ASGPR與HBV preS1蛋白之間相互作用的驗(yàn)證

張 曦，劉小靜，陳云茹，孔 穎，楊雪亮，葉 峰，藺淑梅

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710061）

ASGPR與HBV preS1蛋白之間相互作用的驗(yàn)證

張 曦，劉小靜，陳云茹，孔 穎，楊雪亮，葉 峰，藺淑梅

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710061）

目的 驗(yàn)證去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）與乙肝病毒前S1蛋白（HBV preS1蛋白）之間的相互作用，確認(rèn)ASGPR作為乙肝病毒肝細(xì)胞膜受體在介導(dǎo)乙肝病毒感染的分子機(jī)制中的作用。方法 分別用哺乳動物雙雜交及體外免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證ASGPR與HBV preS1蛋白之間的相互作用，操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果 哺乳動物雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ASGPR與HBV preS1蛋白在細(xì)胞環(huán)境中具有相互作用；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ASGPR與HBV preS1蛋白在非細(xì)胞環(huán)境中具有相互作用。結(jié)論 ASGPR可能是介導(dǎo)HBV入侵的肝細(xì)胞膜受體之一。

乙型肝炎病毒；preS1蛋白；ASGPR；蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；哺乳動物雙雜交；免疫共沉淀

目前，有關(guān)乙肝病毒（HBV）感染肝細(xì)胞的具體機(jī)制尚未闡明。已有研究顯示，HBV也是首先通過其病毒吸附蛋白（virus attachment protein，VAP）與肝細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)完成其復(fù)制周期的。因此，對HBV的肝細(xì)胞受體進(jìn)行深入研究對于闡明其致病機(jī)制，以及制定有效的防治措施具有重要意義。眾多研究顯示，HBV前S1蛋白（preS1蛋白）是HBV包膜蛋白中與肝細(xì)胞膜受體直接結(jié)合的部位［1］，因此有關(guān)肝細(xì)胞膜上與該區(qū)域結(jié)合的候選受體的研究也最多。目前已知的在肝細(xì)胞膜上能與preS1蛋白結(jié)合的分子均是蛋白質(zhì)［2－3］，如IL－6、IgA、人源唾液酸糖蛋白（ASGPR）、HBV結(jié)合因子（HBVBF）、p80（protein 80）、HBV結(jié)合蛋白（HBV－BP）、LPL、NACA、GRP75、?；悄憛f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽等［4－18］。然而，由于研究方法和研究策略的差異，迄今未獲得一致的結(jié)果。因此，有必要對HBV preS1蛋白肝細(xì)胞膜受體進(jìn)行更深入的研究。前期我們應(yīng)用Sos招募系統(tǒng)（Sos recruitment system，SRS），以HBV preS1蛋白為誘餌，從人肝cDNA文庫中成功篩選到了5個(gè)可能與HBV preS1蛋白結(jié)合的已知蛋白［19］——人類鉀通道調(diào)制因子1（KCMF1）、細(xì)胞色素C（Cyt－c）、維生素D結(jié)合蛋白（VDBP）、ASGPR和人血清白蛋白（ALB）。經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)ASGPR是唯一定位于肝細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，因此認(rèn)為其作為HBV preS1蛋白肝細(xì)胞受體的可能性較大。然而由于該系統(tǒng)和傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)一樣，也是人為地將兩種蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中進(jìn)行重組，因此并不能完全反映許多相互作用發(fā)生的真實(shí)環(huán)境，從而導(dǎo)致假陰性，也會把細(xì)胞中不可能相遇的蛋白質(zhì)拉到一起導(dǎo)致假陽性。為此，本研究應(yīng)用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)及免疫共沉淀系統(tǒng)對二者的相互作用關(guān)系做了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 哺乳動物雙雜交系統(tǒng)購自Clontech公司；CAT ELISA試劑盒購自Roche公司；轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒提取試劑盒及蛋白質(zhì)體外翻譯試劑盒（TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System）為Promega公司產(chǎn)品；免疫共沉淀試劑盒（MatchmakerTMCo－IP kit）購自Clontech公司；Trizol Reagent及Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司；DMEM為Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、DMSO、胎牛血清購自Hyclone公司；氨芐青霉素、青霉素及鏈霉素購自華北制藥有限公司；大腸桿菌E.coli DH5α、HBV ayw亞型全基因序列質(zhì)粒pCP10及克隆載體pGBKT7、pGADT7均為本室保存；人肝cDNA文庫為Stratagene公司產(chǎn)品；COS－7細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫；人肝cDNA文庫為Stratagene公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及SalⅠ購自NEB公司，Taq DNA聚合酶及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；c－Myc單克隆抗體及HA多克隆抗體為Clontech公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；寡核苷酸引物由上海生工生物工程有限公司合成，DNA測序由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 哺乳動物雙雜交驗(yàn)證ASGPR與HBV preS1蛋白之間的相互作用

