化療藥物對晚期非小細胞肺癌患者血清EGFR基因突變的影響

張旭東, 張世強*, 王保慶, 王海清

(1徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院放療三科,徐州　221006； 2徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科； 3徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科； *通訊作者E-mail：zhangshiqiang711@163.com)

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化療藥物對晚期非小細胞肺癌患者血清EGFR基因突變的影響

張旭東1, 張世強1*, 王保慶2, 王海清3

(1徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院放療三科,徐州221006；2徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；3徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科；*通訊作者E-mail：zhangshiqiang711@163.com)

摘要：目的檢測晚期非小細胞肺癌患者化療前后血清EGFR基因外顯子19和外顯子21的突變狀態(tài)，探討化療藥物對血清EGFR基因突變狀態(tài)的影響。方法48例非小細胞肺癌患者均接受了至少4-6周期的全身化療，應(yīng)用磁珠法提取患者化療前后的血清游離DNA，RT-PCR技術(shù)擴增患者血清游離DNA中EGFR外顯子19和外顯子21，所有擴增樣本均經(jīng)基因測序法驗證EGFR基因突變狀態(tài)，分析EGFR基因外顯子19和外顯子21化療前后突變狀態(tài)。結(jié)果48例肺癌患者化療前后血清EGFR的突變以外顯子21為主，化療前后外顯子19和外顯子21的突變率無顯著性差異(P>0.05)，血清EGFR的突變狀態(tài)與患者病理類型具有相關(guān)性(P<0.02)，但與性別無關(guān)(P>0.05)，化療前血清EGFR基因突變率為35.4%(17/48)，化療后血清EGFR基因突變率為43.8%(21/48)，化療前后患者EGFR基因突變的一致率為62.5%(30/48)，化療前后EGFR基因的突變率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，在不一致的18例患者中，7例患者由化療前的EGFR突變陽性變?yōu)殛幮裕?1例患者由化療前的EGFR突變陰性變?yōu)殛栃?。結(jié)論化療藥物可能導致肺癌患者血清EGFR基因突變的改變，對于一線化療后擬應(yīng)用EGFR-TKI治療的患者宜動態(tài)觀察血清EGFR基因的變化，避免患者治療的盲目性。

關(guān)鍵詞：肺腫瘤；游離DNA；EGFR基因；化療藥物

循證醫(yī)學的證據(jù)表明，靶向藥物是晚期非小細胞肺癌患者重要的治療手段，其療效取決于肺癌患者表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因的突變狀態(tài)，但由于靶向藥物費用昂貴，目前大部分晚期肺癌患者的一線治療仍采取以全身化療為主。許多研究表明，對于EGFR基因突變陽性的肺癌患者，一線靶向藥物治療療效優(yōu)于化療，有效率可達70%以上[1-3]，而對于化療后肺癌患者二/三線應(yīng)用靶向藥物治療的客觀有效率明顯降低，有效率在30%-40%[4-6]，因此，有學者推測化療藥物可能會對肺癌患者EGFR基因突變狀態(tài)產(chǎn)生一定的影響。

