姜黃素和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對阿爾茨海默病記憶的改善作用

耿曉英，張愛香，騫 健，郭 剛，張璐璐，王 靜

（西安交通大學附屬廣仁醫(yī)院，西安市第四醫(yī)院，陜西西安 710004）

姜黃素和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對阿爾茨海默病記憶的改善作用

耿曉英，張愛香，騫 健，郭 剛，張璐璐，王 靜

（西安交通大學附屬廣仁醫(yī)院，西安市第四醫(yī)院，陜西西安 710004）

目的 研究姜黃素對阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）模型大鼠學習記憶能力的影響及其作用機制。方法 采用腦室內(nèi)注射Aβ1－42的方法，制備AD動物模型。單次腹腔注射（急性治療組）或連續(xù)6d腹腔注射（慢性治療組）50、100、300mg/kg劑量的姜黃素，結(jié)合海馬內(nèi)微量注射腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）（每側(cè)1.0μg）、BDNF shRNA慢病毒（每側(cè)2.0×105單位），分析大鼠Y迷宮、Morris水迷宮及曠場行為變化，并應用Western blot檢測海馬BDNF表達變化。結(jié)果 姜黃素急性治療對AD模型大鼠自主改變行為、總活動距離、水迷宮潛伏期沒有顯著作用。300mg/kg姜黃素慢性治療后AD大鼠自主改變行為（P＜0.000 1）及在水迷宮測試中記憶能力（P＜0.05）比鹽水對照組顯著增高。100和300mg/kg姜黃素慢性治療組海馬BDNF表達和鹽水對照組相比顯著上升（P分別＜0.05和＜0.000 1）。海馬內(nèi)注射BDNF的AD大鼠水迷宮潛伏期顯著下降（F4，295＝5.813，P＜0.01）。姜黃素慢性治療＋shBDNF組大鼠在2號象限內(nèi)的游泳時間與鹽水對照組無差異（P＝0.657），而100 mg/kg姜黃素組、BDNF組、假手術(shù)組大鼠的停留時間比鹽水對照組顯著增高（P值分別＜0.05、＜0.05、＜0.000 1）。結(jié)論 姜黃素可能通過上調(diào)BDNF的表達繼而激活下游信號通路，最終對Aβ誘導的AD大鼠學習記憶能力起到改善作用。

阿爾茨海默??；姜黃素；海馬；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；Y迷宮；Morris水迷宮；曠場實驗；shRNA

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是臨床最常見的一種癡呆（dementia）病癥，是老年人常見的神經(jīng)退行性疾病。AD患者典型的主要臨床表現(xiàn)為進行性的認知障礙、記憶功能減退、日常生活能力降低及人格改變［1］。其典型的組織學改變包括神經(jīng)毒素淀粉質(zhì)β多肽（amyloid beta peptide，Aβ）在細胞外大量沉淀，減低突觸可塑性，引起突觸丟失，促成氧化損傷，進而引起神經(jīng)元內(nèi)的tau蛋白超磷酸化［2］，然而AD的病因和確切發(fā)病機制尚未完全闡明。

姜黃素（curcumin，Cur）是一種傳統(tǒng)草藥姜黃（Curcuma longa）的主要多酚類成分提取物。其功能有抗細菌、抗病毒、廣泛的分子靶向作用、抗氧化、類蛋白激酶作用，從而影響信號轉(zhuǎn)導，改善認知［3－4］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，在人的大腦皮質(zhì)和海馬組織有高水平表達，并能在功能和形態(tài)上調(diào)節(jié)突觸可塑性。目前尚未見報道姜黃素對AD治療作用是否與BDNF有關(guān)。本研究采用向大鼠腦室內(nèi)注射Aβ1－42，建立AD模型，用姜黃素治療及/或BDNF干預或改變其活性時，觀察模型大鼠行為學改變，以揭示姜黃素治療AD發(fā)病的部分機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 成年Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠共150只，體質(zhì)量200～220g。姜黃素及Aβ1－42標準品購自Sigma－Aldrich公司。BDNF全長蛋白質(zhì)及兔抗BDNF多克隆抗體購自Abcam公司。小鼠抗GAPDH抗體購自Millipore公司。BDNF shRNA慢病毒顆粒、非靶向性對照慢病毒顆粒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗皆購自Santa Cruz公司。