1.2.1 重組質(zhì)粒pM－preS1（DNA－BD）和pVP16－ASGPR（AD）的構(gòu)建 根據(jù)HBV preS1基因和ASGPR基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，HBV preS1上游引物P1：CGGAATTCATGGCGATGGGGCAGAATCTTTCCAC，下游引物P2：ACGCGTCGACGGCCTGAGGATGAGTGTTTCTC；ASGPR上游引物P1：CGGAATTCATGGCCAAGGACTTTCAAGATATCC，下游引物P2：ACGCGTCGACTCAGGCCACCTCGCCGGTG。分別以HBV ayw亞型全長質(zhì)粒pCP10和肝cDNA文庫為模板擴(kuò)增HBV preS1 和ASGPR基因。反應(yīng)體系：10×Buffer 5μL，dNTP （10mmol/L）1μL，MgCl2（25mmol/L）4μL，P1（10 μmol/L）1μL，P2（10μmol/L）1μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.6μL，模板1μL，ddH2O加至終體積50μL。反應(yīng)條件：HBV preS1基因：94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min；ASGPR基因：94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min 30s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束，分別取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。用DNA回收試劑盒回收純化HBV preS1基因和ASGPR基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，取上述回收的PCR產(chǎn)物及GAL4DNA－BD克隆載體pM，AD克隆載體pVP16各10μL，分別以限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sal I進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，將HBV preS1基因和ASGPR基因分別與pM載體和pVP16載體按克分子比3∶1比例，在T4連接酶的催化下，16℃過夜進(jìn)行體外連接重組，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α超級感受態(tài)細(xì)胞，行菌落PCR篩選出陽性克隆后，以堿裂解法小量提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶分析鑒定正確者送生物公司進(jìn)行DNA序列測定，測序結(jié)果提交GenBank比對，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。測序正確者分別命名為pM－preS1和pVP16－ASGPR。

1.2.2 提取轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒 將質(zhì)粒pG5CAT、pM53－VP16、pM－53、pVP16－T、pVP16－CP和測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pM－preS1、pVP16－ASGPR分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α超級感受態(tài)細(xì)胞；從上述轉(zhuǎn)化板上各挑取一個(gè)白色單克隆，分別接種于含氨芐青霉素的50mL LB培養(yǎng)基中，置搖床于37℃、230r/min振蕩培養(yǎng)16～21h，至A600≈2.0～4.0；將菌液分別倒入50mL離心管中，置離心機(jī)，室溫5 000g離心10min，收集細(xì)菌沉淀，用轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒，分裝于1.5mL Ep管中，測定DNA濃度，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng) 從液態(tài)罐中取出1支裝有COS－7細(xì)胞的凍存管，立即置于37℃水浴中，期間小心搖動至細(xì)胞融解，注意避免污染；用700 mL/L的乙醇擦拭消毒冷凍管；將細(xì)胞懸液加入到含4℃預(yù)冷的含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的離心管中；細(xì)胞懸液于4℃200g，離心10min；棄上清，將細(xì)胞重新懸浮在5mL含100mL/L胎牛血清的DMEM新鮮培養(yǎng)液中；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用顯微鏡觀察細(xì)胞密度及其存活率，并用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度，置50mL/L CO2孵箱中37℃培養(yǎng)36～48h；期間觀察細(xì)胞生長狀況，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液顏色變黃時(shí)，給細(xì)胞換液，即先倒掉培養(yǎng)液，用0.01 mol/L的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；顯微鏡下觀察當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90％左右時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入2.5g/L胰酶1mL，置50mL/L CO2孵箱中37℃孵育3min，顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、間隙增大后立即棄去胰酶。加入2mL含100mL/L胎牛血清、雙抗的DMEM培養(yǎng)液，中和胰酶，終止消化。吹打細(xì)胞附著面，使細(xì)胞分散均勻。吸取2mL轉(zhuǎn)入含100mL/L胎牛血清、雙抗的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，旋松瓶帽。上下左右平移培養(yǎng)瓶3次，使細(xì)胞分散均勻，置50mL/L CO2孵箱37℃培養(yǎng)。