臨床上檢測EGFR基因突變狀態(tài)主要以腫瘤組織為檢測標本，但由于大部分肺癌患者確診時已處于腫瘤晚期，往往無法獲得足夠用于檢測EGFR基因突變的肺癌組織標本，目前已有大量的研究證實[7-9]，血清游離DNA中EGFR基因突變狀態(tài)與腫瘤組織中的EGFR基因突變狀態(tài)具有高度的相關(guān)性，血清DNA可替代腫瘤組織DNA進行腫瘤EGFR基因突變檢測，而且近年來國內(nèi)已有利用血清DNA檢測EGFR突變指導靶向藥物治療取得較好療效的報道[10,11]，本研究收集晚期肺癌患者化療前后的血清標本，應(yīng)用RT-PCR法直接測序進行EGFR基因突變檢測，觀察化療藥物對血清中EGFR基因突變狀態(tài)是否存在影響。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇2014-01～2015-09就診于我院的48例非小細胞肺癌患者作為研究對象。所有入組的肺癌患者均有組織學和/或細胞學診斷依據(jù)，分期為Ⅲb期或Ⅳ期，所有患者KPS評分大于60分；其中男性30例，女性18例；年齡45-72歲，平均57.5歲，腺癌26例，鱗癌22例。采集患者全身化療前和化療4-6個周期后的血清標本(一線化療方案：鉑類+多西他塞/培美曲塞/吉西他濱)，所有入組患者最后的化療療效評估：部分緩解(PR)10例，疾病穩(wěn)定(SD)25例，疾病進展(PD)13例，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1外周血游離DNA的提取采集患者治療前外周靜脈血4 ml，室溫放置2 h后用低溫高速離心機將靜脈血離心(20 ℃，3 000 r/min，10 min)，棄下液，取上層液血清1 ml放置入2 ml凍存試管，血清DNA以磁珠法全血基因組DNA抽提試劑盒(美國Omega公司生產(chǎn))抽提，按說明書所述的方法抽提血清DNA。

1.2.2外周血游離DNA中EGFR基因突變狀態(tài)的檢測DNA抽提完成后進行PCR擴增目的片段EGFR，EGFR外顯子19上游引物：5′- AACGTCTTCTCCCTTCTCTCTCTGTCA-3′，下游引物：5′- C CACACAGCA AAGCAGAAACT -3′，產(chǎn)物大小為150 bp；EGFR外顯子21上游引物：5′-TCTTCTCGTTTT CAGGGC ATG-3′，下游引物：5′-GGCTGACCTAAAGCCACCTC -3′，產(chǎn)物大小為196 bp；PCR擴增體系設(shè)計為20 μl，模板1 μl。擴增外顯子為19、21外顯子。①95 ℃，5 min變性。②95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。③72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳100 V 30 min后EB染色攝片。對觀察到陽性擴增條帶的樣本分離純化后進行基因測序，測序引物采用各外顯子的上游引物。

1.3統(tǒng)計學分析

使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用χ2檢驗分析不同亞組及化療前后肺癌患者EGFR基因突變率的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1化療前血清EGFR基因突變

化療前血清DNA樣本檢測結(jié)果顯示患者EGFR基因突變發(fā)生率為35.4%(17/48)。外顯子19突變10個，突變率為20.8%(10/48)，外顯子21突變15個，突變率為31.3%(15/48)，EGFR基因以外顯子21突變?yōu)橹?60.0%,15/25)，其中8例患者同時伴有外顯子19和21突變。女性患者EGFR基因突變率為38.9%(7/18)，男性患者突變率為33.3%(10/30)，女性高于男性，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.151，P=0.698)。腺癌患者突變率為50.0%(13/26)，鱗癌患者突變率為22.7%(4/22)，腺癌患者血清EGFR基因突變率明顯高于鱗癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=5.274，P=0.021)。

2.2化療后血清EGFR基因突變

化療后血清DNA樣本檢測結(jié)果顯示患者EGFR基因突變發(fā)生率為43.8%(21/48)。外顯子19突變12個，突變率為25.0%(12/48)，外顯子21突變16個，突變率33.3%(16/48)，可見化療后血清EGFR基因突變的檢測結(jié)果仍以外顯子21突變?yōu)橹?57.1%,16/28)，其中7例患者同時有外顯子19和21突變。女性患者EGFR基因突變率為33.3%(6/18)，男性患者EGFR基因突變率為50.0%(15/30)，女性明顯低于男性，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.269，P=0.259)。腺癌患者突變率為61.5%(16/26)，鱗癌患者突變率為18.2%(5/22)，腺癌患者血清EGFR基因突變率明顯高于鱗癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2= 5.635，P=0.017)。

