趙宸，王艷，方媛，黃珍珍，任偉，陳薇，王麗華，胡聞，王科，倪力軍

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 腎臟內(nèi)科，b 病理科，合肥 230001)

?

·基礎(chǔ)研究·

雷米普利通過抑制胰島素樣生長因子-1減輕糖尿病腎病大鼠腎系膜基質(zhì)聚集的研究

趙宸a，王艷a，方媛a，黃珍珍a，任偉a，陳薇a，王麗華a，胡聞b，王科a，倪力軍a

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 腎臟內(nèi)科，b 病理科，合肥 230001)

[摘要]目的探討雷米普利對糖尿病腎病(DN)大鼠胰島素樣生長因子-1(IGF-1)表達及腎系膜基質(zhì)聚集的影響。方法SD大鼠分為健康對照組(NC組，n=12)、DN組(n=11)、DN雷米普利干預(yù)組(DN+RAM組，n=12)，腹腔注射鏈脲佐菌素構(gòu)建DN模型，DN+RAM組予雷米普利3 mg·kg-1·d-1灌胃8周，檢測腎重/體質(zhì)量、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐；HE染色和電鏡觀察腎臟病理改變；免疫組織化學檢測腎組織IGF-1表達；Western blot檢測IGF-1、纖維連接蛋白(FN)、IV型膠原(Col-IV)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達。結(jié)果與NC組比較，DN組大鼠腎重/體質(zhì)量、FBG、HbA1c、24h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐明顯升高，腎小球肥大和系膜基質(zhì)聚集明顯，IGF-1、FN和Col-IV蛋白表達明顯增加，MMP-2表達明顯降低(P<0.05)。與DN組比較，DN+RAM組上述指標除FBG和HbA1c外均明顯改善(P<0.05)。IGF-1蛋白表達與24 h尿蛋白定量(r=0.937)、FN(r=0.896)和Col-IV(r=0.871)表達呈顯著正相關(guān)，與MMP-2(r=-0.826)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論雷米普利可通過抑制IGF-1的表達，減輕腎系膜基質(zhì)聚集，發(fā)揮腎臟保護作用。

[關(guān)鍵詞]糖尿病腎??；胰島素樣生長因子Ⅰ;雷米普利；大鼠,Sprague-Dawley

1材料與方法

1.1實驗動物及制備模型健康SPF級雄性8周齡SD大鼠36只，體質(zhì)量(190±10)g，由安徽醫(yī)科大學實驗中心提供，合格證SCXK(皖)2005-001，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。采用隨機數(shù)字表法將其隨機分為健康對照組(NC組， 12只)、DN組(12只)和DN雷米普利干預(yù)組(DN+RAM組，12只)。DN組和DN+RAM組大鼠禁食14 h后予腹腔注射單劑量STZ(美國Sigma公司)60 mg/kg，48 h、72 h及1、2、4周末空腹采尾靜脈血，并留取尿液。血糖>16.7 mmol/L且尿蛋白排泄率大于30 mg/24 h視為DN大鼠模型構(gòu)建成功[5]。DN組中1只大鼠血糖未達標予剔除，余均造模成功。NC組予腹腔單次注射等量枸櫞酸緩沖液。造模成功后，DN+RAM組大鼠予雷米普利(法國賽諾菲-安萬特公司產(chǎn)，2.5 mg/片，批號：H20040517)3 mg·kg-1·d-1灌胃8周，NC組和DN組予等量蒸餾水灌胃。實驗期間喂標準飼料，自由飲水，不用胰島素。

1.2標本采集第8周末處死大鼠前于代謝籠留取24 h尿液。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，心臟采血4～5 mL并離心分離血清，測定生化指標。稱量左腎重量，計算腎重/體質(zhì)量(mg/g)；部分組織用10%中性甲醛固定并石蠟包埋，其余置于冰上剪碎，凍存于-80 ℃冰箱。

1.3指標測定

1.3.1生化指標采用日立7600-020型全自動生化分析儀測定空腹血糖、血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)水平，親和層析法檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)，免疫比濁法測定24 h尿蛋白定量。

1.3.2腎臟病理蠟塊連續(xù)2～3 mm切片，常規(guī)脫蠟后行蘇木素-伊紅(HE)染色，400倍光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學改變，每切片隨機取10個不同視野采集圖片。部分腎皮質(zhì)切成l mm3的立方小塊用2.5%戊二醛固定，制作超薄切片，鉛鈾雙染色后在日產(chǎn)JEM-1230型透射電子顯微鏡下觀察各組腎臟病理變化。

