宮頸癌患者外周血PD-1檢測(cè)的臨床價(jià)值

伍金華,甄　波,陳建勇,牛映紅

(1.江門市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 江門529030；2.江門市中心醫(yī)院 婦科，廣東 江門529030)

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*通訊作者

宮頸癌患者外周血PD-1檢測(cè)的臨床價(jià)值

伍金華1*,甄波2,陳建勇1,牛映紅1

(1.江門市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 江門529030；2.江門市中心醫(yī)院 婦科，廣東 江門529030)

摘要：目的評(píng)價(jià)外周血PD-1檢測(cè)對(duì)宮頸癌早期診斷的臨床價(jià)值。方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)72例宮頸癌患者，63例同期CINⅢ患者和60名體檢健康婦女外周血PD-1含量。分析PD-1含量與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。利用受試者工作特征曲線(ROC)分析外周血PD-1對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值。結(jié)果宮頸癌患者外周血PD-1含量((15.23±1.05)%)顯著高于CINⅢ患者((8.64±0.53)%)(t=5.61,P<0.01)及健康對(duì)照者((5.93±0.24)%)(t=7.87，P<0.01)。宮頸癌患者中，Ⅲ+Ⅳ期患者((16.85±1.74)%)高于Ⅰ+Ⅱ期((14.27±0.86)%)(t=-3.46,P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者((16.56±1.37)%)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者((14.83±0.96)%)(t=-2.29，P<0.05)。宮頸癌患者外周血PD-1含量在不同分化程度及病理類型分組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。外周血PD-1診斷宮頸癌的曲線下面積(AUC)為0.925。當(dāng)外周血PD-1取值為15.07%時(shí)，其診斷宮頸癌的敏感度和特異度分別為75.12%和88.47%。結(jié)論外周血PD-1可能是宮頸癌早期輔助診斷及預(yù)后判斷有益的標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：宮頸腫瘤；PD-1；生物學(xué)標(biāo)記；流式細(xì)胞術(shù)

(ChinJLabDiagn,2016,20:0779)

子宮頸癌(簡(jiǎn)稱宮頸癌)是指發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤。宮頸癌的發(fā)病率逐年升高[1]，早期診斷宮頸癌是治療和延長(zhǎng)患者生存期的關(guān)鍵。宮頸癌的確診主要是依靠病理診斷，但是病理診斷是有創(chuàng)性檢查，且病理的早期陽性診斷率較低，不利于宮頸癌的早期篩查診斷和治療。因此，積極尋找一種簡(jiǎn)便易行、創(chuàng)傷小、靈敏度高的新型腫瘤標(biāo)志物對(duì)于宮頸癌的早期輔助診斷和治療具有非常重要的意義。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，程序性細(xì)胞死亡分子1(programmed death-1，PD-1) 作為免疫球蛋白超家族協(xié)同刺激分子的重要成員，在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用，成為腫瘤檢出和預(yù)后判斷的新的生物學(xué)指標(biāo)。PD-1 通過與其配體PD-L1 結(jié)合，抑制CD4 和CD8 T細(xì)胞的增殖和活化，負(fù)性調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答過程，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[2]。本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了宮頸癌患者、宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅲ(cervical intraepithelial neoplasiam，CINⅢ)患者和健康對(duì)照者外周血PD-1含量，分析PD-1的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討其對(duì)宮頸癌早期診斷的臨床價(jià)值。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源

選擇2013年9月至2014年9月廣東省江門市中心醫(yī)院婦科宮頸癌患者72例，按國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2000 標(biāo)準(zhǔn)分期，年齡33-71歲，平均年齡49.2歲，中位年齡為51.5歲。選擇同期CINⅢ患者63例，年齡28-56歲，平均48.8歲，中位年齡為50.7歲。診斷均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)，均無其他合并癥。同期門診體檢健康婦女60名，年齡29-63歲，平均47.6歲，中位年齡為49.7歲。所有研究對(duì)象均為女性，均簽署知情同意書。3組研究對(duì)象要求年齡分布接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

1.2儀器與試劑

流式細(xì)胞儀、溶血?jiǎng)?美國(guó)Beckman Coulter EPICS XL)；熒光抗體:PE-Cy5標(biāo)記人CD3單抗、 PE標(biāo)記人PD-1單抗、PE標(biāo)記人PD-L1單抗和PE標(biāo)記人IgGI同型對(duì)照抗體(美國(guó)EB公司)。

1.3方法

1.3.1流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞樣本的制備分別抽取3組研究對(duì)象EDTA-K2抗凝靜脈血3 ml，即時(shí)送檢制備CD3+PD-1+T細(xì)胞，具體加樣步驟為：5 μl CD3抗體+5 μl PD-1抗體+50 μl全血；輕微混勻后室溫避光保存30 min，加入250 μl溶血?jiǎng)┹p微混勻，室溫避光保存12 min，加1 mL流式細(xì)胞儀鞘液1 500 r/min 離心5 min洗滌,共洗滌2次，加500 μl鞘液重懸細(xì)胞,3 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2流式細(xì)胞樣本的檢測(cè)每次試驗(yàn)均設(shè)立空白對(duì)照和同型對(duì)照。以SSC-FS設(shè)門，計(jì)數(shù)10000個(gè)淋巴細(xì)胞，觀察CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)情況。計(jì)算CD3+PD-1+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例,結(jié)果以陽性率(%)表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1宮頸癌患者、CINⅢ患者和健康對(duì)照者外周血PD-1含量

