“肝中酮體的生成作用”實驗改進及技巧

靳彩虹（甘肅醫(yī)學院生化教研室，甘肅平?jīng)?44000）

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“肝中酮體的生成作用”實驗改進及技巧

靳彩虹
（甘肅醫(yī)學院生化教研室，甘肅平?jīng)?44000）

摘要：通過分析“肝中酮體的生成作用”實驗中學生在小白鼠抓取、處死、組織勻漿液制備、反應液配制等環(huán)節(jié)中出現(xiàn)的各種問題，提出了一系列改進方法及技巧，規(guī)范了操作，提高了實驗教學效果。

關鍵詞：小白鼠；酮體；實驗改進；實驗技巧

Abstract:Through the analysis of various problems which occurs in the experiment of "the generation of ketone bodies in liver" when students fetched mice，executed mice，tissued mice serum and reaction liquid preparation，the paper puts forward a series of improvement methods and skills to standardize the operations and improve experimental teaching results.

Keywords:mice；ketone bodies；experimental improvements；experimental skills

生物化學是一門實驗性學科，實驗對于加深理論知識的理解、鞏固記憶，培養(yǎng)分析解決問題能力以及提高創(chuàng)新思維等方面有著極其重要的意義?！案沃型w的生成作用“是我校?？粕谏锘瘜W實驗中選做的唯一一項動物實驗，學生實驗中往往出現(xiàn)各種問題影響著教學效果。作者結(jié)合多年教學經(jīng)驗談幾點實驗改進技巧，旨在解決學生實驗中的存在問題，提高實驗成功率，同時，提升學生的綜合素質(zhì)。

一、實驗原理

利用丁酸作為底物，與含有酮體生成酶系的肝勻漿混勻、保溫后即有酮體生成。酮體中乙酰乙酸和丙酮可與含亞硝酰鐵氰化鈉的顯色粉反應產(chǎn)生紫紅色化合物；而經(jīng)過同樣處理的肌肉勻漿，則不產(chǎn)生酮體，因此，與顯色粉作用無顏色反應。

二、基本操作步驟

首先，取小白鼠一只，處死，迅速剖腹取出肝臟和肌肉組織，剪碎，分別放入勻漿器中，加入生理鹽水（按重量：體積為1：3），研磨成勻漿（加少許細砂）。然后取試管四支，編號后按表1加入各種試劑。搖勻四支試管，置于37℃恒溫水浴中保溫40～50分鐘后取出，各管再分別加入15%三氯醋酸20滴，搖勻混合，離心3分鐘（3000轉(zhuǎn)/分）。最后，分別取出上述各管離心液10滴放于有凹白瓷反應板上，每凹加顯色粉1小匙（約0.1g）攪勻，觀察所產(chǎn)生的顏色反應［1，2］。

表1　肝中酮體生成作用反應液

三、理論結(jié)果

第一管為紫紅色，其他試管為無色。

四、實驗中存在的問題及改進技巧

（一）處死實驗動物

由于學生初次接觸小白鼠，實驗中狀況百出：如有的逗著玩、不忍心處死、觀望、不動手實驗；有的不敢碰，小鼠亂跑，學生亂叫，不會抓取；有的將小鼠塞進水里淹死；有的斷頭處死。在教學中我們首先教育學生要善待小動物，不隨便傷害他們。實驗用小白鼠要求在不影響實驗結(jié)果的前提下盡量選擇不很痛苦死亡方式。實驗前老師先示教：即右手拿鑷子迅速從頸背部按壓住小鼠后，左手拇指和食指分別捏住小鼠兩耳，小指和小魚際夾住尾巴，翻過來使小鼠腹部朝上。在正確抓取之后，換右手迅速用拇指和食指捏住尾巴，快速輪轉(zhuǎn)，再猛摔頭于地上，最后使其頸部脫臼致死。這樣摔死方法可以避免學生被小鼠抓傷、咬傷，小鼠死亡時間短、出血也少。同上，節(jié)約了實驗時間。

（二）組織剪切

本實驗要求剪下小鼠的肝臟及兩個大腿的肌肉。學生實驗中常見小鼠的肝臟被夾碎，出血對多；直接剪下雙大腿，拿

在手中撥毛皮，再剪肌肉，制備的肌勻漿中混有毛和骨頭。針對這種情況，我們首先按手術學要求給學生示教：鑷子是拇指對中指與食指，執(zhí)二鑷腳中上部；剪刀持法是用拇指和第四指分別插入剪刀柄兩環(huán)中，中指在第四指環(huán)的剪刀柄上，食指壓在軸節(jié)處起穩(wěn)定和向?qū)ё饔?。剪開腹部皮膚及皮下組織，打開腹膜，暴露出肝臟，用鑷子輕輕夾住肝臟游離緣，剪刀沿肝臟根部一葉一葉完整剪出肝葉，這樣剪取肝臟出血少。取腿部肌肉時，在膝關節(jié)處先一手用鑷子提起皮膚，剪開膝上部一圈的皮膚，夾住膝部，用剪刀向大腿近端刮撥皮毛就可以暴露出肌肉，一點點地剪下肌肉即可，不必剪斷雙腿骨頭。試驗中還可以提示學生是否能采用其它組織（如腎臟等）代替肌肉組織。