1.2 AD模型建立 采用腦室內(nèi)注射Aβ1－42的方法制備AD動物模型。用生理鹽水配制Aβ1－42為5mg/mL溶液，于37℃孵育72h進行活化。大鼠腹腔注射350mg/kg體質(zhì)量的水合氯醛麻醉后置于腦立體定位裝置（深圳沃瑞德生命科技公司）上固定。大鼠頭部去毛并消毒皮膚，頭頂正中切開皮膚，充分暴露前囟，依照大鼠腦立位圖譜（坐標為：AP＝－1.9mm，ML＝±1.4mm，DV＝－2.9mm），鉆開顱骨并以微量注射器自腦表面垂直進針，向側(cè)腦室內(nèi)緩慢注入2μL配制好的5mg/mL預激活的Aβ1－42。注射時間不少于5min，注射后繼續(xù)留針2min以確保Aβ1－42溶液充分擴散至腦室。部分需進行海馬內(nèi)藥物注射的大鼠按照大鼠腦立位圖譜（坐標為：AP＝－3.6mm，ML＝±2.0mm，DV＝－2.8mm）顱骨打孔并置入微量注射導管，以牙科水泥封閉固定。所有步驟均無菌操作，術(shù)后大鼠連續(xù)6d腹腔注射青霉素防止感染。模型組注射等量生理鹽水代替Aβ1－42，假手術(shù)組不進行注射，其余操作均與造模組相同。

1.3 分組 實驗共分3部分進行。第一部分為姜黃素急性給藥，大鼠隨機分為5組，每組12只：假手術(shù)組、模型組、AD模型＋急性姜黃素50、100、300mg/kg組（僅在行為學實驗前30min腹腔注射1次相應劑量姜黃素）。

第二部分為姜黃素慢性給藥，大鼠隨機分為5組，每組12只：假手術(shù)組、模型組、AD模型＋慢性姜黃素50、100、300mg/kg組（連續(xù)給藥6d，每天腹腔注射1次相應劑量姜黃素，第6天最后1次注射30min后進行各項行為測試）。

第三部分為海馬內(nèi)BDNF干預，大鼠隨機分為5組，每組12只：假手術(shù)組、模型組、AD模型＋慢性姜黃素（100mg/kg）組、AD模型＋BDNF組、AD模型＋慢性姜黃素（100mg/kg）＋海馬內(nèi)注射shBDNF慢病毒組（注射姜黃素同時海馬內(nèi)微量注射每側(cè)1.0 μg BDNF蛋白，并設(shè)對照組，即每側(cè)注射約2.0×105單位shBDNF慢病毒顆?；虻润w積生理鹽水作為對照，注射體積為1.0μL每側(cè)；注射時使用10μL規(guī)格的微量進樣器，將針頭插進微量注射導管緩慢進行注射，注射時間不少于5min。

實驗期間大鼠自由飲食，室溫22～25℃，每日12h/12h循環(huán)光照。

1.4 曠場實驗 曠場實驗箱體為黑色正方形（100cm ×100cm×60cm），頂部敞開。大鼠置于曠場中央并自由探索60min，由視頻追蹤軟件記錄并分析其總活動距離。

1.5 Y迷宮實驗 Y迷宮為黑色的3個塑料長臂組成，每個臂之間相隔120°角。每個臂長30cm，寬10cm，高25cm。實驗室中等強度光照，實驗開始時，大鼠置于Y迷宮中心并自由探索5min，Anymaze視頻追蹤軟件（美國Stoelting公司）記錄并分析各臂的進入順序、進入次數(shù)及進入時間。根據(jù)TYPLT等［5］的描述，大鼠進行1次不重復探索完3個臂為1次“自主改變行為”，其占各臂總進入次數(shù)的百分比反映了工作記憶的強度。

