降脂酮對(duì)胰島素抵抗大鼠肝損傷的保護(hù)作用

王　帥， 金　磊， 王　欣， 姬秋和， 張　偉， 海春旭， 李文麗

(第四軍醫(yī)大學(xué)毒理學(xué)教研室，西安　710032；*通訊作者，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)

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降脂酮對(duì)胰島素抵抗大鼠肝損傷的保護(hù)作用

王帥， 金磊， 王欣， 姬秋和， 張偉， 海春旭， 李文麗*

(第四軍醫(yī)大學(xué)毒理學(xué)教研室，西安710032；*通訊作者，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)

摘要：目的觀察降脂酮對(duì)胰島素抵抗大鼠肝病理損傷的保護(hù)作用。方法將15只大鼠隨機(jī)分成2組，即正常對(duì)照組5只、雙高加tBHP(HF+tBHP)組10只。正常對(duì)照組，正常飼料喂養(yǎng)，5-6周隔天腹腔注射生理鹽水。HF+tBHP組，高脂高果糖飼料喂養(yǎng)，5-6周隔天腹腔注射tBHP。第6周末，將HF+tBHP組隨機(jī)分成兩組:模型組5只，降脂酮組5只。模型組，雙高飲食+tBHP，生理鹽水灌胃；降脂酮組，雙高飲食+tBHP，降脂酮200 mg/kg灌胃。6周末，測(cè)定空腹血糖、血清胰島素含量、胰島素敏感指數(shù)。12周末，處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，測(cè)定大鼠ALT和AST。取肝臟作HE染色石蠟切片和制作電鏡切片。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組空腹血糖升高(P<0.05)，血清胰島素含量降低(P<0.05)，胰島素敏感指數(shù)降低(P<0.05)。降脂酮治療后，光鏡下觀察肝細(xì)胞排列整齊，腫脹減輕；電鏡下觀察肝臟線粒體腫脹減輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯。大鼠血清中ALT和AST的活性顯著降低(P<0.05)。結(jié)論降脂酮能夠保護(hù)高脂高果糖飲食加腹腔注射tBHP誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠的肝損傷。

關(guān)鍵詞：降脂酮；胰島素抵抗；叔丁基過氧化氫；肝損傷

2型糖尿病目前是全世界重大的公共衛(wèi)生難題，日趨受到人們的重視。胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病等各種代謝綜合征的根本致病因子。研究表明，脂毒性和氧化應(yīng)激與2型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)。胰島素抵抗是2型糖尿病等各種代謝綜合征的根本致病因素。中藥作為我們國家的一個(gè)瑰寶日益受到廣大民眾的認(rèn)可和歡迎。黃酮類化合物能清除機(jī)體內(nèi)的自由基，被認(rèn)為是一種較強(qiáng)的抗氧化劑[1]。近年來黃酮的保肝作用也引起了廣泛的關(guān)注。降脂酮是從多種中藥中提取的總黃酮，目前已有研究顯示，降脂酮能改善CCl4誘導(dǎo)的急慢性肝損傷，起到顯著的保肝作用[2]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂高果糖加tBHP誘導(dǎo)的大鼠胰島素抵抗模型為基礎(chǔ)，研究中藥提取物降脂酮對(duì)大鼠胰島素抵抗肝損傷的作用，為篩選出高效低毒的治療2型糖尿病的中藥奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料配置

8周齡SPF級(jí)Sprague Dawley雄性大鼠，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼料由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，大鼠自由攝食、飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為(24±2)℃，相對(duì)濕度為50%±10%，12 h/12 h交替照明和避光。第四軍醫(yī)大學(xué)飼料中心提供配置，配方為：普通混合飼料85%，豬油10%，果糖5%，60Co照射。

1.2主要試劑與儀器

羅氏卓越血糖儀，購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；日立7020生化儀，購自日立公司；大鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；降脂酮為中國科學(xué)院化學(xué)所自由基研究室提供(黃酮含量>80%)；tBHP購自美國Sigma公司，果糖購自天津富宇精細(xì)化工有限公司。

1.3動(dòng)物的處理與分組

將15只大鼠隨機(jī)分成3組，即正常對(duì)照組(Control)5只、雙高加tBHP(HF+tBHP)組5只。

正常對(duì)照組，正常飼料喂養(yǎng)，5-6周隔天腹腔注射生理鹽水。HF+tBHP組，高脂高果糖飼料喂養(yǎng)，5-6周隔天腹腔注射tBHP 0.2 mmol/kg、0.5 ml/kg。第6周末，將HF+tBHP組隨機(jī)分成兩組：模型組5只，降脂酮組5只。正常組7-12周正常飼料喂養(yǎng)，每天生理鹽水灌胃，隔天腹腔注射生理鹽水；模型組7-12周雙高飲食，每天生理鹽水灌胃，隔天腹腔注射tBHP；降脂酮組7-12周雙高飲食，每天降脂酮200 mg/kg灌胃，隔天腹腔注射tBHP。

