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    復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠體外釋放度的測定

    2016-05-31 08:44:46程鳳峽王志潔
    關(guān)鍵詞:柚皮苷高效液相色譜法

    程鳳峽,田 華,王志潔,劉 勇

    (河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

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    藥物研究

    復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠體外釋放度的測定

    程鳳峽,田華,王志潔,劉勇

    (河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

    [摘要]目的建立同時(shí)測定復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠中多西環(huán)素與柚皮苷含量的方法,考察其體外釋放度。方法采用高效液相色譜(HPLC)法測定凝膠中多西環(huán)素和柚皮苷含量,采用轉(zhuǎn)籃法測定其體外釋放度。結(jié)果復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠中多西環(huán)素含量為99.80 mg/g,柚皮苷的含量為97.38 μg/g,凝膠的體外釋放分為速釋和緩釋兩個(gè)階段。結(jié)論本方法簡便可靠,可用于復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠中多西環(huán)素與柚皮苷含量以及體外釋放度的測定。復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠中有效藥物成分在體外緩慢釋放可以達(dá)到緩釋制劑要求。

    [關(guān)鍵詞]緩釋凝膠;多西環(huán)素;柚皮苷;高效液相色譜法;釋放度

    牙周病是牙周組織的慢性感染性破壞性疾病,以菌斑細(xì)菌為始動(dòng)因子,其最終結(jié)果將導(dǎo)致牙周袋形成,牙槽骨吸收,牙齒松動(dòng)、脫落。牙周病的治療一直是困擾臨床醫(yī)師的重要問題。近年來,局部用藥尤其是局部緩釋制劑受到越來越多的關(guān)注,但尚沒有理想的制劑可應(yīng)用于臨床。多西環(huán)素不僅能抑制多種牙周致病菌,還能抑制膠原酶活性,減輕其對牙周組織的破壞[1]。研究證實(shí)骨碎補(bǔ)不但能刺激牙周膜細(xì)胞的增殖及骨分化潛能,且有利于成纖維細(xì)胞在牙面上的附著,在新附著形成中起重要作用[2-3]。復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠以多西環(huán)素和骨碎補(bǔ)為主藥,聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)為緩釋輔料[4],使藥物在牙周袋內(nèi)緩慢釋放,為臨床牙周病治療提供一種無創(chuàng)且方便有效的方法。本試驗(yàn)對此緩釋凝膠的體外釋放度進(jìn)行初步探討。

    1實(shí)驗(yàn)資料

    1.1儀器島津LC-20AT高效液相色譜儀,Kromasil C18(100 mm×4.6 mm,5 μm),SPD-M20A紫外檢測器,LCsolution色譜工作站,梅特勒AG-254電子天平,ZRS-4智能溶出試驗(yàn)儀。

    1.2試劑多西環(huán)素對照品(批號:0485-0401)、柚皮苷對照品(批號:110722-200610),均由中國藥品生物制品檢定所提供。多西環(huán)素原料,由華北制藥集團(tuán)提供。骨碎補(bǔ)由河北省人民醫(yī)院中藥房提供,產(chǎn)地為廣西。1-甲基-2-吡咯烷酮(lMP)、三乙酸甘油酯(GAT)均為分析純,由北京奇松生物科技有限公司提供。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)由長春圣博瑪生物材料有限公司提供,乳酸:羥基乙酸為75∶25。復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠,自制。

    1.3凝膠制備骨碎補(bǔ)煎煮2遍,過濾,加熱濃縮,醇沉,配制成質(zhì)量濃度為每毫升含1 g生藥的骨碎補(bǔ)提取液。精密稱取600 mg PLGA 75∶25,用混合溶劑(1MP∶GAT=7∶3)1 mL溶解,待完全溶解后,加入多西環(huán)素原料200 mg和骨碎補(bǔ)提取液20 μL,最后加入混合溶劑至2 g,漩渦震蕩。4 ℃避光保存。

