基于血液微透析技術(shù)探究五味子甲素的體內(nèi)代謝過程

諸明娜 徐瑞鑫

摘要：目的 建立高效液相色譜法測定大鼠血漿中五味子甲素的方法，探討五味子甲素在大鼠血中的代謝過程。方法 采用血液微透析技術(shù)，將探針由右側(cè)頸靜脈植入大鼠右心房膨大處，透析取樣。透析液檢測的色譜條件為：以甲醇-乙腈-水（40∶35∶25）為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，UV檢測波長254 nm。經(jīng)體內(nèi)測定探針的回收率校正后，繪制藥時曲線，采用DAS2.0軟件計(jì)算五味子甲素灌胃給藥后在大鼠血液中的藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果 五味子甲素在2～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 5），日內(nèi)精密度和日間精密度均RSD<3%，五味子甲素的含藥透析液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。藥動學(xué)參數(shù)ke為（0.364±0.047）/h，t1/2為（1.637±0.302）h，Tmax為（0.612±0.194）h，Cmax為（165.92±28.830）μg/mL，AUC0-t為（240.793±25.540）μg·h/mL，AUC0-∞為（282.710±30.727）μg·h/mL。結(jié)論 本方法操作便捷、液相保留時間短，能滿足透析液中五味子甲素含量測定的需要，可用于五味子甲素在大鼠血液中代謝過程的研究。

關(guān)鍵詞：血液微透析；五味子甲素；高效液相色譜法；藥時曲線

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.025

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）06-0099-04

Abstract： Objective To establish an HPLC method for evaluating deoxyschizandrin in rat plasma； To explore deoxyschizandrin metabolic processes in blood. Methods The blood microdialysis probe was implanted into the right atrial enlargement through right jugular vein to detect the concentration of deoxyschizandrin in blood. Chromatographic conditions for detecting of dialysis fluid were as follows： mobile phase was methanol-acetonitrile- water （40：35：25）； flow rate was 1 mL/min； column temperature was 30 ℃； UV detection wavelength was 254 nm. The data obtained after being calculated by the recovery rate of the probe in vivo were dealt with DAS 2.0 software. Pharmacokinetic parameters were calculated， and the concentration-time related curves were plotted. Results The deoxyschizandrin curve was linear （r=0.999 5） within the range of 2–500 μg/mL. The RSD of intra-day pecision and inter-day pecision were both <3%. The stability of the solution was good in 12 hours at roomtemperature. ke was （0.364±0.047）/h； t1/2 was （1.637±0.302）h； Tmax was （0.612±0.194）h； Cmax was （165.92±28.830） μg/mL； AUC0-t was （240.793±25.540） μg·h/mL； AUC0-∞ was （282.710±30.727） μg·h/mL. Conclusion The method is convenient to perform， and the retention time of HPLC is short. This method is suitable for detecting the content of deoxyschizandrin in dialysis fluid， which can also be used to investigate the metabolic processes of deoxyschizandrin in the rat blood.

Key words： microdialysis； deoxyschizandrin； HPLC； concentration-time curve

微透析技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型的生物在體采樣技術(shù)，在組織或者血管中植入具有半透膜的探針，小分子物質(zhì)可以隨著濃度梯度通過半透膜，而分子量較大的物質(zhì)如蛋白等則不能自由通過半透膜。采用微量灌流泵使一定量的灌流液流經(jīng)探針，即可在收集裝置中定量檢測所測物質(zhì)的含量。微透析技術(shù)最早用于測定實(shí)驗(yàn)動物腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量[1]，目前，該技術(shù)已成為研究各種動物腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化所不可缺少的方法之一。由于微透析技術(shù)可從實(shí)驗(yàn)動物血液中連續(xù)動態(tài)取樣，而且所采集的樣本都是小分子物質(zhì)，無需除去血清中蛋白的純化過程，可以直接采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行檢測，大大提高了實(shí)驗(yàn)操作的便利性[2]，因此近年來其在藥動學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[3-4]。

五味子是多年生木蘭科植物，具有收斂固澀、補(bǔ)腎寧心、益氣生津的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，五味子可作用于機(jī)體多個系統(tǒng)，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等[5]，尤其是在保護(hù)肝損傷[6]和抗氧化[7]方面具有非常顯著的療效。五味子甲素是中藥五味子中的木脂素類成分之一，具有誘導(dǎo)肝微粒體細(xì)胞色素P450酶活性進(jìn)而增強(qiáng)肝臟的解毒功能、降低血清轉(zhuǎn)氨酶、阻斷多種毒性物質(zhì)對肝細(xì)胞膜的損傷等作用。中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化的重點(diǎn)和核心內(nèi)容，本研究采用微透析技術(shù)對五味子中主要藥效成分之一五味子甲素在大鼠體內(nèi)的代謝過程進(jìn)行研究，以期初步闡明五味子甲素在血液中的代謝特點(diǎn)，為五味子制劑在臨床的更廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與動物

e2695高效液相色譜儀（Waters公司），2998UV二極管陣列檢測器，kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司），CMA402透析液灌流泵（瑞典CMA公司），微透析探針（shaft：5 cm，cut off：15 kD，瑞典MAB公司）。