本研究所采用的流式細(xì)胞術(shù)以FS-SSC設(shè)門(圖1A)，每次實(shí)驗(yàn)均做同型對(duì)照，控制值約為0.5%(圖1B)。宮頸癌患者外周血PD-1水平為((15.23±1.05)%)，CINⅢ患者為((8.64±0.53)%)，正常健康對(duì)照者為((5.93±0.24)%)(圖1C1 -C3)。3組數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=763．84，P<0.01。采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間兩兩比較，結(jié)果顯示宮頸癌患者外周血PD-1含量高于CINⅢ患者(t=5.61,P<0.01)及正常健康對(duì)照者(t=7.87，P<0.01)，CINⅢ患者PD-1含量高于正常健康對(duì)照者(t=4.76，P<0.01)。

2.2宮頸癌患者外周血PD-1含量與臨床病理特征的關(guān)系

宮頸癌患者外周血PD-1水平Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(t=-3.46,P<0.01)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于未見轉(zhuǎn)移的患者(t=-2.29,P<0.05)。宮頸癌患者外周血PD-1含量在腫瘤不同分化程度(t=0.62,P>0.05)及病理類型(t=-0.32,P>0.05)分組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表1。

2.3外周血PD-1對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值

對(duì)宮頸癌患者血液PD-1含量結(jié)合健康對(duì)照組做ROC曲線，其曲線下的面積(AUC)為0.925。根據(jù)ROC曲線選擇15.07%為臨界值時(shí)，靈敏度和特異度分別為75.12%和88.47%。

表1　　　　宮頸癌患者外周血PD-1含量與臨床病理特征的

3討論

PD-1是近年來發(fā)現(xiàn)的負(fù)性協(xié)同刺激分子，最初是在凋亡的T細(xì)胞雜交瘤中利用消減雜交的方法得到的，大多數(shù)表達(dá)于活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。PD-1與其配體PD-L1(B7-H1)或PD-L2(B7-DC)結(jié)合后，通過其胞漿尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序傳入抑制信號(hào)，導(dǎo)致腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的凋亡或免疫無能，從而抑制免疫反應(yīng)，進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞的逃逸[3]。PD-1在肝癌、腎癌、胃癌等患者外周血都有顯著表達(dá)[4-6]，提示PD-1有望成為癌癥診斷治療又一觀察新指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)PD-1在宮頸癌患者外周血表達(dá)及其臨床價(jià)值的報(bào)道。

注：FS為前向散射光強(qiáng)度；SS為側(cè)向散射光強(qiáng)度；FL2為PE標(biāo)記PD-1表達(dá)熒光強(qiáng)度；FL4為PE-Cy5標(biāo)記CD3表達(dá)熒光強(qiáng)度。