1.6 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮直徑150cm，高60cm，室溫及水溫均保持在（22±2）℃。整個迷宮劃分為等面積的4個扇形象限，每個象限附近設(shè)有1個特征顯著的標識物。在2號象限內(nèi)放有1個10cm ×10cm大小的透明平臺，平臺頂部低于水面1.0cm。平臺僅在訓練期放置于迷宮中，測試期則取出平臺。

各組大鼠分別于術(shù)后進行Morris水迷宮訓練，每天上下午各訓練1次，連續(xù)5d。訓練時固定1個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠平均游泳速度、尋找并爬上平臺的路線及所需時間（潛伏期）。如果大鼠在120s內(nèi)未找到平臺，需將其引導至平臺并停留10s。于第6天進行空間定位航行測試（navigation probe－task），測試期間移除平臺，大鼠自由探索120s并記錄大鼠游至原平臺所在位置的次數(shù)、所需時間及2號象限的游泳距離和時間。數(shù)據(jù)采集和處理由視頻追蹤軟件自動監(jiān)視處理完成。

1.7 Western blot檢測BDNF表達 大鼠斷頭處死，冰上剝離大腦并切取海馬組織，經(jīng)預冷RIPA組織裂解液（含磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑）提取蛋白。在100g/L SDS－PAGE凝膠中電泳，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST室溫封閉1h，分別加入BDNF、抗GAPDH抗體（抗體稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后再用相應的二抗室溫孵育1h。洗膜后化學發(fā)光，凝膠圖像處理系統(tǒng)照相并分析目標帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計軟件包GraphPad Prism 5.0對數(shù)據(jù)進行處理，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。各組之間用單因素方差分析或重復測量的雙因素方差分析，結(jié)合Dunnet’s多重檢驗（設(shè)定AD模型＋鹽水組為對照），進行數(shù)據(jù)的處理和比較。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素急性治療對AD模型大鼠學習記憶能力的作用 姜黃素急性治療各劑量組大鼠進行曠場實驗的結(jié)果進行雙因素方差分析表明，急性治療對各組大鼠總活動距離無顯著影響（治療：F4，210＝1.403，P＝0.234；時間：F5，210＝22.16，P＜0.000 1），各組大鼠活動能力均無差異（圖1A）。大鼠在曠場實驗結(jié)束1h后進行Y迷宮測試結(jié)果（圖1B）顯示，模型組自主改變行為顯著低于假手術(shù)組（P＜0.000 1），表明AD模型大鼠工作記憶能力明顯受損。而50、100、300 mg/kg急性姜黃素組大鼠的自主改變行為與模型組相比無顯著差異（分別為P＝0.341、P＝0.411和P＝0.427），表明急性姜黃素未能改善大鼠工作記憶能力。

大鼠單獨進行水迷宮訓練及測試時，在實驗開始后的前5d不注射任何藥物，進行Morris水迷宮訓練。訓練結(jié)果（圖1C）顯示，隨著訓練次數(shù)增多，大鼠水迷宮游泳潛伏期均呈現(xiàn)降低趨勢（時間：F4，190＝4.216，P＜0.01），而模型組大鼠潛伏期則普遍高于假手術(shù)對照組（Aβ1－42：F1，190＝19.80，P＜0.000 1）。在probe測試前大鼠急性腹腔注射姜黃素的結(jié)果（圖1D）顯示，模型組與假手術(shù)組相比，在2號象限內(nèi)的停留時間百分比顯著降低（P＜0.000 1），表明AD模型大鼠空間參考記憶明顯受損。而50、100、300mg/kg急性姜黃素組大鼠在2號象限內(nèi)的停留時間與模型組相比無顯著差異（分別為P＝0.341、P＝0.411和P＝0.427），說明50、100、300mg/kg急性姜黃素治療對AD模型大鼠空間參考記憶能力沒有顯著作用。

