物被膜形成的調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門菌；生物被膜；rpoN基因；突變株；環(huán)境應(yīng)激

沙門菌屬是腸桿菌科中重要的病原菌屬，人感染后常引起腸炎和急性胃腸炎等。全球每年感染沙門菌病例約有9千多萬，其中死亡人數(shù)高達(dá)15萬[1]。鼠傷寒沙門菌為泛嗜性的沙門菌，能引起家禽、哺乳動物和人的感染，是目前世界各國分離率最高的菌型之一，具有重要的公共衛(wèi)生意義[2]。

σ因子是RNA聚合酶全酶的重要組成成分，專一性地識別特定的啟動子并起始轉(zhuǎn)錄。腸桿菌科的細(xì)菌中存在多種σ因子[3]，其中RpoS(由rpoS基因編碼)能夠在細(xì)菌的指數(shù)生長期和穩(wěn)定生長期受到環(huán)境應(yīng)激時調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。rpoS基因的缺失可影響沙門菌生物被膜形成，降低其對環(huán)境應(yīng)激的抵抗力。除rpoS基因外，其他σ因子也參與了卷曲菌毛和纖維素的合成及生物被膜的形成。由于這種rpoS基因不依賴調(diào)控途徑在鼠傷寒沙門菌占有一定的比例，有必要鑒定出沙門菌中參與卷曲菌毛和纖維素的合成及生物被膜形成的其他σ因子，并闡明其調(diào)控通路。前期研究發(fā)現(xiàn)，RpoN、RpoE、FliA、RpoH、RpoS、RpoD等6 個σ因子在沙門菌指數(shù)期和生物被膜形成期的基因表達(dá)存在差異[4]。本研究運用Red同源重組法構(gòu)建出兩株生物被膜的形成能力較強的鼠傷寒沙門菌的rpoN基因缺失株，通過結(jié)晶紫染色法測定其生物被膜的形成能力，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測了編碼卷曲菌毛合成的csgA基因和編碼纖維素合成的bcsA基因的表達(dá)差異，最終確定rpoN基因缺失可導(dǎo)致鼠傷寒沙門菌生物被膜形成能力增強。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒鼠傷寒沙門菌S016、S025為本實驗室臨床病料分離株；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；質(zhì)粒pKD46含有溫度敏感型復(fù)制子；質(zhì)粒pKD3含氯霉素抗性基因和FRT位點；質(zhì)粒pCP20含氨芐青霉素抗性和氯霉素抗性的溫度敏感性復(fù)制子，為美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Murphy教授惠贈。

1.1.2儀器和試劑酶標(biāo)儀(BIO-TEK)，LightCycler?Nano實時熒光PCR儀(Roche)。結(jié)晶紫(Crystal Violet)、剛果紅(Congo red)和考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue)購自上海生工生物工程有限公司；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基TSB購自Fluka公司；限制性核酸內(nèi)切酶、Taq酶、dNTP、T4連接酶等購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，質(zhì)粒抽提試劑盒QIAprep Spin Miniprep Kit購自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM均購自TaKaRa生物工程公司(大連)。

1.2生物被膜的結(jié)晶紫染色測定

參照L.A.Pratt等[5]方法，利用96孔聚苯乙烯U型細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行沙門菌生物被膜結(jié)晶紫染色定量測定。每次試驗重復(fù)2個孔，置于酶標(biāo)儀測定OD550 nm值，重復(fù)三次取其平均值。

1.3生物被膜成分的檢測

挑取單個菌落接種于液體TSB中，37 ℃、220 r·min-1過夜振蕩培養(yǎng)，取10 μL培養(yǎng)液分別接種于含剛果紅(40 mg·L-1)和考馬斯亮藍(lán)(20 mg·L-1)平板或含熒光增強劑(200 mg·L-1)的無鹽LB平板，置于28 ℃靜置培養(yǎng)，4 d后比較各菌落的形態(tài)，后者于紫外燈下觀察各菌落的熒光強度[6]。