對于入組患者EGFR基因突變狀態(tài)進一步亞組分析，外顯子19缺失突變，化療前突變率為20.8%(10/48)，化療后突變率為25.0%(12/48)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2= 0.235，P=0.627)，其中化療前后均陽性3例，化療前后均陰性27例患者，化療前陰性化療后陽性5例，化療前陽性化療后陰性7例。對于EGFR外顯子21點突變，化療前突變率為31.3%(15/48)，化療后突變率33.3%(16/48)，無統(tǒng)計學差異(χ2=0.047，P=0.827)，其中化療前后均陽性7例，化療前后均陰性28例，化療前陰性化療后陽性6例，化療前陽性化療后陰性3例(見表1)。

2.3化療前后EGFR基因突變變化

48例肺癌患者中化療前EGFR基因突變陽性率為35.4%(17/48)，化療后患者EGFR基因突變陽性率為43.8%(21/48)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.697，P=0.403)。 化療前后患者EGFR突變狀態(tài)一致率為62.5%(30/48)，在不一致的18例患者中，7例患者由化療前的EGFR突變陽性變?yōu)殛幮裕?1例患者由化療前的EGFR突變陰性變?yōu)殛栃?見表2)。

表1晚期肺癌患者臨床特征與化療前后血清EGFR基因突變狀態(tài)的關(guān)系

Table 1Relationship between EGFR gene mutation and clinical pathological features of patients with advanced lung cancer before and after chemotherapy

臨床特征n化療前EGFR基因突變未突變χ2P化療后EGFR基因突變未突變χ2P性別0.1510.6971.2690.259 男3010201515 女18711612病理類型5.2740.0215.6350.017 腺癌2613131610 鱗癌22418517EGFR基因 19外顯子48103812360.627 21外顯子48153316320.827

表2肺癌患者化療前后EGFR基因突變狀態(tài)的變化

Table 2The EGFR gene mutation changes in serum samples before and after chemotherapy in patients with advanced lung cancer

化療前基因突變狀態(tài)化療后基因突變狀態(tài)突變未突變合計突變10717未突變112031合計212748

3討論

肺癌已成為嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一，大部分患者確診時已處于晚期，對于中晚期肺癌患者的治療目前仍以姑息性化療為主，主要目的是改善癥狀，但第三代化療藥物的臨床應(yīng)用未能明顯改善患者的預(yù)后。近年來，隨著醫(yī)學研究的發(fā)展，肺癌的靶向治療取得了突破性的進展，EGFR-TKI已成為目前肺癌靶向治療最重要的手段，國內(nèi)外研究表明[12，13]，EGFR-TKI作為EGFR突變陽性的肺癌一線治療的有效率明顯高于二/三線治療的有效率，其差異的原因至今未明，由于大部分晚期肺癌患者的一線治療仍采取以化療為主，化療藥物是否會對EGFR基因突變狀態(tài)產(chǎn)生影響值得進一步研究，本研究收集晚期肺癌患者化療前后的血清標本，使用RT-PCR進行EGFR基因突變檢測，同時進行直接測序驗證，探討化療藥物對EGFR基因突變狀態(tài)是否存在影響。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，48例肺癌患者化療前和化療后血清DNA樣本均可檢測出EGFR基因外顯子19和外顯子21的突變，其中以外顯子21的突變率較高，部分患者同時合并有外顯子19和外顯子21的突變，但統(tǒng)計學分析表明，化療前后外顯子19和外顯子21的突變率無顯著性差異，進一步分析血清EGFR基因突變與患者臨床特征的持續(xù)更新發(fā)現(xiàn)，血清EGFR基因的突變狀態(tài)與患者的病理類型具有密切的相關(guān)性(P<0.05)，與我們既往的研究結(jié)果相一致[7]，但本研究中未發(fā)現(xiàn)血清EGFR基因的突變狀態(tài)與性別具有相關(guān)性(P>0.05)，與已有的文獻報道結(jié)果不一致[14-15]，出現(xiàn)差異的原因考慮可能與本研究中入組的肺癌患者樣本例數(shù)較少有關(guān)。另外，在本研究中48例肺癌患者化療前和化療后EGFR基因突變陽性率分別為35.4%和43.8%，化療前后患者EGFR突變狀態(tài)一致率為62.5%，在不一致的18例患者中，7例由化療前的EGFR突變陽性變?yōu)殛幮裕?1例由化療前的突變陰性變?yōu)殛栃裕崾净熐昂蠓伟┗颊哐錏GFR基因的突變狀態(tài)會發(fā)生變化，但統(tǒng)計學分析顯示化療前后EGFR基因突變狀態(tài)無顯著性差異(P>0.05)，國內(nèi)學者韓如冰等[16]亦有相似的報道。因此，化療會在一定的程度上影響血清EGFR基因的突變狀態(tài)，分析其原因可能有：化療可能使EGFR基因突變陽性的腫瘤細胞更易被殺傷，因而釋放更多DNA入血，因此，化療后EGFR基因突變陽性比例升高；其次，腫瘤在進展過程中EGFR基因突變狀態(tài)可能發(fā)生變化；另外，不排除由于實驗條件及方法的不同導致假陽性或假陰性的可能，建議擴大樣本量進一步臨床研究。