2.2 姜黃素慢性治療對AD模型大鼠學習記憶能力的作用 姜黃素慢性治療實驗中，在連續(xù)6d腹腔注射姜黃素后進行曠場實驗，結(jié)果（圖2A）顯示，慢性姜黃素對大鼠總活動距離無顯著影響（給藥：F4，210＝1.637，P＝0.421；時間：F5，210＝19.31，P＜0.000 1）。Y迷宮測試結(jié)果（圖2B）顯示，50mg/kg慢性姜黃素組大鼠自主改變行為與模型組相比無顯著改變P＝0.097），然而100、300mg/kg慢性姜黃素組大鼠的自主改變行為比模型組顯著增高（分別為P＜0.05和P＜0.000 1），表明100和300mg/kg慢性姜黃素治療改善了大鼠工作記憶能力。

在水迷宮訓練及測試實驗期間，連續(xù)6d腹腔注射姜黃素并進行訓練。結(jié)果（圖2C）顯示，100、300 mg/kg慢性姜黃素組大鼠潛伏期下降顯著（時間：F4，295＝4.824，P＜0.01）。Probe測試大鼠典型游泳軌跡（圖2D）顯示，50mg/kg姜黃素組與模型組大鼠在2號象限內(nèi)的停留時間無差異（P＝0.518），而100、300mg/kg慢性姜黃素組大鼠在平臺象限內(nèi)的游泳時間顯著高于模型組（分別為P＜0.000 1和P＜0.01），說明100mg/kg以上劑量的姜黃素慢性治療能顯著改善AD模型大鼠空間參考記憶能力。

圖1 姜黃素急性給藥后AD模型大鼠學習記憶實驗中的行為變化Fig.1Behavioral changes in the learning and memory tests in AD model rats after acute curcumin injection

圖2 姜黃素慢性給藥后AD模型大鼠學習記憶實驗中的行為變化Fig.2Behavioral changes in the learning and memory tests in AD model rats after chronic curcumin injection

2.3 姜黃素慢性治療對海馬內(nèi)BDNF表達的影響大鼠在連續(xù)6d腹腔注射姜黃素后斷頭處死，檢測海馬內(nèi)BDNF表達變化，結(jié)果（圖3）進行單因素方差分析顯示，姜黃素對海馬BDNF表達有顯著影響（F4，35＝12.445，P＜0.000 1）。多重檢驗發(fā)現(xiàn)50mg/kg姜黃素組BDNF表達與模型組無差異（P＝0.768），而100、300mg/kg姜黃素組的海馬BDNF表達則比模型組表達水平顯著增高（分別為P＜0.05、P＜0.000 1）。

2.4 姜黃素慢性治療及海馬內(nèi)BDNF對AD模型大鼠學習記憶能力的影響 為研究姜黃素慢性治療是否通過影響海馬內(nèi)BDNF表達繼而調(diào)控AD進展，采用注射BDNF蛋白和shBDNF慢病毒顆粒兩種方法，分別上調(diào)/下調(diào)海馬內(nèi)BDNF水平。訓練期結(jié)果（圖4A）顯示各藥物處理均未對大鼠游泳速度造成影響（藥物因素：F4，167＝0.169 1，P＝0.927；時間因素：F4，167＝0.103 4，P＝0.969 7），表明大鼠運動能力正常。100mg/kg姜黃素慢性組和海馬BDNF注射組大鼠的潛伏期下降顯著（時間：F4，295＝5.813，P＜0.01；圖4B），而海馬內(nèi)注射BDNF－shRNA慢病毒組潛伏期與模型組相比無差異，表明完全消除了慢性姜黃素治療的記憶改善作用。Probe測試中AD模型＋慢性姜黃素＋shBDNF組大鼠在2號象限內(nèi)的游泳時間與模型組無差異（P＝0.657），而AD模型＋BDNF組、AD模型＋100mg/kg姜黃素組、假手術(shù)組大鼠的停留時間比模型組顯著增高（P值分別＜0.01、＜0.05、＜0.000 1，圖4C），說明海馬內(nèi)BDNF可能介導了慢性姜黃素治療對記憶能力的改善作用。此外，各組大鼠平臺穿越次數(shù)也有顯著改變（F4，35＝12.813，P＜0.05；圖4D）。