1.4rpoN因子基因缺失株的構(gòu)建

缺失株構(gòu)建方法按照K.C.Murphy等[7]的方法進(jìn)行，λ Red同源重組所用引物由兩部分組成，分別是5′端50 bp的序列與目的基因兩側(cè)序列同源，和3′端20 bp的序列與pKD3質(zhì)粒中氯霉素抗性基因(cat)兩端序列同源，打靶引物rpoN-D1/rpoN-D2序列見表1。所有引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以鼠傷寒沙門菌S016和S025為母本進(jìn)行同源重組操作，煮沸裂解法提取缺失株的DNA，以引物rpoN-F/rpoN-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，野生株、cat基因插入株和無抗性缺失株P(guān)CR擴(kuò)增預(yù)期的片段大小分別為1 434、1 192 和263 bp。鑒定正確的缺失株分別命名為S016ΔrpoN和S025ΔrpoN。

表1PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1Primers used for amplification of PCR

引物Primers序列(5'→3')PCRPrimesequences用途PurposerpoN-FrpoN-RATGAAGCAAGGTTTGCAACTCAGGCTCAAACCAGCTGTTTGCGTTGGTTTPrimersusedforamplificationofrpoNgenesrpoN-D1ATGACGCCTCAGCTACAACAGGCCATCCGTCTGTTGCAGTTGTCTACGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCrpoN-D2ATGGATAAAGACTCTCGGTACTTCGCAACAGTGCGGCGCGCCACCATGATCATATGAATATCCTCCTTAGPrimersusedforamplificationoffragmentswithcatgenerpoN-HFrpoN-HRCGGGATCCATGAAGCAAGGTTTGCAACTCAGGCCCGCTCGAGTCAAACCAGCTGTTTGCGTTGGTTTPrimersusedforgenecomplementationcsgA-FcsgA-RATGAAACTTTTAAAAGTGGCAGCTTAATACTGGTTAGCCGTGGPrimersusedforamplificationofcsgAgenesbcsA-FbcsA-RCATTTACGCTTCGCTTGGTCCCTTTGTGCGGATTGAPrimersusedforamplificationofbcsAgenescsgA-QFcsgA-QRbcsA-QFbcsA-QRTCGACCAGTGGAACGCTAAAAACCAACCTGACGCACCATTACCGGGCGTGAATCATTTCGTCTCAGGAACCAGCCCATTGTCqRT-PCR

1.5實時熒光定量PCR檢測csgA基因和bcsA基因的表達(dá)

1.5.1引物設(shè)計根據(jù)csgA基因和bcsA基因的核苷酸序列，設(shè)計PCR擴(kuò)增引物和qRT-PCR引物，引物序列見表1。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)品制備以細(xì)菌DNA為模板，csgA-F/R和bcsA-F/R為引物PCR擴(kuò)增csgA基因和bcsA基因，克隆至pEASY-T3載體獲得重組質(zhì)粒。用EcoRⅠ酶切后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒送測序。1.5.3細(xì)菌總RNA的提取與RNA反轉(zhuǎn)錄取37 ℃ 220 r ·min-1過夜培養(yǎng)的菌液用1∶10稀釋的TSB培養(yǎng)基按1∶100稀釋，接種到聚丙乙烯一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶，28 ℃靜置培養(yǎng)4、8和24 h。使用RNApure超純總RNA快速提取試劑盒提取樣品菌液的RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 說明去除DNA進(jìn)而反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA作為模板，csgA-QF/QR和bcsA-QF/QR為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。1.5.4實時熒光定量RT-PCR熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM(2*)10.0 μL，PCR Forward Primer (10 μmol·L-1)、PCR Reverse Prime (10 μmol·L-1)各0.4 μL，ROX Reference Dye (50*)0.4 μL，DNA模板2.0 μL，dH2O(滅菌蒸餾水) 6.8 μL，共20.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個循環(huán)；熔解曲線階段：60 ℃ 15 s，95 ℃ 1 s。以擴(kuò)增曲線、Ct值為標(biāo)準(zhǔn)，通過軟件分析得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算目的基因的拷貝數(shù)。

1.6回復(fù)株的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中的rpoN基因序列設(shè)計擴(kuò)增引物(rpoN-HF/rpoN-HR)，并在上下游引物中分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，以細(xì)菌基因組DNA為模板擴(kuò)增rpoN基因?？寺≈羛EASY T3載體后獲得重組質(zhì)粒pEASY-rpoN。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別對重組質(zhì)粒pEASY-rpoN和原核表達(dá)載體pGEX-6p-1進(jìn)行雙酶切，經(jīng)DNA純化試劑盒回收目的片段后連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。鑒定陽性克隆，測序驗證。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化分別轉(zhuǎn)入S016ΔrpoN和S025ΔrpoN中，并分別命名為S016ΔrpoNR和S025ΔrpoNR。