1.2.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1d，用2.5g/L胰酶消化，PBS洗滌后加入5mL無抗生素及胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；將細(xì)胞按照8×105/皿接種于60mm培養(yǎng)皿中，置50mL/L CO2孵箱37℃培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90％～95％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；將待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒加入無血清的DMEM培養(yǎng)基中，共設(shè)6個(gè)轉(zhuǎn)染組，每組中GAL4 DNA－BD質(zhì)粒、pVP16－AD質(zhì)粒及pG5CAT質(zhì)粒的比例均為5∶5∶1，質(zhì)粒稀釋后終體積500μL，輕柔混勻；將22μL Lipofectamine 2000加入無血清的DMEM培養(yǎng)基中，終體積500μL，共準(zhǔn)備6份，輕柔混勻后置室溫孵育5min；將稀釋后的質(zhì)粒與Lipofectamine 2000按照1∶1的比例混合均勻，室溫孵育20min；用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞2次，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入4mL無血清的DMEM培養(yǎng)基；將質(zhì)粒與Lipofectamine 2000的混合物緩慢加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置37℃、50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)，4～6h后更換含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48～72h后檢測CAT基因的表達(dá)。

1.2.5 報(bào)告基因CAT表達(dá)的檢測 小心棄培養(yǎng)基，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入5mL 4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3遍；每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1mL Lysis Buffer，室溫孵育30min，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mL Ep管中，置低溫離心機(jī)，4℃、13 000r/min離心10min；吸取上清至新的1.5mL Ep管中，保存于－80℃?zhèn)溆?，參照說明書制備CAT Enzyme標(biāo)準(zhǔn)品。按順序分別加入200μL標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞蛋白提取液（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取3次測量值的平均數(shù)作為最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果），置37℃孵育1h；棄去液體，每孔加Washing Buffer 250μL洗板5次，30s/次；每孔加入200μL Anti－CAT－DIG工作液，置37℃孵育1h；棄去液體，每孔加Washing Buffer 250μL洗板5次，30s/次；每孔加入200μL Anti－DIG－POD工作液，置37℃孵育1h；棄去液體，每孔加Washing Buffer 250μL洗板5次，30s/次；每孔加入200μL POD substrate without enhancer，15～25℃孵育10～30min；酶標(biāo)儀在波長405nm處（參比波長：490nm）測定各孔吸光值。

1.3 體外免疫共沉淀驗(yàn)證ASGPR與HBV preS1蛋白之間的相互作用

1.3.1 重組質(zhì)粒pGBKT7－c－Myc－preS1和pGADT7－HA－ASGPR的構(gòu)建 preS1基因的上游引物5′端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物5′端引入SalⅠ酶切位點(diǎn)（P1：CGGAATTCATGGCGATGGGGCAGAATCTTTCCAC；P2：ACGCGTCGACGGCCTGAGGATGAGTGTTTCTC）；擴(kuò)增ASGPR基因的上游引物5′端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物5′端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)（P1：CGGAATTCATGGCCAAGGACTTTCAAGATATCC；P2：ACGCGGATCCTCAGGCCACCTCGCCGGTG），具體構(gòu)建方法與重組質(zhì)粒pM－preS1（DNA－BD）和pVP16－ASGPR （AD）的構(gòu)建方法相同，測序正確的質(zhì)粒分別命名為pGBKT7－c－Myc－preS1和pGADT7－HA－ASGPR。

