白花蛇舌草總黃酮對(duì)TGF－β1誘導(dǎo)的肝癌MHCC97－H細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

張彥兵，朱 嬌，肖菊香，郭亞煥，廖子君，徐 瑞

（西安交通大學(xué)：1.附屬陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061；2.第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061）

白花蛇舌草總黃酮對(duì)TGF－β1誘導(dǎo)的肝癌MHCC97－H細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

張彥兵1，朱 嬌2，肖菊香2，郭亞煥1，廖子君1，徐 瑞1

（西安交通大學(xué)：1.附屬陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061；2.第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061）

目的 探討白花蛇舌草總黃酮（FOD）對(duì)TGF－β1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞MHCC97－H上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的逆轉(zhuǎn)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法 用TGF－β1誘導(dǎo)MHCC97－H細(xì)胞建立EMT模型，再將其分為5組：正常對(duì)照組、TGF－β1組、TGF－β1＋FOD組、TGF－β1＋5－FU組及TGF－β1＋FOD＋5－FU組，分別干預(yù)48h，Transwell侵襲小室法檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力，Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中E－cadherin、vimentin蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與正常細(xì)胞形態(tài)相比，TGF－β1誘導(dǎo)后細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的長(zhǎng)梭形，且侵襲能力增強(qiáng)（P＝0.02）；給予藥物處理后，TGF－β1＋FOD組、TGF－β1＋5－FU組細(xì)胞的穿透能力較TGF－β1組減弱（P＝0.03、P＝0.02），且聯(lián)合用藥組減弱程度更加明顯（P＝0.01）；Western blot結(jié)果顯示，TGF－β1組細(xì)胞中E－cadherin蛋白表達(dá)顯著降低（P＝0.01），vimentin蛋白的表達(dá)顯著增加（P＝0.01），TGF－β1＋FOD組、TGF－β1＋5－FU組E－cadherin蛋白表達(dá)有所上調(diào)（P＝0.03、P＝0.02），vimentin蛋白的表達(dá)有所下調(diào)（P＝0.04、P＝0.03），且聯(lián)合組變化更為顯著（P＝0.01）。結(jié)論 FOD能夠逆轉(zhuǎn)TGF－β1誘導(dǎo)的肝癌MHCC97－H細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與其抑制TGF－β1誘導(dǎo)的E－cadherin蛋白下調(diào)及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。

MHCC97－H細(xì)胞；TGF－β1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；白花蛇舌草總黃酮；侵襲；E－cadherin；vimentin

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的3大主要惡性腫瘤之一［1－2］，其侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。探索肝癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，并尋找相應(yīng)的治療措施，一直是腫瘤學(xué)術(shù)界研究的重要問(wèn)題。目前，細(xì)胞上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）與肝癌侵襲及轉(zhuǎn)移的研究正在受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。白花蛇舌草（oldenlandia diffusa willd）系茜科耳草屬植物，具有抗炎、抗菌、增強(qiáng)免疫力等作用［3－4］。白花蛇舌草總黃酮（total flavones of oldenlendia diffusa willd，F(xiàn)OD）為白花蛇舌草中提取的有效成分，不但具有抗炎、抗菌作用，而且已經(jīng)被證實(shí)對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，尤其是消化道腫瘤。然而，F(xiàn)OD是不是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的EMT發(fā)揮抗腫瘤作用，目前還沒(méi)有這方面的報(bào)道。因而本文主要探討FOD對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）誘導(dǎo)的MHCC97－H肝癌細(xì)胞EMT模型的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 白花蛇舌草購(gòu)自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院（江西產(chǎn)地），并經(jīng)提取、分離得到FOD（采用溶劑提取法，提取、純化總黃酮，硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測(cè)得總黃酮的純度為59.19％）；人肝癌MHCC97－H細(xì)胞（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心饋贈(zèng)）；培養(yǎng)液DMEM（HyClone，美國(guó)）；胎牛血清（HyClone，美國(guó)）；胰蛋白酶（碧云天公司）；Transwell小室（Millipore公司）；TGF－β1購(gòu)自Peprotech公司；E－cadherin、vimentin抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。鼠抗人β－actin單克隆抗體，標(biāo)記山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)SAB公司。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（BMG，德國(guó)），熒光倒置顯微鏡（Motic，澳門(mén)）。Western blot電泳儀購(gòu)自北京君意公司。全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio－Rad，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 肝癌MHCC97－H細(xì)胞EMT模型的建立取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)消化離心，用100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮并計(jì)數(shù)，取20× 105個(gè)細(xì)胞的懸浮液，接種于1個(gè)培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，置37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，融合達(dá)30％～40％后，棄掉原培養(yǎng)液，加入5μg/mL的無(wú)血清TGF－β1培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37℃培養(yǎng)箱，并以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照。倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)24、48、72h后細(xì)胞形態(tài)的改變。