    1.4方法

    1.4.1測定方法由于中藥骨碎補(bǔ)成分復(fù)雜,本實(shí)驗(yàn)采用骨碎補(bǔ)主要成分柚皮苷作為凝膠中骨碎補(bǔ)含量和釋放度測定的指標(biāo)。采用高效液相色譜法對凝膠中多西環(huán)素和柚皮苷進(jìn)行定量分析,采用轉(zhuǎn)籃法對多西環(huán)素和柚皮苷進(jìn)行體外釋放度測定。

    1.4.2測定條件色譜柱:Kromasil C18(100 mm×4.6 mm,5 μm),HPLC分析條件見表1。用氨水調(diào)流動(dòng)相B pH值到8.0左右,流速1.0 mL/min;柱溫室溫;檢測波長280 nm。

    表1 流動(dòng)相條件

    1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線取多西環(huán)素對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL中含多西環(huán)素1 000 μg的溶液,作為對照品溶液A。精密稱取對照品溶液A適量,用甲醇稀釋至濃度分別為50,100,200,300,400,500 μg/mL,進(jìn)樣10 μL測定峰面積,以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸,得出回歸方程為:A=2 710.7Cx+11 249,r=0.999 5。結(jié)果表明,多西環(huán)素在50~500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取柚皮苷對照品,110 ℃干燥至恒重,精密稱定,用甲醇配成10 μg/mL的柚皮苷溶液,作為對照品溶液B。精密量取對照品溶液B, 用甲醇稀釋成濃度分別0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6 μg/mL,分別進(jìn)樣20 μL,測定峰面積,并以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸,得出回歸方程A=398 545Cx+299.86,r=0.999 8,柚皮苷在0.025~0.6 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。多西環(huán)素和柚皮苷對照品的色譜圖見圖1。

    A為柚皮苷,B為多西環(huán)素

    1.4.4精密度試驗(yàn)取2.3步驟中200 μg/mL的多西環(huán)素溶液和0.1 μg/mL的柚皮苷溶液各連續(xù)進(jìn)樣5次,多西環(huán)素和柚皮苷峰面積的RSD分別為0.85%和0.97%,表明該方法精密度良好。

    1.4.5重復(fù)性試驗(yàn)取5份復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠樣品約0.1 g,精密稱定,加適量三氯甲烷溶解,轉(zhuǎn)至25 mL分液漏斗中,用甲醇5 mL萃取4次,合并甲醇層,置100 mL棕色量瓶中加甲醇至刻度,搖勻,過濾,取濾液進(jìn)樣20 μL。結(jié)果凝膠中多西環(huán)素和柚皮苷含量平均值分別為99.83 mg/g,柚皮苷的含量為97.51 μg/g, RSD分別為1.34%和0.98%,表明該方法重復(fù)性良好。

    1.4.6輔料干擾試驗(yàn)取不含多西環(huán)素及骨碎補(bǔ)提取液的空白凝膠約0.1 g注射到甲醇溶液100 mL中,過濾,取濾液進(jìn)樣20 μL, 在波長280 nm下,輔料在多西環(huán)素和柚皮苷的保留時(shí)間處無吸收,不干擾測定。

    1.4.7溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取2.3中濃度為100 μg/mL多西環(huán)素對照品溶液在2,4,6,8,10 h進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10 μL,測得其峰面積日內(nèi)RSD為1.57%。取濃度為0.1 μg/mL的柚皮苷對照品溶液在2,4,6,8,10 h進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10 μL,測得其峰面積日內(nèi)RSD為0.78%。表明溶液穩(wěn)定性良好。

    1.4.8回收率試驗(yàn)制備復(fù)方多西環(huán)素凝膠樣品5份,各1 g,其中加入有效藥物為精密稱定的多西環(huán)素和柚皮苷對照品,見表2,精密稱定約0.1 g, 按照2.5的方法處理制成供試溶液,進(jìn)樣檢測。

    1.4.9含量測定取復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠制劑5份,精密稱重,按照2.5下方法測定,記錄峰面積,計(jì)算凝膠中多西環(huán)素平均含量為99.80 mg/g,柚皮苷的含量為97.38 μg/g。