五味子甲素，成都科普生物有限公司，HPLC測定純度>98%，批號110857-201311。吐溫-80，化學(xué)純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；甲醇，HPLC級，美國迪馬試劑公司；氯化鈉，分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠；氯化鉀，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；硫酸鎂，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；純凈水，Millipore water purification systems 制備；氯化鈣，分析純，天津市基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；碳酸氫鈉，分析純，齊齊哈爾市華僑化工廠。

清潔級雄性Wistar大鼠6只，體質(zhì)量（250±20）g，購自南京醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號SYXK（蘇）2002-0013。實(shí)驗(yàn)前在本實(shí)驗(yàn)室條件下單籠飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)環(huán)境，減少應(yīng)激對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，溫度20～22 ℃，相對濕度45%～65%。

2 方法與結(jié)果

2.1 微透析取樣方法的建立

2.1.1 透析液的配制 采用Ringer's Solution作為透析液[8]，包括0.4 mmol/L KH2PO4、3.0 mmol/L KCl、25.0 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/L CaCl、1.2 mmol/L MgSO4、122.0 mmol/L NaCl，另加入1%吐溫-80，混懸后超聲震蕩20 min使其形成均一穩(wěn)定的溶液。透析液均為每次使用前現(xiàn)配。

2.1.2 微透析探針的植入 10%烏拉坦溶液（10 mL/kg）麻醉大鼠，仰位固定于手術(shù)臺上，剪開頸部皮毛，鈍性剝離右側(cè)頸靜脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，采用眼科剪刀在靜脈血管處開一小口，將含有保護(hù)套管的微透析探針經(jīng)由頸靜脈植入大鼠右心房膨大處[9]（上腔靜脈與下腔靜脈匯合位置，距離頸外靜脈和頸內(nèi)靜脈匯合處約3.3～3.5 cm），用非吸附性手術(shù)線固定，防止探針脫位。整個植入過程中用吐溫-80潤滑保護(hù)套管，以保證探針順利植入。

2.2 五味子甲素測定方法

2.2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[10-12]中五味子甲素的HPLC檢測方法，并結(jié)合本試驗(yàn)中透析液的特性，對檢測條件進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。最終確定色譜條件如下：流動相為甲醇-乙腈-水（40∶35∶25），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，UV檢測波長254 nm。

2.2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取五味子甲素對照品1.0 mg，溶解在2 mL透析液中，配制成濃度為0.5 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 專屬性考察 分別進(jìn)樣五味子甲素對照品儲備液、空白透析液和大鼠給藥后血液透析液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，考察該色譜條件的專屬性。五味子甲素對照品、空白透析液和大鼠給藥后血液透析液的高效液相色譜圖見圖1，五味子甲素的保留時間約為9.8 min，五味子甲素峰與周圍雜質(zhì)峰能夠達(dá)到基線分離，且峰形良好，透析液中其他成分對信號峰無干擾。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取對照品儲備液適量用空白透析液進(jìn)行梯度稀釋，得到系列濃度梯度的對照品透析液，即500、200、100、20、2 μg/mL。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，以峰面積對五味子甲素濃度做線性回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=4781.0X+18 697.1，r=0.999 5，表明五味子甲素在2～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 日內(nèi)精密度和日間精密度考察 取濃度分別為500、200、20 μg/mL的五味子甲素透析液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件在同日內(nèi)連續(xù)5次進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，分別測定3個濃度的日內(nèi)精密度。將上述3個濃度的五味子甲素透析液連續(xù)5 d重復(fù)進(jìn)樣檢測，進(jìn)樣量為10 μL，測定日間精密度。結(jié)果見表1。結(jié)果表明，無論日內(nèi)精密度還是日間精密度，500、200、20 μg/mL五味子甲素峰面積RSD值均在0.58%～2.89%之間，符合定量檢測的要求。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取濃度分別為500、200、20 μg/mL的五味子甲素透析液，室溫放置，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于2、4、6、8、12 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積。結(jié)果表明500、200、20 μg/mL五味子甲素峰面積RSD值分別為0.62%、0.82%、1.34%，符合定量檢測的要求，表明五味子甲素透析液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 五味子甲素藥動學(xué)研究

2.3.1 樣品采集與測定 打開透析液灌流泵（流速2 μL/min），用空白透析液灌流1 h后，灌胃給藥五味子甲素20 mg/kg，灌胃后立即開啟透析液自動收集裝置，樣品采集點(diǎn)分別為第5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、115、135、155、185、215、245 min，共連續(xù)收集16個樣品。所得透析液樣品按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件立即進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積。