1.3.2 提取質(zhì)粒 將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pGBKT7－c－Myc－preS1和pGADT7－HA－ASGPR轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α超級感受態(tài)細(xì)胞；從上述轉(zhuǎn)化板上分別挑取1個(gè)白色單克隆，接種于含氨芐青霉素的50mL LB培養(yǎng)基中，置搖床于37℃、230r/min振蕩培養(yǎng)16～21h，至A600≈2.0～4.0；用Promega公司的PureYieldTMPlasmid Midiprep System提取質(zhì)粒，操作按說明書進(jìn)行，測定DNA濃度后，分裝于1.5mL Ep管中，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HBV preS1蛋白和ASGPR的體外表達(dá)自－70℃冰箱取出蛋白質(zhì)體外翻譯試劑盒，將T7 TNT?RNA Polymerase立即置冰上，手握快速融化TNT?Rabbit Reticulocyte Lysate后立即置冰上，其他試劑置室溫（25℃）融化后置冰上；在1.5mL Ep管中按照如下順序加入反應(yīng)試劑，并用移液器小心吹打混勻后瞬時(shí)離心（TNT?Rabbit Reticulocyte Lysate 25μL，TNT?Reaction Buffer 2μL，T7TNT?RNA Polymerase 1μL，Amino Acid Mixture，Minus Methionine，1mmol/L 1μL，［35S］methionine（＞1 000Ci/mmoL at 10mCi/mL）RNasin?Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL）1μL，pGBKT7－c－Myc－preS1/pGADT7－HA－ASGPR 1μg，Nuclease－Free Water定容至50μL）；置30℃孵育90min；Western blotting驗(yàn)證體外翻譯的pGBKT7－c－Myc－preS1和pGADT7－HA－ASGPR蛋白的表達(dá)情況。

1.3.4 免疫共沉淀（Co－IP） 取上述體外翻譯的pGBKT7－c－Myc－preS1和pGADT7－HA－ASGPR蛋白各10μL，加入1個(gè)冰上預(yù)冷的1.5mL Ep管中，同時(shí)以單獨(dú)的pGBKT7－c－Myc－preS1蛋白或pGADT7－HA－ASGPR蛋白作為陰性對照；用移液器小心混合均勻，置室溫孵育1h；向其中加入10μL c－Myc單克隆抗體或HA－Tag多克隆抗體；用移液器小心混合均勻，置室溫孵育1h，同時(shí)準(zhǔn)備Protein A Beads：小心顛倒混勻Beads；吸取3μL Beads入1個(gè)1.5mL Ep管中；加入200μL PBS，7 000r/min離心30s，棄上清，重復(fù)1次；加入3μL PBS重懸Beads；加入3μL預(yù)制的Protein A Beads，置室溫旋轉(zhuǎn)混勻1h；7 000 r/min離心10s，小心棄上清；加入500μL Wash Buffer 1，顛倒混勻后7 000r/min離心10s，棄上清，重復(fù)4次；加入600μL Wash Buffer 2，顛倒混勻后7 000 r/min離心10s，棄上清；以20μL SDS－PAGE Loading Buffer重懸Beads，80℃加熱5min；分別用HA－Tag多克隆抗體或c－Myc單克隆抗體進(jìn)行Western blotting分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以珔x±s表示，采用LSD－t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV preS1及ASGPR基因片段編碼區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果 分別以HBV ayw亞型全長質(zhì)粒pCP10和肝cDNA文庫為模板，在50μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在20g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，可見擴(kuò)增片段分別約為324bp和879bp，與預(yù)期片段大小一致，且無非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象（圖1、圖2）。

圖1 HBV preS1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 AGE analysis of PCR product encoding fragment of HBV preS1gene

圖2 ASGPR基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2 AGE analysis of PCR product encoding fragment of ASGPR