1.3.3免疫組織化學采用Elivision法檢測腎組織IGF-1的表達。蠟塊連續(xù)4 mm切片，脫蠟水化后用3% H2O2封閉，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗后，滴加兔抗大鼠IGF-1抗體50 μL(武漢博士德公司)，4 ℃過夜，以PBS代替一抗作陰性對照。滴加聚合物增強劑和酶標羊抗兔聚合物(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)，37 ℃ 20 min。滴加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，樹膠封片。200倍光鏡下隨機選取皮質(zhì)區(qū)20個視野，棕黃色顆粒為陽性，采用全自動圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0)檢測IGF-1陽性信號的累積吸光度和總面積，計算陽性信號的平均吸光度值(AOD)。

1.3.4Western blot從凍存腎組織取100 mg加入組織總蛋白提取液1 mL，冰上裂解30 min。4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。取60 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后以260 mA電轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h。分別加入兔抗大鼠 IGF-1、FN、Col-IV和MMP-2單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，均按1 ∶1000稀釋，4℃孵育過夜。TBST洗膜后加辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的二抗，室溫孵育1h后ECL液進行顯色。采用 Quantity One 軟件分析條帶，以目的蛋白與同一標本內(nèi)參照β-actin的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達量。

2結(jié)果

2.1一般情況及生化指標的比較給藥8周后，與NC組比較，DN組大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食及多尿癥狀，精神較差，活動減少，DN+RAM組上述癥狀較DN組有改善。與NC組比較，DN組和DN+RAM組腎重/體質(zhì)量、空腹血糖、HbA1c、24 h尿蛋白、血BUN和Cr均顯著升高(P<0.05)。與DN組比較，DN+RAM組除空腹血糖和HbA1c差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余指標均顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1　第8周時各組大鼠一般情況及生化指標比較 ±s)

注：與NC組比較，aP<0.05；與DN組比較，bP<0.05

2.2腎臟組織病理學改變HE染色400倍鏡下示：NC組腎小球形態(tài)和結(jié)構(gòu)無明顯異常改變；DN組腎小球肥大，系膜細胞增生，細胞外基質(zhì)明顯增多，系膜區(qū)擴大；與DN組比較，DN+RAM組上述病理改變明顯改善，腎小球縮小，系膜細胞數(shù)減少，細胞外基質(zhì)輕度增生，見圖1。

電鏡結(jié)果示：與NC組比較，DN組腎小球基底膜增厚，系膜區(qū)基質(zhì)增生、腫脹，有少許電子致密物質(zhì)沉積；與DN組比較，DN+RAM組腎小球基底膜無明顯增厚，系膜區(qū)基質(zhì)輕度增生，見圖1。

2.3腎組織FN、Col-Ⅳ和MMP-2蛋白的表達Western blot結(jié)果示：與NC組比較，DN組和DN+RAM組大鼠FN和Col-IV蛋白均顯著增加，MMP-2蛋白顯著降低(P<0.05)；與DN組比較，DN+RAM組FN和Col-IV蛋白均顯著下調(diào)，MMP-2蛋白顯著上調(diào)(P<0.05)，見表2。

表2　各組FN、Col-IV、MMP-2和IGF-1蛋白相對

注：與NC組比較，aP<0.05；與DN組比較，bP<0.05

2.4腎組織IGF-1的表達NC組腎組織有少量IGF-1表達，DN組腎組織IGF-1表達量明顯升高，以胞漿和胞核著色為主，主要表達腎小球系膜區(qū)，腎小管也有表達，AOD值為0.37±0.02；DN+RAM組IGF-1腎小球系膜區(qū)染色減輕，AOD值為0.24±0.03，較DN組顯著下降(P<0.05)，但仍顯著高于NC組(P<0.05)，見圖1。

Western blot結(jié)果示：與NC組比較，DN組和DN+RAM組IGF-1蛋白表達顯著增加(P<0.05)；與DN組比較，DN+RAM組IGF-1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.5相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析結(jié)果示IGF-1蛋白表達與24 h尿蛋白定量(r=0.937)、FN(r=0.896)和Col-IV(r=0.871)蛋白表達呈顯著正相關(guān)，與MMP-2呈顯著負相關(guān)(r=-0.826，P<0.05)。

3討論

系膜區(qū)細胞外基質(zhì)的過度聚集是DN的最主要病理特點，是FN、Col-IV和層黏連蛋白(LN)等基質(zhì)蛋白合成增多和MMP-2表達降低引起基質(zhì)降解減少的共同結(jié)果[6]。MMP-2為鋅依賴的基質(zhì)金屬蛋白酶，是降解系膜中FN、Col-IV和LN蛋白的主要明膠酶，可減少細胞外基質(zhì)的聚集[7]。