通過檢測(cè)宮頸癌患者、CINⅢ患者和健康對(duì)照者血液PD-1含量，我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者的血液PD-1水平明顯高于CINⅢ患者和健康對(duì)照者(P均<0．01)，同時(shí)CINⅢ患者的血液PD-1水平也是明顯高于健康對(duì)照者(P<0.01)，這說明了血液PD-1濃度的升高與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，是宮頸癌發(fā)生的早期事件。大量臨床、分子生物學(xué)及流行病學(xué)資料已表明，人乳頭瘤病毒(HPV)是引起宮頸癌及CIN的主要病因，其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中引起的免疫逃逸機(jī)制引起各方研究關(guān)注。目前，Yang W等[7]學(xué)者分別檢測(cè)高危型HPV陰性和高危型HPV陽性婦女宮頸上皮細(xì)胞的PD-1，發(fā)現(xiàn)高危型HPV陽性婦女PD-1的含量顯著高于高危型HPV陰性婦女，而且高危型HPV陽性婦女PD-1含量與CIN分級(jí)呈正相關(guān)性，結(jié)果顯示PD-1/PD-L1信號(hào)途徑參與了HPV介導(dǎo)的宮頸慢性炎癥到宮頸癌發(fā)生發(fā)展的病理過程。Chang等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，生殖器乳頭狀瘤PD-1+CD4+T細(xì)胞復(fù)發(fā)病灶中顯著增加，而且引起Th2細(xì)胞的升高，有助于免疫逃逸機(jī)制的產(chǎn)生。Karim R等進(jìn)一步[9]指出，PD-1+CD8+T細(xì)胞和PD-1+CD4+Foxp3+T在宮頸癌患者宮頸組織中大量表達(dá)，提示阻斷PD-1的表達(dá)可能是宮頸癌免疫治療的新途徑。關(guān)于宮頸癌PD-1國(guó)內(nèi)的報(bào)道并不多見，王渝琦等[10]指出表達(dá)PD-1 的T細(xì)胞凋亡是腫瘤免疫逃逸的原因之一，作者觀察了宮頸癌細(xì)胞表達(dá)PD-1的受體PD-L1 與腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分PD-L1 陽性的宮頸癌病例癌巢和間質(zhì)內(nèi)部分淋巴細(xì)胞發(fā)生了凋亡，故推測(cè)癌巢及癌巢邊緣浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞減少可能與PD-1/PD-L1途徑促進(jìn)其凋亡有關(guān)。有關(guān)宮頸癌患者PD-1的研究目前多數(shù)集中于宮頸上皮細(xì)胞、宮頸癌病理組織這兩個(gè)載體上。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在腫瘤原發(fā)病灶的表達(dá)可以通過血液循環(huán)系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)而最終出現(xiàn)在外周血中。對(duì)于宮頸癌患者PD-1的檢測(cè)與追蹤復(fù)查而言，外周血來源方便，對(duì)患者的創(chuàng)傷性小，在某種程度上可以代替宮頸癌組織細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)。通過進(jìn)一步分析宮頸癌患者血液PD-1濃度與臨床病理特征之間的關(guān)系，可以發(fā)現(xiàn)Ⅲ+Ⅳ期患者血液PD-1水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(t=-3.46,P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分期的進(jìn)展是預(yù)后不良的指標(biāo)，結(jié)果說明了血液PD-1濃度過高預(yù)示著疾病進(jìn)展、預(yù)后不良。同時(shí)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PD-1水平也高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(t=-2.29，P<0.05)。結(jié)果表明，宮頸癌患者T 淋巴細(xì)胞中高表達(dá)的PD-1,與其配體相互作用后,抑制了腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞的增殖和活化,使T淋巴細(xì)胞處于無能狀態(tài),誘導(dǎo)并維持T 淋巴細(xì)胞對(duì)宮頸癌細(xì)胞免疫耐受,從而使宮頸癌細(xì)胞有效逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控和殺傷,使宮頸癌增殖得不到有效控制,導(dǎo)致宮頸癌的進(jìn)一步增長(zhǎng),甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移。而在不同的分化、病理類型之間，則未見PD-1的表達(dá)水平發(fā)生顯著性差異。ROC曲線分析表明，PD-1在早期診斷宮頸癌的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移具有一定的準(zhǔn)確性。在cut-off值為15.07%時(shí)，靈敏度為75.12%，特異度為88.47%。我們推測(cè)，PD-1有可能作為一種新型的生物標(biāo)志物在將來單獨(dú)或與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌的早期輔助診斷及預(yù)后判斷。

綜上所述，外周血PD-1的變化在宮頸癌的臨床分期和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，有可能為宮頸癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供有力依據(jù)。

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Clinical value of detection of peripheral blood PD-1 in patients with cervical cancer

WUJin-hua1，ZHENBo2，CHENJian-yong1，etal.

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,JiangmenCentralHospital,Jiangmen529030,China；2.Departmentofgynaecology,JiangmenCentralHospital,Jiangmen529030,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical value of detection of peripheral blood PD-1 in the early diagnosis of cervical cancer.MethodsFlow cytometry was available to detect the PD-1 in peripheral blood from 72 patients with cervical cancer,63 patients with CINⅢ and 60 healthy controls，and the correlation of PD-1 and the clinical pathological parameters of cervical cancer was analyzed.The diagnostic performance of PD-1 in peripheral blood for cervical cancer was estimated by receiver operating characteristic (ROC) curve analysis.ResultsPD-1 in peripheral blood from cervical cancer group((15.23±1.05)%)were significantly higher than those of CIN III group ((8.64±0.53)%)(t=5.61,P<0.01)and healthy controls group((5.93±0.24)%)(t=7.87，P<0.01).Patients of stageⅢandⅣ((16.85±1.74)%)were significantly higher than those of stageⅠandⅡ((14.27±0.86)%)(t=-3.46,P<0.01),patients with lymph node metastasis ((16.56±1.37)%)were higher than those without lymph node metastasis ((14.83±0.96)%)(t=-2.29，P<0.05)．PD-1 in cervical cancer patients with different difierentiation degree and histological type showed no significant difference．The area under curve(AUC) of PD-1 in peripheral blood was 0.925.At the optimal cut-off of 15.07%,the diagnostic sensitivity and specificity were 75.12% and 88.47%.ConclusionThe 1evel of peripheral blood PD-1 may benefit the early aided diagnosis of cervical cancer and may play a role in the prognostic judgment．

Key words:uterine cervical neoplasms；PD-1；biological markers；flow cytometry

基金項(xiàng)目：廣東省江門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201471)

文章編號(hào)：1007-4287(2016)05-0779-04

中圖分類號(hào)：R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：伍金華(1979-)，男，36歲，副主任檢驗(yàn)技師,碩士，研究方向：外周血PD-1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

(收稿日期：2014-12-20)