1.4血清胰島素含量測(cè)定和胰島素敏感指數(shù)(ISI)計(jì)算

6周末，大鼠眼底靜脈叢取血，分離血清。用大鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定SD大鼠空腹血清胰島素的含量。利用公式ISI=ln[1/(血糖×血清胰島素)]計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。

1.5大鼠肝臟HE染色切片和大鼠肝臟電鏡切片

12周末，大鼠腹腔注射苯巴比妥麻醉，開腹活體取小部分肝臟，置于4%甲醛中浸泡，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察各組大鼠肝臟病理變化。另取小部分肝臟置于2%戊二醛中浸泡，送電鏡室做肝臟電鏡切片，透射電鏡下觀察各組大鼠肝臟的超微病理變化。

1.6大鼠血清ALT和AST

12周末，大鼠開腹，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心10 min，取上清液即為大鼠血清。用生化儀測(cè)定大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1大鼠胰島素抵抗模型的建立

HF+tBHP組與對(duì)照組比較，空腹血糖顯著升高(P<0.05)，體內(nèi)胰島素敏感性降低(P<0.05)，代償性的胰島素分泌量增加(P<0.05，見表1)。

組別空腹血糖(mmol/L)空腹血清胰島素(FINSmmol/L)胰島素敏感指數(shù)(ISI)對(duì)照組5.02±0.3937.4±3.28-5.23±0.08 HF+tBHP組5.74±0.39*64.4±3.91**-5.90±0.04**

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2降脂酮對(duì)IR大鼠肝臟病理損傷的保護(hù)作用

在光鏡下觀察肝臟HE染色的病理學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)照組肝小葉規(guī)則，肝索以中央靜脈為中心排列整齊，核仁無偏移，未見炎癥細(xì)胞浸潤。HF+tBHP組肝竇變窄,肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，體積增大，有的細(xì)胞呈氣球樣變，可見炎癥細(xì)胞浸潤，提示肝臟存在炎癥改變。降脂酮治療后肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，肝索排列較HF+tBHP組明顯整齊，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少(見圖1)。

在透射電鏡下放大倍數(shù)為20 500時(shí)可見，對(duì)照組肝細(xì)胞核周隙正常，線粒體形狀規(guī)則，未見腫脹的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；模型組線粒體腫脹變形，有的甚至呈球形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，排列紊亂；降脂酮治療后，線粒體腫脹減輕，偶可見線粒體嵴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯(見圖2)。

圖1　肝臟光鏡下病理學(xué)改變 (HE染色，×200)Figure 1　Change of pathology of livers under light microscope (HE staining，×200)

圖2　肝臟超微病理結(jié)構(gòu)改變(電鏡，×20 500)Figure 2　Ultrastructural changes of livers under electron microscope (×20 500)

2.3降脂酮對(duì)胰島素抵抗大鼠肝功能的影響

HF+tBHP組大鼠血清ALT、AST活性較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。用降脂酮治療后，大鼠ALT、AST活性顯著降低(P<0.05，見圖3)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05;與HF+tBHP組相比，#P<0.05圖3　降脂酮治療后血清谷丙轉(zhuǎn)酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性Figure 3　The changes of serum ALT and AST after treated with Jiangzhitong

3討論

果糖作為食品添加劑，廣泛用于食品、飲品中。果糖攝入的增加認(rèn)為是一個(gè)潛在的肥胖流行因素。有研究表明，單純飲用果糖水10周可使大鼠體重顯著增加，并造成胰島素抵抗[3]；高脂高糖、20%果糖水飼喂8周，并注射小劑量的鏈脲佐菌素(STZ)2周也可以誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠模型[4]。由此可見，果糖與IR的產(chǎn)生密切相關(guān)。已知，ROS介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激，與代謝綜合征和T2DM的發(fā)病密切相關(guān)。ROS水平升高導(dǎo)致胰島素信號(hào)的改變，但單純ROS水平升高和氧化應(yīng)激對(duì)誘導(dǎo)IR的研究至今甚少。近年有研究顯示在高脂飲食喂養(yǎng)大鼠時(shí)加入氧化劑NOX2，對(duì)IR模型的建立起到了重要的作用。NOX2促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的IR的發(fā)生，清除NOX2可提高肌肉組織胰島素的敏感性，下調(diào)NOX2在骨骼細(xì)胞中的表達(dá)可提高胰島素信號(hào)的敏感性[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)綜合以上研究結(jié)果，給予大鼠高脂高果糖飲食加腹腔注射氧化劑tBHP。結(jié)果表明，大鼠體重明顯增加，空腹血糖顯著升高，機(jī)體胰島素敏感性降低，代償性的胰島素分泌量增加。以上結(jié)果均提示成功建立了胰島素抵抗大鼠模型。