本實驗Western blot結(jié)果示DN組MMP-2蛋白明顯下降，F(xiàn)N和Col-IV蛋白明顯升高，免疫組織化學和Western blot結(jié)果均示DN組IGF-1蛋白表達明顯升高，同時IGF-1蛋白表達增加，與MMP-2呈負相關(guān)，與24 h尿蛋白、FN和Col-IV呈正相關(guān)，提示IGF-1可能通過下調(diào)MMP-2，使其對FN和Col-IV蛋白的降解作用減弱，加劇系膜基質(zhì)大量沉積，最終引起尿蛋白升高。使用雷米普利治療DN大鼠8周后，腎重/體質(zhì)量、24 h尿蛋白、血BUN、Cr、FN、Col-IV和IGF-1蛋白表達均明顯降低，MMP-2明顯升高。病理結(jié)果也示DN組腎臟肥大較嚴重，系膜基質(zhì)大量聚集，予雷米普利治療后腎臟肥大和基質(zhì)沉積得到一定改善。提示雷米普利可能通過抑制IGF-1蛋白的表達，從而改善系膜基質(zhì)聚集，發(fā)揮腎臟保護作用。

IGF-1是由第12號染色體編碼，70個氨基酸構(gòu)成，分子量約7500的單鏈蛋白，同胰島素有近50%的結(jié)構(gòu)同源性[3]。IGF-1可由肝、腎、骨骼和脂肪等合成分泌，在體內(nèi)各組織廣泛分布；它以自分泌或旁分泌通過與特異性IGF-1受體結(jié)合，發(fā)揮促進細胞增殖分化，抑制凋亡及促進蛋白質(zhì)合成等作用，另外其也與胰島素受體有一定的交叉作用[3]。本研究進一步證實了IGF-1在DN系膜基質(zhì)沉積中的作用，并提出可能和抑制MMP-2的表達相關(guān)，與有關(guān)報道[8-12]相一致。

大量研究證實ACEI類藥物通過降低腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的活性，從而改善腎臟血流動力學，發(fā)揮保護作用。新近研究發(fā)現(xiàn)ACEI可通過非血流動力學因素發(fā)揮作用，如減輕炎性反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激，抑制基質(zhì)蛋白合成等[13]。本實驗結(jié)果與已有研究[14]相一致，并進一步提示可能是通過抑制IGF-1的表達來實現(xiàn)。值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)雷米普利并未明顯改善DN大鼠FBG和HbA1c，提示其對IGF-1的表達獨立于血糖改變。

總之，雷米普利可能通過抑制IGF-1在DN腎組織的表達，上調(diào)MMP-2的表達，從而減輕系膜基質(zhì)聚集，延緩DN進展，對臨床治療具有指導意義。

(本文圖1見插圖2-4)

參考文獻

[1]Pugliese G.Updating the natural history of diabetic nephropathy[J].Acta Diabetol,2014,51(6):905-915.

[2]Shimizu M,Furuichi K,Yokoyama H,et al.Kidney lesions in diabetic patients with normoalbuminuric renal insufficiency[J].Clin Exp Nephrol,2014,18(2):305-312.

[3]Bach LA,Hale LJ.Insulin-like growth factors and kidney disease[J].Am J Kidney Dis,2015,65(2):327-336.

[4]Strippoli GF,Bonifati C,Craig M,et al.Angiotensin converting enzyme inhibitors and angiotensin II receptor antagonists for preventing the progression of diabetic kidney disease[J/CD].Cochrane Database Syst Rev,2006,(4):CD006257.

[5]蔣宏偉，薛松妍.血栓通注射液聯(lián)合貝那普利對糖尿病腎病大鼠腎臟病理學及h-CRP、TNF-α表達的影響[J].西安交通大學學報(醫(yī)學版),2011,32(4)：516-518.

[6]Kolset SO,Reinholt FP,Jenssen T.Diabetic nephropathy and extracellular matrix[J].J Histochem Cytochem,2012,60(12):976-986.

[7]Takamiya Y,Fukami K,Yamagishi S,et al.Experimental diabetic nephropathy is accelerated in matrix metalloproteinase-2 knockout mice[J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(1):55-62.

[8]孫立娟,岳小靜,吳淑梅,等.血清IGF-1水平與2型糖尿病腎病的相關(guān)性[J].中國老年學雜志,2013,33(11)：2493-2494.

[9]任偉,葉山東,汪鵬,等.胰島素樣生長因子-1與2型糖尿病尿白蛋白排泄率關(guān)系的臨床研究[J].中國糖尿病雜志,2010,18(7)：495-497.