1.7生長曲線的測定

挑取野生株(S016、S025)、基因突變株(S016ΔrpoN、S025ΔrpoN)和回復(fù)株(S016ΔrpoNR、S025ΔrpoNR)的單個菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)液接種于新鮮LB培養(yǎng)基，OD600 nm值調(diào)至0.1，37 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)8 h，每隔1 h測定菌液的OD600 nm值，繪制出各菌株的生長曲線。

1.8對環(huán)境應(yīng)激抵抗力的測定

挑取單個菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)過夜后4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min，用等量的PBS重懸菌體，并將其OD600 nm調(diào)至0.5。酸性應(yīng)激條件(pH=5.0)下，37 ℃振蕩培養(yǎng)20 min；堿性應(yīng)激條件(pH=10.0)下，37 ℃振蕩培養(yǎng)30 min；54 ℃熱應(yīng)激條件下，取100 μL重懸菌液熱擊3 min；氧化應(yīng)激條件(10 μmol·L-1H2O2)下，37 ℃振搖培養(yǎng)30 min。取各應(yīng)激條件下所得菌液按10倍倍比稀釋，接種于麥康凱瓊脂平板，過夜培養(yǎng)后計數(shù)[8]。

2結(jié)果

2.1基因缺失株的鑒定

以引物RpoN-F/RpoN-R PCR擴(kuò)增2株鼠傷寒沙門菌rpoN基因，測序顯示開放閱讀框架全長1 434 bp，相似性99.9%。運用λ Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建出S016ΔrpoN、S025ΔrpoN基因缺失株。PCR鑒定，所有缺失株均擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶(圖1)。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.野生型菌株擴(kuò)增條帶；2.cat基因插入株擴(kuò)增條帶；3.缺失株擴(kuò)增條帶M.DL2000 marker；1.The amplified fragments of wild-type strain；2.The amplified fragments of mutants with cat gene；3.The amplified fragments of mutants without cat gene圖1　S016和S025突變株的PCR鑒定Fig.1　Identification of S016 and S025 mutants by PCR

2.2回復(fù)株的構(gòu)建

重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-rpoN經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切成約5 kb大小的pGEX-6p-1載體片段以及1.5 kb左右的rpoN目的片段，結(jié)果與預(yù)期相符，證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。將表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-rpoN分別導(dǎo)入兩株ΔrpoN缺失株中獲得回復(fù)株S016ΔrpoNR和S025ΔrpoNR。

M.1 kb DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. pGEX-6p-rpoNM.1 kb marker; 1. pGEX-6p-rpoN圖2　重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜Fig.2　Restriction endonuclease digestion pattern of recombinant plasmid

2.3生長曲線的測定

對野生株(S016、S025)、基因突變株(S016ΔrpoN、S025ΔrpoN)和回復(fù)株(S016ΔrpoNR、S025ΔrpoNR)OD600 nm值的測定，繪制出生長曲線(圖3)。由圖可見，與野生株相比，兩株rpoN基因缺失株的生長速度低于野生株?；貜?fù)株的生長速度與野生株相似。

2.4生物被膜形成能力及成分的測定

以結(jié)晶紫染色定量法測定生物被膜形成能力，結(jié)果顯示，野生株S016和S025的OD550 nm值分別為1.568±0.176和1.031±0.015，缺失株S016ΔrpoN和S025ΔrpoN的OD550 nm值分別為3.367±0.025和1.391±0.053。與野生株相比，S016ΔrpoN缺失株能形成較強的生物被膜，差異極顯著(P<0.01)；而S025ΔrpoN缺失株形成生物被膜的能力稍有增強(圖4)。

剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板法測定生物被膜成分結(jié)果顯示，野生株S016和S025均呈紅色干燥粗糙型菌落，紫外燈下熒光板的熒光強。與野生株相比，S016ΔrpoN缺失株呈更為明顯的紅色干燥粗糙型菌落，表面更為粗糙，同時紫外燈下熒光板熒光增強；而S025ΔrpoN缺失株表型變化與S016ΔrpoN缺失株類似，但程度弱于后者(圖5)。

*.P<0.05圖3　野生株S016(A)和S025(B)及各自缺失株和回復(fù)株的生長曲線Fig.3　Growth curves of wild-type strains S016(A)and S025(B) and their mutants and revertants