（三）勻漿液制備

小鼠肝臟較小，酶活性弱，實驗現(xiàn)象可能不明顯，可以合并兩個實驗臺的兩只小鼠的肝臟，用水沖洗干凈表面的血，再制備勻漿液。肌肉勻漿液也同樣收集兩只小鼠的四條后大腿肌肉制備。

（四）試劑量取與反應液制備

本實驗為定性實驗，試劑用滴管加，顯色粉用藥匙加。學生常犯錯誤是多種試劑共用一個滴管加，取試劑前不清洗，這樣使試劑相混；有的學生不搖勻就保溫。由于四管的區(qū)別主要是肝勻漿和肌勻漿，故要特別強調(diào)每加一種試劑一定要清洗滴管，養(yǎng)成每取完一種試劑將本試劑瓶蓋蓋好，滴管放入盛有蒸餾水的燒杯中，使用前清洗的習慣。實驗中也常見學生每人拿一支試管滴加試劑，保溫、離心等，這樣使得每管反應液從量到質(zhì)差異較大。為減少人為因素造成的誤差。除了每種試劑盡量由同一操作者同時加入，以把握試劑量的均勻一致外，還可以將滴數(shù)換算為體積［3］（每ml約15～25滴，平均20滴），用吸量管或微量進樣器加入。一勺顯色分稱量后，取等量顯色分加入其它三只試管。

（五）保溫

本實驗從動物處死、肌肉和肝臟勻漿液制備、滴加試劑、保溫、離心到顯色，大約需要90分鐘，學生往往操作不熟練，不能再有限的課時內(nèi)完成實驗?？梢蕴崾緦W生結(jié)合酶學相關知識思考如何能縮短反應時間？學生會聯(lián)系到溫度對酶促反應的影響，即通過提高最適溫度來縮短反應時間。這時候再提示學生配置幾只試管，分別設置不同溫度及時間［4］，觀察反應結(jié)果，從而得出本實驗保溫的最短時間是多少。如我們在實驗中將原來37℃反應調(diào)整為40℃～45℃，使保溫時間從原來的40～50分鐘縮短為20～30分鐘。

（六）顯色

加顯色粉攪拌時也一樣，每攪拌一管，玻璃棒要清洗后，再攪拌第二只試管的反應液?；蛘咴诒卷棽僮髦锌梢詮牡谒墓荛_始，依次三、二、一管順序分別攪拌，觀察顏色。實驗結(jié)果一般只有第一管顯示為淡紅色，其它各管均為無色。但試驗中也見第二管出現(xiàn)淡紅色的，這要提示學生正確分析：一方面因為肝勻漿中存在有少量酮體，可以遇顯色粉呈色，但第一管在第二管基礎上有新生成的酮體，故第一管顏色較第二管深；另一方面，第二管在沒加入底物的條件下是不能生成酮體的，如果肝勻漿中酮體含量少，不會出現(xiàn)顏色的，可能操作有誤；再者，顏色的深淺和所加的酮體試劑的量有密切的關系，加的酮體試劑越多，顏色越深，因此要把握酮體粉的量一致。

生化作為醫(yī)學院校各專業(yè)學生必修的一門基礎課程，實驗所占比例大，不斷改進實驗教學是提高教學質(zhì)量的重要途徑。本實驗通過對細節(jié)問題的分析與改進，一方面，讓學生規(guī)范操作，減少干擾因素，提高實驗的成功率，培養(yǎng)其創(chuàng)新思維及分析、解決問題的能力。另一方面，用科學、正確的態(tài)度和嚴謹?shù)淖黠L對待動物實驗，正確認識小鼠，學會正確拿取，為后續(xù)學科中小鼠實驗和外科手術中器械的正確使用奠定基礎。

參考文獻

［1］黃平.生物化學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：245-246.

［2］張申，莊景凡.醫(yī)學生物化學實驗指導與學習指南［M］.北京：北京大學醫(yī)學出版社，2011：32-33.

［3］何旭輝.生物化學（第2版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：220-222.

［4］龍躍娥.酮體生成的實驗改進［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育，2009，27（11）：159.

中圖分類號：G642

文獻標志碼：A

文章編號：2096-000X（2016）10-0136-02

作者簡介：靳彩虹（1968，6-），女，副教授，研究生學歷，主要從事生物化學及生物化學檢驗教學和研究工作。