2.3.2 體內(nèi)回收率測定 收集樣品后，用空白透析液繼續(xù)灌流2 h，然后換用已知濃度的五味子甲素透析液（濃度100 μg/mL）繼續(xù)灌流，平衡1 h后，收集連續(xù)3個樣品，收集間隔為10 min。收集樣品按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件立即進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積，測定探針在大鼠體內(nèi)的回收率（R），計(jì)算公式R=（1-Cout/Cin）×100%[13]。個體血藥濃度均經(jīng)自身的體內(nèi)回收率進(jìn)行校正。個體實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，開胸檢查探針半透膜植入的位置，位置不正確的個體數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計(jì)。

2.3.3 藥動學(xué)參數(shù)的計(jì)算 運(yùn)用DAS2.0藥動學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用統(tǒng)計(jì)矩的方法計(jì)算各藥動學(xué)參數(shù)，并以血藥濃度對時間做藥時曲線，結(jié)果見圖2、表2。

3 討論

血液微透析技術(shù)可在同一實(shí)驗(yàn)動物的不同組織中植入探針，進(jìn)而同時連續(xù)動態(tài)地監(jiān)測藥物在多個組織的代謝過程，既降低了實(shí)驗(yàn)誤差，又減少了實(shí)驗(yàn)動物的樣本數(shù)。與傳統(tǒng)的采靜脈血測定方法相比，血液微透析的在體取樣技術(shù)不減少動物體液含量，而且透過透析膜的小分子物質(zhì)可直接進(jìn)行液相檢測，所測血藥濃度更加準(zhǔn)確。另外，采得的樣本都是游離態(tài)藥物，相對來說能更加準(zhǔn)確反映有效成分的藥物濃度[14]。

有研究表明，雄性大鼠細(xì)胞色素P3A1、P3A2、P3A18在微粒體內(nèi)的含量分別為雌性大鼠的5、10、20倍以上，另外，雄性大鼠細(xì)胞色素P450酶的含量也較雌性大鼠高10%～30%[15]，這也解釋了與五味子甲素同為木脂素類成分的五味子醇甲在雌性大鼠體內(nèi)代謝相對較慢的現(xiàn)象。為最大程度上減少實(shí)驗(yàn)動物性別因素對結(jié)果的影響，本研究全部采用Wistar品系雄性大鼠。

探針的植入位置對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大[16]。在本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，曾考察過其他植入位置，如大鼠的頸靜脈，但此處空間狹小且血流速度較慢，探針植入后阻礙頸靜脈血液回流，并且極易造成凝血，致使探針透析膜堵塞。最終選用大鼠上下腔靜脈匯合處作為探針植入處，此處接近大鼠的右心房，空間較大，將探針植入此處，雖然阻礙了一小部分上腔靜脈血液的回流，但下腔靜脈會提供充足的血流供透析采樣。經(jīng)過反復(fù)預(yù)試驗(yàn)的摸索，最后確定采用體質(zhì)量250 g左右的大鼠、探針由頸靜脈植入的深度在3.3～3.5 cm之間較為合適。

常用的測定微透析探針回收率的方法主要有體外測定和體內(nèi)測定2種[17-18]。由于體內(nèi)測定的環(huán)境、溫度、pH值和血流速度等都與探針實(shí)際透析時一致，測定結(jié)果更加準(zhǔn)確、客觀。因此，本研究采用體內(nèi)減量法測定探針的回收率。

本研究考察的是大鼠灌胃給藥五味子甲素后在體內(nèi)的代謝過程，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中沒有考察五味子甲素在大鼠體內(nèi)是否符合線性藥動學(xué)的特征，在藥動學(xué)參數(shù)的計(jì)算過程中采用房室模型擬合是不合理的，因此，本研究采用統(tǒng)計(jì)矩的方法計(jì)算相關(guān)的藥動學(xué)參數(shù)，該方法主要通過藥時曲線下面積分析藥物在體內(nèi)的代謝過程，不受限于數(shù)學(xué)模型，適用于任何隔室模型，是非隔室分析法之一[19]。

五味子甲素在大鼠體內(nèi)的藥時曲線表明，大鼠灌胃五味子甲素后血藥濃度迅速升高，約35 min后血藥濃度達(dá)到峰值（165 μg/mL左右），隨后迅速下降。由藥動學(xué)參數(shù)可以看出，五味子甲素在大鼠體內(nèi)的半衰期和滯留時間均較短，屬于快速代謝型藥物，這與以往文獻(xiàn)報道的結(jié)果相似[20]。

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（收稿日期：2015-07-10）

（修回日期：2015-08-03；編輯：陳靜）