[10] Singh LP,Jiang Y,Cheng DW.Proteomic identification of 14-3-3zeta as an adapter for IGF-1 and Akt/GSK-3beta signaling and survival of renal mesangial cells[J].Int J Biol Sci,2006,3(1):27-39.

[11] Levin-Iaina N,Iaina A,Raz I.The emerging role of NO and IGF-1 in early renal hypertrophy in STZ-induced diabetic rats[J].Diabetes Metab Res Rev,2011,27(3):235-243.

[12] 李敏,王建生,劉東偉.霉酚酸酯對糖尿病大鼠腎組織中IGF-1、MMP-2表達的影響[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2013,48(1)：77-80.

[13] 陳秀麗,張會敏.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑在糖尿病腎病中的應(yīng)用[J].繼續(xù)醫(yī)學教育,2015,29(2)：101-102.

[14] McLennan SV,Kelly DJ,Cox AJ,et al.Decreased matrix degradation in diabetic nephropathy: effects of ACE inhibition on the expression and activities of matrix metalloproteinases[J].Diabetologia,2002,45(2):268-275.

Ramipril reduces the accumulation of renal mesangial matrix in diabetic nephropathy rats by inhibiting insulin-like growth factor-1

ZhaoChen*,WangYan,FangYuan,HuangZhenzhen,RenWei,ChenWei,WangLihua,HuWen,WangKe,NiLijun

(*DepartmentofNephrology，AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity，Hefei230001，China)Correspondingauthor：RenWei,Email:renweisn@163.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of ramipril on the expression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and the accumulation of mesangial matrix in diabetic nephropathy (DN) rats.MethodsSD rats were divided into three groups: healthy control group (NC group,n=12),DN group (n=11) and ramipril treatment group (DN+RAM group,n=12).The rat model of DN was constructed by intraperitoneally injected streptomtocin.DN+RAM group was treated with ramipril(3 mg·kg-1·d-1) by gastric perfusion for 3 weeks.The ratio of kidney weight/body weight,fasting blood glucose(FBG),hemoglobin a1c (HbA1c),24-hours proteinuria,blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (sCr) were measured.Pathological changes of renal tissues were observed by HE staining and electron microscope.The expression of IGF-1 and protein expressions of IGF-1,fibronectin(FN),type IV collagen(Col-IV),matrix metalloproteinases(MMP)-2 were detected by immunohistochemistry and Western blot respectively.ResultsAs compared with NC group,ratio of kidney weight/body weight,FBG,HbA1c,24-hours proteinuria,BUN,sCr of DN group increased significantly,glomerular hypertrophy,extracellular matrix accumulation,protein expressions of IGF-1,FN and Col-IV of DN group were significantly elevated,while MMP-2 was significantly decreased(P<0.05).The above parameters except FBG and HbA1c,were all significantly improved in DN+RAM group compared with ND group.IGF-1 protein expression had significant positive correlation with with 24-hours proteinuria(r=0.937),FN(r=0.896) and Col-IV(r=0.871),and negative correlation with MMP-2(r=-0.826) (P<0.05).ConclusionRamipril can play some renoprotective effect in diabetic rats,which maybe related parly to its effect in alleviating the accumulation of renal mesangial matrix through inhibiting IGF-1.

[Key words]Diabetic nephropathies;Insulin-like growth factor I;Ramipril;Rats,Sprague-Dawley糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者常見并發(fā)癥之一，是終末期腎病的最主要原因[1]。DN特征性病理改變?yōu)槟I小球系膜細胞肥大、基底膜增厚、細胞外基質(zhì)過度聚集，引起腎小球進行性硬化，其發(fā)病機制復(fù)雜，尚未完全闡明[2]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是由70個氨基酸組成，結(jié)構(gòu)和功能都與胰島素類似的單鏈生長因子，具有促細胞分化和增殖以及類似胰島素的代謝作用；研究報道高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞IGF-1蛋白表達升高，提示其與DN的發(fā)生發(fā)展可能密切相關(guān)[3]。研究表明血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)可改善系膜基質(zhì)的合成，降低DN患者蛋白尿，延緩疾病進展[4]，但IGF-1在其中發(fā)揮的作用研究較少。本研究擬通過鏈脲佐菌素(STZ)建立DN大鼠模型，觀察雷米普利干預(yù)后IGF-1、纖維連接蛋白(FN)、IV型膠原(Col-IV)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達的變化，進一步探討ACEI治療DN的可能機制。

基金項目：安徽省2012年度科技計劃項目(12070403059)

作者簡介：趙宸，博士，醫(yī)師，Email:zhaochen87@gmail.com通信作者：任偉，主任醫(yī)師，教授，Email:renweisn@163.com

中圖分類號:R587.2

文獻標識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.026

(收稿日期：2016-01-04)