總之，晚期肺癌患者一線應(yīng)用化療藥物后會影響血清EGFR基因的突變狀態(tài)，對于二線或三線應(yīng)用EGFR-TKI治療的患者建議動態(tài)觀察血清EGFR基因的變化，可以避免患者靶向藥物治療的盲目性，而且以血清為樣本進行多次檢測EGFR基因突變，取材方便而且無創(chuàng)，患者痛苦小也易于接受。

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Influence of chemotherapy drugs on serum EGFR mutation status in advanced non-small cell lung cancer

ZHANG Xudong1, ZHANG Shiqiang1*, WANG Baoqing2, WANG Haiqing3

(1ThirdDepartmentofRadiotherapy，SecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221006，China；2DepartmentofOncology，SecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege；3DepartmentofRepiration，SecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege；*Correspondingauthor,E-mail：zhangshiqiang711@163.com)

Abstract：ObjectiveTo detect EGFR exon 19 and exon 21 mutation status in serum before and after chemotherapy from advanced non-small cell lung cancer patients，and evaluate the effect of chemotherapy on EGFR mutation status. MethodsMagnetic beads were used for DNA extraction in serum of 48 advanced non-small cell lung cancer patients before and after chemotherapy. The EGFR was amplified by RT-PCR and all samples were analyzed by direct sequencing and the changes of EGFR exon 19 and exon 21 mutations were observed before and after chemotherapy.ResultsThe rate of serum EGFR exon 21 mutations in 48 patients was higher than that of exon 19,but there was no significant difference(P>0.05). The rates of EGFR mutations showed no significant difference between male and female(P>0.05),but there was significant difference between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma(P<0.02). EGFR mutations were found in 35.4%(17/48)and 43.8%(21/48)in serum before and after chemotherapy respectively，and there was no significant difference(P>0.05)，The consistency rate of EGFR mutation before and after chemotherapy was 62.5%(30/48). Among 18 discordant cases，11 cases changed from wild type to mutant type after chemotherapy, and 7 cases changed from mutant type before chemotherapy to wild type after chemotherapy.ConclusionChemotherapy drugs may have influence on serum EGFR mutation in advanced carcinoma patients. It is important for lung cancer patients with first-line chemotherapy to detect serum EGFR gene mutation before EGFR-TKI treatment.

Key words:lung neoplasms；EGFR；mutation；chemotherapy drug

基金項目：徐州市科技計劃基金資助項目(XM13B045)

作者簡介：張旭東，男，1967-01生，本科，副主任醫(yī)師，E-mail：zxdmail8@sohu.com

收稿日期：2016-02-20

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)05-0455-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.013