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：ASGPR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：陰性對照。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 HBV preS1基因分別與質(zhì)粒載體pM和pGBKT7進(jìn)行體外連接重組，ASGPR基因分別與質(zhì)粒載體pVP16和pGADT7進(jìn)行體外連接重組，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定正確后，送生物公司進(jìn)行DNA序列測定。序列分析表明，插入片段的基因序列與HBV preS1基因（GenBank DQ315776）和ASGPR基因的序列完全一致（Gen－Bank NM080913.2），插入方向正確，融合區(qū)域的讀碼框正確，表明質(zhì)粒pM－preS1、pVP16－ASGPR、pGBKT7－c－Myc－preS1和pGADT7－HA－ASGPR構(gòu)建成功。

2.3 CAT報(bào)告基因的檢測結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)CAT ELISA試劑盒提供的CAT enzyme標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)倍比稀釋后，用酶標(biāo)儀在波長405nm處檢測其吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得曲線的線性相關(guān)性為0.993 6，并且所有位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1％。酶標(biāo)儀可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將待測樣本實(shí)測A值自動轉(zhuǎn)換為待測樣本的濃度（圖3）。

圖3 ELISA法檢測CAT報(bào)告基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3The standard curve of CAT activity by ELISA

2.3.2 CAT enzyme表達(dá)水平的檢測結(jié)果 ELISA檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的CAT enzyme表達(dá)水平明顯升高［（108.19±0.83）pg/mL vs.（28.37±0.72）pg/mL，P＜0.000 1］；而兩個(gè)自激活檢測組的CAT enzyme表達(dá)水平與陰性對照組相比，無明顯差異［preS1control：（25.51±1.19）pg/mL vs.（28.37±0.72）pg/mL，P＝0.109；ASGPR control：（24.32±1.87）pg/mL vs.（28.37±0.72）pg/mL，P＝0.586，圖4］。

2.4 體外免疫共沉淀鑒定HBV preS1蛋白和ASGPR的相互作用 體外翻譯的pGBKT7－c－Myc－preS1蛋白和pGADT7－HA－ASGPR蛋白，分別用c－Myc單克隆抗體及HA－Tag多克隆抗體行Western blotting分析，結(jié)果顯示二者均成功表達(dá)。對pGBKT7－c－Myc－preS1蛋白和pGADT7－HA－ASGPR蛋白進(jìn)行Co－IP和Western blotting檢測，c－Myc－preS1蛋白可被anti－HA多克隆抗體共沉淀下來，同時(shí)HAASGPR蛋白也可被anti－c－Myc單克隆抗體共沉淀下來。結(jié)果提示，HBV preS1蛋白和ASGPR蛋白之間存在直接而特異的體外相互作用。

圖4 不同轉(zhuǎn)染組CAT報(bào)告基因表達(dá)水平的比較Fig.4Comparison of CAT activities in different cotransfection groups

3 討論

HBV感染人體后可引起急、慢性乙型肝炎，并與肝硬化、肝癌關(guān)系密切。目前，HBV生命周期中的多個(gè)環(huán)節(jié)都已經(jīng)闡明，但是有關(guān)HBV持續(xù)感染和致病的分子機(jī)制尤其是入侵機(jī)制仍不十分清楚，致使對慢性乙型肝炎仍缺乏有效的控制手段和徹底的解決方案。因此，深入研究HBV的嗜肝機(jī)制，特別是病毒包膜蛋白與肝細(xì)胞膜相關(guān)蛋白之間的相互作用，對于研發(fā)新型抗病毒藥物和疫苗，進(jìn)而更加有效地防治乙型病毒性肝炎至關(guān)重要。