2型糖尿病患者50%并發(fā)肝損傷，而胰島素抵抗是導(dǎo)致肝損傷的關(guān)鍵因素[6]。我們的研究結(jié)果表明，胰島素抵抗大鼠的肝臟脂滴增多，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。究其原因可能是：在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用減弱，血中游離脂肪酸含量升高，大量游離脂肪酸進(jìn)入肝臟，超過肝細(xì)胞的承受能力，導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂質(zhì)的大量堆積。同時(shí)胰島素抵抗下，產(chǎn)生大量的自由基，損傷線粒體，從而影響游離脂肪酸的代謝，加重肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積[7]。另外，tBHP是一種氧化劑，本實(shí)驗(yàn)室前期的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它可以直接導(dǎo)致正常人肝細(xì)胞系發(fā)生線粒體腫脹，肝細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)給予大鼠腹腔注射tBHP，它也可能直接參與了肝臟的損傷作用。因此，尋找改善IR大鼠肝損傷的藥物顯得尤為重要。

近年研究表明，黃酮類化合物能顯著地預(yù)防和治療胰島素抵抗，并且具有顯著的保肝作用。降脂酮是一種從黃芪、枸杞子、山楂等6種中藥中提取的總黃酮，推測(cè)可能與黃酮具有類似的保肝作用[9]。國內(nèi)研究[2,10]發(fā)現(xiàn)，降脂酮能降低CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷中NO和NOS的水平，還能顯著降低AST和ALT活性，從而起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。但降脂酮對(duì)胰島素抵抗大鼠的肝損傷作用還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)光鏡觀察顯示，模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，肝索排列紊亂。降脂酮治療后，大鼠肝細(xì)胞腫脹消失，肝索排列較整齊，肝臟脂滴顯著減少；電鏡觀察結(jié)果顯示，模型組大鼠肝細(xì)胞線粒體腫脹變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。降脂酮治療后大鼠肝細(xì)胞線粒體腫脹減輕，偶可見線粒體嵴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠血清ALT、AST活性的測(cè)定顯示：高脂高果糖加tBHP使大鼠血清中ALT、AST的活性顯著升高，提示肝臟損傷的出現(xiàn)?？赡芘c胰島素抵抗導(dǎo)致的脂代謝紊亂和氧化應(yīng)激相關(guān)。降脂酮治療后，大鼠血清中ALT、AST的活性顯著降低。推測(cè)可能是降脂酮參與肝臟中脂質(zhì)的運(yùn)輸和氧化應(yīng)激水平的降低。以上結(jié)果推測(cè)，多種中藥提取物降脂酮可保護(hù)高脂高果糖和tBHP誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠的肝損傷。

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Protective effect of Jiangzhitong on liver injury in rats with insulin resistance

WANG Shuai， JIN Lei， WANG Xin， JI Qiuhe， ZHANG Wei， HAI Chunxu， LI Wenli*

(ToxicologyTeachingandResearchSection，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China；*Correspondingauthor，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo explore the role of Jiangzhitong in the pathological damage of the liver in rats with insulin resistance.MethodsFifteen rats were randomly divided into two groups: control group(n=5) and high fat and high glucose plus tBHP group (HF+tBHP,n=10). Control rats were fed with normal diet and injected with saline every other day from the fifth to the sixth week. HF+tBHP rats were given high-fat, high-fructose diet, and they were injected intraperitoneally with tBHP from the fifth to the sixth week. At the end of the sixth week, the HF+tBHP rats were randomly divided into two groups: model group(n=5) and Jiangzhitong group(n=5). The rats in model group were given high-fat, high-fructose diet and injected with tBHP from the seventh to the twelfth week, and the rats in Jiangzhitong group were given high-fat, high-fructose diet, Jiangzhitong 200 mg/kg orally and injected with tBHP. At the end of the sixth week, fasting blood glucose, serum fasting insulin levels, insulin sensitivity index were measured. At the end of the twelfth week, the rats were sacrificed and the livers were prepared for HE staining, oil red staining and electron microscopy slice. ResultsCompared with control group, the fasting blood glucose increased(P<0.05), the serum insulin level decreased(P<0.05), and the insulin sensitivity index decreased in model group(P<0.05). After treated with Jiangzhitong, liver cells were arranged neatly, and the swelling of liver cells was relieved. The results of electron microscope showed that the swelling of the mitochondrial was relieved in liver cells in Jiangzhitong group, and the endoplasmic reticulum wasn’t obvious. The ALT and AST in serum of rats were decreased in Jiangzhitong group(P<0.05). ConclusionJiangzhitong can alleviate the liver injury in insulin resistance rats induced by high fructose, high fat and tBHP.

Key words:Jiangzhitong;insulin resistance;tBHP;liver injury

基金項(xiàng)目：國家科學(xué)自然基金資助項(xiàng)目(31170807)；陜西省自然科學(xué)基金青年人才基金資助項(xiàng)目(2013JQ4018)

作者簡介：王帥，女,1989-08生，在讀碩士，E-mail：992751204@qq.com

收稿日期：2016-02-29

中圖分類號(hào)：R587

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1007-6611(2016)05-0411-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.003