**.P<0.01圖4　96孔細(xì)胞板上形成生物被膜后結(jié)晶紫染色結(jié)果(A)以及OD550 nm測定(B)Fig.4　Biofilm formed on 96-well plate and stained by CV (A) and determination of OD550 nm(B)

圖5　野生株、缺失株及回復(fù)株的生物被膜表型及纖維素的表達(dá)測定Fig.5　The morphotype and expression of cellulose by wild-type strains，mutants and revertants

回復(fù)試驗結(jié)果顯示，回復(fù)株S016ΔrpoNR和S025ΔrpoNR的OD550 nm值分別為1.405±0.015和1.046±0.020，且菌落均呈現(xiàn)紅色干燥粗糙型，熒光強度與野生株相似，說明rpoN回復(fù)株恢復(fù)了類似野生株的生物被膜形成能力。

2.5qRT-PCR檢測csgA基因和bcsA基因的轉(zhuǎn)錄差異

以引物csgA-QF/QR和bcsA-QF/QR建立的qRT-PCR呈現(xiàn)單峰，說明特異性較好；擴(kuò)增曲線顯示重組質(zhì)粒濃度在102～109可形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，在生物被膜形成過程中，特別是在24 h，兩株缺失株編碼卷曲菌毛合成的csgA基因的轉(zhuǎn)錄量與野生株相比均顯著增加，其中S016ΔrpoN缺失株csgA基因的轉(zhuǎn)錄量增加極顯著；而缺失株編碼纖維素合成的bcsA基因的轉(zhuǎn)錄較野生株相比沒有顯著差異(圖6)。

*.P<0.05；**.P<0.01圖6　熒光定量PCR檢測細(xì)菌在生物被膜形成過程中csgA基因(A)和bcsA基因(B)的轉(zhuǎn)錄量Fig.6　Transcription of csgA (A) and bcsA (B) genes in Salmonella strains during the period of biofilm formation detected by the quantitative real-time PCR

A.熱應(yīng)激；B.氧化應(yīng)激；C.酸應(yīng)激；D.堿應(yīng)激。**.P<0.01A.Heat shock；B.Oxidative stress；C.Acid endurance；D.Alkali endurance.**.P<0.01圖7　野生株、缺失株和回復(fù)株對于環(huán)境應(yīng)激抵抗力的測定Fig.7　Determination of resistance to environmental stress for wild-type strains，mutants and revertants

2.6對環(huán)境應(yīng)激抵抗力的檢測

與野生株S016相比，S016ΔrpoN缺失株在酸性應(yīng)激和堿性應(yīng)激條件下對外界環(huán)境應(yīng)激的抵抗力均顯著增強(P<0.05)；在熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激條件下抵抗力輕度增強。與野生株S025相比，S025ΔrpoN缺失株對各種外界應(yīng)激的抵抗力均略有增強(圖7)。

3討論

鼠傷寒沙門菌是一種能引起人畜共患病的常見致病菌，能夠在動物體內(nèi)以及動物肉產(chǎn)品的包裝和轉(zhuǎn)運過程中形成生物被膜。從而起到抵御外界不利環(huán)境和宿主免疫系統(tǒng)的作用，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生和持續(xù)反復(fù)感染[9-11]。目前已發(fā)現(xiàn)多種與沙門菌生物被膜形成有關(guān)的基因，啟動生物被膜形成的中心基因是csgD，rpoS基因可通過直接或間接激活csgD基因調(diào)控卷曲菌毛和纖維素的合成，進(jìn)而影響生物被膜的形成[12-13]；rpoE基因也能通過調(diào)控卷曲菌毛的表達(dá)影響生物被膜的形成[14]。在本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，作者運用Red同源重組法構(gòu)建出兩株生物被膜形成能力較強的鼠傷寒沙門菌的rpoN基因缺失株，發(fā)現(xiàn)其生物被膜形成能力增強，由此推斷rpoN基因與鼠傷寒沙門菌生物被膜形成相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄起始是細(xì)菌基因調(diào)控的關(guān)鍵一步，rpoN基因能夠促進(jìn)活化劑依賴的轉(zhuǎn)錄起始，從而調(diào)節(jié)各種代謝和細(xì)菌的發(fā)病有關(guān)的基因表達(dá)。V.S.Iyer等研究發(fā)現(xiàn)，rpoN基因缺失可使糞腸球菌對自體溶解產(chǎn)生耐受，生物被膜的形成能力增強[15]。A.S.Belik等研究也表明，在大腸桿菌K-12中，rpoN基因缺失能增強細(xì)菌生物被膜的形成[16]。本研究構(gòu)建的兩株rpoN基因缺失株的生物被膜形成能力較野生株相比均有增強，同時在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板上菌落更為粗糙，熒光定量PCR檢測顯示在生物被膜形成時期缺失株csgA基因的表達(dá)顯著增加，說明其卷曲菌毛表達(dá)量增多；紫外燈下熒光板中rpoN基因缺失株的熒光強度與野生株相似，熒光定量PCR檢測顯示在生物被膜形成時期缺失株bcsA基因的表達(dá)量與野生株也無明顯差異，說明纖維素表達(dá)量沒有變化。因此，在鼠傷寒沙門菌中，rpoN基因的缺失也同樣可以增強細(xì)菌生物被膜的形成，并通過影響卷曲菌毛的合成而導(dǎo)致其生物被膜形成能力增強。