ASGPR是一種在哺乳動物肝細(xì)胞表面高表達(dá)的跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量約41ku，由H1和H2兩個(gè)結(jié)構(gòu)不同的亞基組成，H1是受體的主要組成部分。其胞外結(jié)構(gòu)域含有糖識別結(jié)構(gòu)域，能識別和結(jié)合半乳糖殘基和N－乙酰半乳糖胺殘基。當(dāng)糖識別結(jié)構(gòu)域與特異的糖殘基結(jié)合后，即發(fā)生受體介導(dǎo)的胞吞作用，可將其配體運(yùn)送至溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解。其主要生理功能是負(fù)責(zé)清除去唾液酸糖蛋白、凋亡細(xì)胞和脂蛋白等。而HBV也更傾向于從肝竇狀隙的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面入侵肝細(xì)胞。已有一些研究結(jié)果顯示，ASGPR與HBV顆粒具有較高的親和力，并且二者相互作用的部位就在HBV preS1區(qū)。我們前期的研究結(jié)果顯示，HBV preS1蛋白與ASGPR在酵母細(xì)胞中存在相互作用，是對以往研究結(jié)果的有力支持，但是鑒于酵母雙雜交系統(tǒng)假陽性率較高的問題，還需要通過操作性強(qiáng)、可信度高、接近生理?xiàng)l件的技術(shù)方法做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖5 體外免疫共沉淀檢測HBV preS1蛋白與ASGPR之間的相互作用Fig.5HBV preS1－ASGPR interaction detected in vitro by Co－IP analysis

哺乳動物雙雜交技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)是目前用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，前者的優(yōu)勢在于由于是在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行的，因此更接近于體內(nèi)環(huán)境，能更好地模仿體內(nèi)的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用。此外，它還能排除細(xì)胞內(nèi)其他蛋白成分的干擾，測定蛋白間的直接的相互作用。后者則是首先利用體外翻譯系統(tǒng)使待研究的蛋白質(zhì)獲得表達(dá)，進(jìn)而在體外非細(xì)胞環(huán)境中研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，避免了大量的細(xì)胞培養(yǎng)以及細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜體系的干擾，可以比較直接地檢驗(yàn)蛋白質(zhì)分子之間存在的物理相互作用。本研究綜合應(yīng)用這兩種方法對HBV preS1蛋白與ASGPR之間的相互作用進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV preS1蛋白與ASGPR在哺乳動物細(xì)胞中及體外均存在相互作用，說明二者在細(xì)胞環(huán)境和非細(xì)胞環(huán)境中均存在直接而特異的相互作用，印證了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，為進(jìn)一步闡明ASGPR在HBV入侵肝細(xì)胞過程中的作用提供了理論依據(jù)。在下一步的研究中，我們將綜合利用多種分子生物學(xué)技術(shù)深入研究ASGPR與HBV preS1蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)、特性及親和力、ASGPR對HBV易感性、細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒分布及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為研究二者相互作用的生物學(xué)意義及功能提供有力依據(jù)，為闡明HBV持續(xù)感染和致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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（編輯 卓選鵬）（編輯 國 榮）

Verification of the interaction between ASGPR and HBV preS1protein

ZHANG Xi，LIU Xiao－jing，CHEN Yun－ru，KONG Ying，YANG Xue－liang，YE Feng，LIN Shu－mei
（Department of Infectious Diseases，the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To verify the interaction between asialoglycoprotein receptor（ASGPR）and hepatitis B virus（HBV）preS1 protein in vivo and in vitro，and identify ASGPR as a cell－surface receptor for HBV，which could elucidate the molecular mechanism of HBV infection.Methods The preS1－ASGPR interaction was examined in mammalian two－h(huán)ybrid and coimmunoprecipitation system by strictly following the manufacturer’s instructions.Results ASGPR interacted specifically and directly with the preS1 domain of HBVinvivoand in vitro.Conclusion ASGPR may be a candidate receptor for HBV that mediates further step of HBV entry.

hepatitis B virus（HBV）；preS1 protein；asialoglycoprotein receptor（ASGPR）；protein－protein interaction；mammalian two－h(huán)ybrid assay；coimmunoprecipitation

R512.6

A

10.7652/jdyxb201602030

2015－01－25

2015－11－17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30571649）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.30571649）

藺淑梅.E－mail：linshumei123@126.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1639.022.html（2016－02－02）

◇經(jīng)驗(yàn)交流◇