圖3 姜黃素慢性治療對海馬內(nèi)BDNF表達的影響Fig.3Effects of chronic curcumin injection on hippocampal BDNF expression

圖4 姜黃素慢性治療及海馬內(nèi)注射BDNF對AD模型大鼠學習記憶能力的影響Fig.4Effects of chronic curcumin and hippocampal BDNF protein injection on the learning and memory abilities of the AD model rats

3 討論

大量在體及體外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在AD病理發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。AD患者腦內(nèi)Aβ水平增高與其認知能力的降低有顯著關(guān)聯(lián)［6－7］。向嚙齒類動物側(cè)腦室內(nèi)直接注射Aβ1－42可以引起明顯記憶缺陷，從而模擬出AD患者的認知能力減弱，因此，腦室內(nèi)注射Aβ成為一種重要的AD動物模型建立手段［8］。本研究在大鼠腦室內(nèi)注射Aβ1－42后，在運動能力未受影響的情況下表現(xiàn)出訓練潛伏期長，在原平臺象限內(nèi)的時間顯著減少，說明腦室內(nèi)注射Aβ1－42使大鼠空間認知和記憶能力嚴重受損，較成功建立了大鼠AD模型。

有研究報道，姜黃素具有改善老齡相關(guān)的認知能力降低、癡呆和其他情緒障礙的功效，并且介導了突觸內(nèi)多種蛋白的合成［9－10］。HOPPE等［11］在最近的研究中報道，Aβ對海馬腦切片中的神經(jīng)元突觸傳導造成損害，而姜黃素則可通過調(diào)控突觸內(nèi)的蛋白活性如突觸素Ⅰ（synapsinⅠ）和鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）的激活，消除Aβ的有害效果。AD模型動物通常會表現(xiàn)出明顯的海馬依賴的短時和長時空間學習和記憶能力缺陷［12－13］。Y迷宮是經(jīng)典的工作記憶（working memory）檢測手段之一，其自主改變行為反映了大鼠的短時記憶能力，而Morris水迷宮則是最廣泛使用的檢測長時空間參考記憶的實驗方法［8］。因此，本研究分別采用了Y迷宮和Morris水迷宮檢測姜黃素急性、慢性治療對大鼠認知能力的影響。結(jié)果表明，急性治療和50mg/kg姜黃素慢性治療對AD大鼠短時記憶和長時記憶均無顯著作用，而100～300mg/kg姜黃素慢性治療可以顯著逆轉(zhuǎn)Aβ所造成的學習記憶損害。此外，各組大鼠在曠場實驗中的結(jié)果均無差別，進一步說明大鼠迷宮實驗中的記憶能力改變確實為藥物作用的結(jié)果，與其活動能力無關(guān)。

血清中的BDNF被認為反映了大腦中BDNF的總體水平，研究發(fā)現(xiàn)AD患者血清中BDNF比同齡對照人群顯著減少，而高水平的血清BDNF則與AD病情嚴重程度成負相關(guān)［14］。對AD患者腦組織檢查發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)BDNF出現(xiàn)顯著降低，這一結(jié)果在動物模型中也被證實［15－16］。本研究結(jié)果與此一致，即Aβ抑制了海馬內(nèi)BDNF表達，而姜黃素（100～300mg/kg）慢性治療可以提高海馬內(nèi)BDNF的表達，這提示姜黃素可能是通過調(diào)控BDNF來發(fā)揮其記憶改善作用。