細(xì)菌處于外界不利條件(如極端的營養(yǎng)條件及溫度變化、氧化、抗菌素和消毒劑等)時，可產(chǎn)生胞外聚合物黏附在介質(zhì)表面，以固著的方式形成生物被膜，從而更好地適應(yīng)環(huán)境[17-19]。環(huán)境應(yīng)激試驗結(jié)果表明，rpoN基因缺失使細(xì)菌在酸應(yīng)激和堿應(yīng)激條件下對外界抵抗力增強，這可能與其生物被膜形成能力增強有關(guān)。因此，RpoN是一個重要的壓力調(diào)控因子。本研究鑒定出rpoN基因為鼠傷寒沙門菌中生物被膜形成相關(guān)σ因子之一，同時rpoN基因能夠通過影響卷曲菌毛的合成從而影響沙門菌生物被膜形成。這一發(fā)現(xiàn)不僅能豐富σ因子對生物被膜調(diào)控的機制，而且為新型藥物的設(shè)計和新型疫苗的研制提供靶標(biāo)。

4結(jié)論

成功構(gòu)建了2株鼠傷寒沙門菌rpoN基因缺失株。rpoN基因缺失株生物被膜形成能力增強，對外界環(huán)境應(yīng)激的抵抗力也顯著增強。以上結(jié)果表明RpoN為鼠傷寒沙門菌中生物被膜形成相關(guān)σ因子之一。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]MAJOWICZ S E，MUSTO J，SCALLAN E，et al.The global burden of nontyphoidalSalmonellagastroenteritis[J].ClinInfectDis，2010，50(6)：882-889.

[2]PATI N B，VISHWAKARMA V，JAISWAL S，et al.Deletion ofinvHgene inSalmonellaentericaserovarTyphimuriumlimits the secretion of Sip effector proteins[J].MicrobesInfect，2013，15(1)：66-73.

[3]ISHIHAMA A.Functional modulation ofEscherichiacoliRNA polymerase[J].AnnuRevMicrobiol，2000，54：499-518.

[4]黃駿，陳素娟，黃凱，等.雞白痢沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因rpoE的鑒定[J].微生物學(xué)報，2015，55(2)：156-163.

HUANG J，CHEN S J，HUANG K，et al.Identification ofrpoEgene associated with biofilm formation ofSalmonellapullorum[J].ActaMicrobiologicaSinica，2015，55(2)：156-163.(in Chinese)

[5]PRATT L A，KOLTER R.Genetic analysis ofEscherichiacolibiofilm formation：roles of flagella，motility，chemotaxis and type I pili[J].MolMicrobiol，1998，30(2)：285-293.

[6]ANRIANY Y，SAHU S N，WESSELS K R，et al.Alteration of the rugose phenotype inwaaGandddhCmutants ofSalmonellaentericaserovarTyphimuriumDT104 is associated with inverse production of curli and cellulose[J].ApplEnvironMicrobiol，2006，72(7)：5002-5012.

[7]MURPHY K C.Use of bacteriophage lambda recombination functions to promote gene replacement inEscherichiacoli[J].JBacteriol， 1998，180(8)：2063-2071.

[8]CHI F，WANG Y，GALLAHER T K，et al.Identification of IbeR as a stationary-phase regulator in meningiticEscherichiacoliK1 that carries a loss-of-function mutation inrpoS[J].JBiomedBiotechnol，2009，2009：520283.