    表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

    1.4.10體外釋放度試驗(yàn)依據(jù)2010年版《中國藥典》附錄XC轉(zhuǎn)籃法測定其釋放度[5]。取復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠約200 mg,精密稱定,放于溶出儀的圓底燒瓶內(nèi),燒瓶遮蓋避光。介質(zhì)為100 mL脫氣蒸餾水,轉(zhuǎn)速50 r/min,溫度(37±0.5)℃,在第2,6,10,24,48,72,96,120,144,168 h取樣,每次取樣2 mL,補(bǔ)充脫氣蒸餾水2 mL。取釋放液離心,取上清液,進(jìn)樣20 μL,記錄多西環(huán)素及柚皮苷的峰面積并計(jì)算出二者的相對累積釋放百分率。結(jié)果見圖2。

    圖2 復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠中多西環(huán)素和

    3討論

    牙周袋內(nèi)緩釋藥物的應(yīng)用因其方便、無創(chuàng)、藥效持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為牙周病藥物治療的發(fā)展趨勢。牙周局部緩釋用藥的理想標(biāo)準(zhǔn)包括:藥物可持續(xù)釋放較長時(shí)間發(fā)揮作用,減少毒副作用;對牙周致病菌有較強(qiáng)的殺滅或抑制作用;可促進(jìn)牙周組織再生;減少上藥頻率,提高患者依從性;藥物可貼附在牙周袋中不易脫落,無不適;緩釋載體有良好的生物相容性,可生物降解;劑型便于臨床操作,能深入牙周袋底及根分叉處等;但目前臨床尚沒有一種制劑能滿足這些要求[6-7]。

    本研究中復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠采用的治療藥物為多西環(huán)素和骨碎補(bǔ),在牙周治療中起到抑菌、抗膠原酶、促進(jìn)牙周成纖維細(xì)胞的成骨分化及在牙面附著等多重作用;PLGA作為緩釋輔料能明顯延長藥物釋放時(shí)間,且具有良好的生物相容性,可降解,已被FDA正式批準(zhǔn)為藥用輔料[8];1MP作為溶劑,GTA作為增塑劑,均有良好的生物降解性能,對凝膠最終的物理性狀起到重要作用,滿足了牙周局部凝膠應(yīng)用方便,可深入牙周袋底部及根分叉區(qū),藥物緩慢釋放,不易脫落,異物感小等要求。

    本試驗(yàn)曾嘗試過不同比例的乙腈-磷酸水溶液、乙腈-醋酸銨水及甲醇-醋酸水溶液等多種流動(dòng)相,最終采用甲醇-醋酸銨水溶液進(jìn)行梯度洗脫的方法,能將多西環(huán)素和柚皮苷較好的分離,峰形穩(wěn)定,可以作為復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠中這兩個(gè)成分測定的方法。由于多西環(huán)素遇光不穩(wěn)定,在整個(gè)試驗(yàn)過程均應(yīng)注意遮光操作,避免其分解。

    本實(shí)驗(yàn)中凝膠遇水凝結(jié)成膜狀,因此筆者參照固體制劑的體外釋放度的試驗(yàn)方法,研究其體外釋放度。緩釋輔料PLGA遇水凝結(jié)形成多孔道骨架,藥物可沿多孔道緩慢釋放[9],結(jié)果表明該凝膠的體外釋放可持續(xù)長達(dá)7 d。而開始階段的速釋可能是是由于凝膠遇水后溶于水的溶劑與水置換導(dǎo)致,同時(shí)藥物通過表面的孔道也釋放較快??傊?,藥物體外釋放基本達(dá)到緩釋制劑的要求,而在牙周袋內(nèi)的藥物釋放有待于進(jìn)一步探討。

    [參考文獻(xiàn)]

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    [收稿日期]2015-08-20

    [中圖分類號]R285.5

    [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B

    [文章編號]1008-8849(2016)04-0433-03

    doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.04.033

    [基金項(xiàng)目]河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃指令課題(20110001)

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