隨后，通過海馬內(nèi)微量注射BDNF蛋白來增強BDNF信號通路，海馬內(nèi)微量注射BDNF shRNA來特異性阻斷BDNF基因表達，研究BDNF在姜黃素治療效應中的作用。結(jié)果顯示，各組大鼠平均游泳速度沒有差別，說明大鼠活動能力正常。水迷宮結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射BDNF蛋白完全模擬了姜黃素對長時程記憶的改善作用，而阻斷BDNF表達后姜黃素的治療作用也被阻斷，這提示BDNF可能是姜黃素的必要調(diào)控分子。有證據(jù)表明BDNF可通過結(jié)合于其受體TrkB，繼而激活諸多下游信號轉(zhuǎn)導通路，例如CaMKII、ERK等，調(diào)控海馬神經(jīng)元突觸可塑性并加強學習記憶能力。無論是在AD患者［17］還是AD動物模型中［18］，均有報道腦內(nèi)ERK的mRNA和蛋白表達異常。TONG等［19］曾報導Aβ能抑制許多BDNF誘導的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的激活，例如，Aβ通過Ras－MAPK/ERK或PI3K/Akt通路抑制cAMP反應元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的激活，而這些通路都可被BDNFTrkB所調(diào)控。據(jù)此推測，姜黃素可能是通過上調(diào)BDNF的表達，繼而激活BDNF－TrkB－ERK－CREB信號通路，最終對Aβ誘導的AD大鼠學習記憶能力起到改善作用。這還需要更多實驗證據(jù)進行驗證。

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Therapeutic effect of curcumin and hippocampal brain－derived neurotrophic factor on a rat model of Alzheimer’s disease

GENG Xiao－ying，ZHANG Ai－xiang，QIAN Jian，GUO Gang，ZHANG Lu－lu，WANG Jing
（Guangren Hospital Affiliated to Xi’an Jiaotong University；the Fourth Hospital of Xi’an，Xi’an 710004，China）

Objective To study the effect of curcumin on the learning and memory ability in a rat model of Alzheimer’s disease（AD）.Methods AD rat model was prepared using intraventricular injection of Aβ1－42.Curcumin was acutely（single injection before the behavioral tests）or chronically（injected for 6 consecutive days）injected intraperitoneally at doses of 50，100 or 300 mg/kg.Brain－derived neurotrophic factor（BDNF）protein （1μg/side）or BDNF shRNA（2×105units/side）was infused into the hippocampus.The behavioral changes in Y－maze，open field test and Morris water maze and the expression of BDNF in the hippocampus were analyzed.Results Acute treatment with curcumin had no significant effects on the spontaneous alteration，locomotor activity or water maze latency of AD rats.AD rats treated chronically with curcumin（300 mg/kg）showed significant elevation in the spontaneous alternation（P＜0.000 1）in Y－maze and memory ability in the water maze test（P＜0.05）compared with those in the saline group.Chronic treatment with 100 and 300 mg/kg of curcumin induced an increased level of BDNF in the hippocampus as compared with the saline controls（P＜0.05 and＜0.000 1）.Intrahippocampal injection of BDNF significantly decreased the escape latency of AD rats in the water maze（F4，295＝5.813，P＜0.01）.Rats chronically injected with curcumin combined with shBDNF showed no difference in the swimming time inⅡquadrant as compared with saline controls（P＝0.657）.However，rats in100 mg/kgcurcumin group，BDNF group and sham group had significantly increased swimming time than the saline controls（P＜0.05，P＜0.05 and P＜0.000 1，respectively）.Conclusion Curcumin may activate the downstream signaling pathways by upregulating the expression of BDNF and ultimately contribute to the improvement of learning and memory in AD rats.

Alzheimer’s disease；curcumin；hippocampus；brain－derived neurotrophic factor；Y maze；Morris water maze；open field test；shRNA

R741

A

10.7652/jdyxb201602026

2015－03－03

2015－04－21

國家自然科學基金資助項目（No.31100900）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.31100900）

耿曉英.E－mail：gengxiaoying001@163.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1529.018.html（2016－02－02）