[9]LEDEBOER N A，F(xiàn)RYE J G，MCCLELLAND M，et al.SalmonellaentericaserovarTyphimuriumrequires the Lpf，Pef，and Tafi fimbriae for biofilm formation on HEp-2 tissue culture cells and chicken intestinal epithelium[J].InfectImmun，2006，74(6)：3156-3169.

[10]HAMILTON S，BONGAERTS R J，MULHOLLAND F，et al.The transcriptional programme ofSalmonellaentericaserovarTyphimuriumreveals a key role for tryptophan metabolism in biofilms[J].BMCGenomics，2009，10：599.

[11]CRULL K，ROHDE M，WESTPHAL K，et al.Biofilm formation bySalmonellaentericaserovarTyphimuriumcolonizing solid tumours[J].CellMicrobiol，2011，13(8)：1223-1233.

[12]BROWN P K，DOZOIS C M，NICKERSON C A，et al.MlrA，a novel regulator of curli (AgF) and extracellular matrix synthesis byEscherichiacoliandSalmonellaentericaserovarTyphimurium[J].MolMicrobiol，2001，41(2)：349-363.

[13]GRANTCHAROVA N，PETERS V，MONTEIRO C，et al.Bistable expression of CsgD in biofilm development ofSalmonellaentericaserovartyphimurium[J].JBacteriol，2010，192(2)：456-466.

[14]YOO A Y，YU J E，YOO H，et al.Role of sigma factor E in regulation ofSalmonellaAgf expression[J].BiochemBiophysResCommun，2013，430(1)：131-136.

[15]IYER V S，HANCOCK L E.Deletion of sigma(54) (rpoN) alters the rate of autolysis and biofilm formation inEnterococcusfaecalis[J].JBacteriol，2012，194(2)：368-375.

[16]BELIK A S，TARASOVA N N，KHMEL’ I A.Regulation of biofilm formation inEscherichiacoliK12：effect of mutations in HNS，StpA，lon，andrpoNgenes[J].MolGenMikrobiolVirusol，2008(4)：3-5.

[17]COSTERTON J W，STEWART P S.Battling biofilms[J].SciAm，2001，285(1)：74-81.

[18]DE SILVA G D，KANTZANOU M，JUSTICE A.Theicaoperon and biofilm production in coagulase-negativeStaphylococciassociated with carriage and disease in a neonatal intensive care unit[J].JClinMicrobiol，2002，40(2)：382-388.

[19]DONLAN R M.Biofilms：microbial life on surfaces[J].EmergInfectDis，2002，8(9)：881-890.

(編輯白永平)

Construction and Biological Characterization of rpoN Gene Deletion Mutants ofSalmonellaTyphimurium

SU Yang-yang，HUANG Jun，WU Bai，YIN Yun-cong，LIU Zhen，CHEN Su-juan，PENG Da-xin*，LIU Xiu-fan

(JiangsuCo-InnovationCenterforthePreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseaseandZoonoses，CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

Abstract:The aim of this study was to understand the role ofrpoNgene on biofilm formation ofS.Typhimurium.TwoS.Typhimuriumstrains with strong biofilm-forming ability were selected for construction of deletion mutants with deficiency of generpoNusing the Red recombination system，and complemented strains were constructed by using prokaryotic expression vector.The biofilm-forming ability，and resistance to environmental stress of the wild-type，rpoNmutant andrpoNcomplemented strains were compared.A quantitative real-time PCR method based oncsgAandbcsAgenes was established to compare the expression of their biofilm components.The results showed that the biofilm formation，mainly contributed by increased expression of curli，was significantly enhanced in therpoNgene deletion mutants when compared with that of the wild-type strains.The biofilm formation of revertants was similar to that of the wild-type strains.Furthermore，deletion ofrpoNgene ofS.Typhimuriumstrains resulted in their increased resistance to acid and alkali environment.Therefore， RpoN was identified as one of the associated sigma factors involved in biofilm formation ofS.Typhimurium.These data may be helpful for elucidating the regulatory mechanism ofSalmonellabiofilm formation.

Key words:SalmonellaTyphimurium；biofilm formation；rpoNgene；mutants；environmental stress

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.017

收稿日期：2015-10-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31572530)；公益行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303044)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程；江蘇省家禽疫病防控工程技術(shù)研究中心(BM2013450)

作者簡介：蘇洋洋(1992-)，江蘇漣水人，碩士生，主要從事微生物學(xué)研究，E-mail:1106610036@qq.com *通信作者：彭大新，E-mail: pengdx@yzu.edu.cn

中圖分類號：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0771-08