1.3.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) MTT法檢測(cè)FOD、5－FU對(duì)MHCC97－H細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示這兩種藥對(duì)細(xì)胞的抑制作用均存在時(shí)間與劑量依賴性，得出實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度為FOD：200μg/mL、5－FU：10μg/mL。然后將實(shí)驗(yàn)分為5組（Control組、TGF－β1組、TGF－β1＋FOD組、TGF－β1＋5－FU組及TGF－β1＋FOD＋5－FU組），首先用無(wú)血清DMEM配制各組終濃度的藥物，TGF－β1誘導(dǎo)48h的細(xì)胞用無(wú)血清的對(duì)應(yīng)組藥物制成細(xì)胞懸液；分別取2×104個(gè)細(xì)胞種于Tran swell小室中，下室加入600μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，置37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后取出Transwell小室，吸棄小室內(nèi)液體，用棉簽擦凈上室細(xì)胞，PBS漂洗后40g/L多聚甲醛固定20min；5g/L結(jié)晶紫染色15min，PBS漂洗3次，倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并拍照。

1.3.3 Western blot檢測(cè) 采用5μg/mL的TGF－β1作用于MHCC97－H細(xì)胞，顯微鏡下觀察，48h后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變；用一定濃度的全血清培養(yǎng)基、FOD、5－FU及FOD＋5－FU繼續(xù)作用于EMT模型48h，同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照組（正常MHCC97－H細(xì)胞）；然后分別提取誘導(dǎo)前后及干預(yù)前后細(xì)胞的總蛋白，與5×加樣緩沖液混勻，煮沸5min。取10μg蛋白，用SDS－PAGE分離電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用現(xiàn)配的脫脂牛奶室溫封閉2h后，加入E－鈣黏蛋白（E－cadherin 1∶1 000）、波形蛋白（Vimentin 1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。1×PBST洗膜4次，10min/次，再加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶8 000），室溫反應(yīng)2h；1×PBST洗膜3次，PBS洗膜1次，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（珔x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF－β1誘導(dǎo)前后MHCC97－H細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及E－cadherin、vimentin蛋白的表達(dá) 與誘導(dǎo)前比較，經(jīng)TGF－β1誘導(dǎo)48h后，上皮來(lái)源的MHCC97－H細(xì)胞由多邊形向成纖維樣細(xì)胞形態(tài)改變，由鋪路石樣向紡錘絲樣改變。Western blot檢測(cè)E－cadherin和 vimentin蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，經(jīng)TGF－β1誘導(dǎo)48h后，E－cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＝0.01），vimentin蛋白分子的表達(dá)明顯上調(diào)（P＝0.01，圖1）。

圖1 TGF－β1誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)的變化（×40）及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig.1Morphological changes（×40）and the protein expression of MHCC97－H cells before and after TGF－β1treatment

2.2 FOD對(duì)MHCC97－H細(xì)胞EMT模型侵襲能力的影響 EMT模型成功建立后，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Control組、TGF－β1組、TGF－β1＋FOD組、TGF－β1＋5－FU組及TGF－β1＋FOD＋5－FU組的侵襲能力。結(jié)果顯示，TGF－β1組穿透Transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（P＝0.02），藥物干預(yù)后穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)又顯著減少（PFOD組＝0.03、P5－FU組＝0.02、P聯(lián)合組＝0.01，圖2）。說(shuō)明FOD、5－FU處理MHCC97－H細(xì)胞EMT模型后細(xì)胞的侵襲能力減弱，而聯(lián)合作用時(shí)效果更為明顯。

圖2 不同藥物對(duì)MHCC97－H細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.2Effects of different treatments on the invasive ability of MHCC97－H cell（40×）

2.3 Western blot檢測(cè)E－cadherin、vimentin蛋白的表達(dá) E－cadherin是典型的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，而vimentin則是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。Western blot檢測(cè)E－cadherin和vimentin蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示（圖3），經(jīng)TGF－β1誘導(dǎo)48h后，與正常MHCC97－H細(xì)胞相比，E－cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯受抑制（P＝0.01）；TGF－β1＋FOD組、TGF－β1＋5－FU組和TGF－β1組相比，E－cadherin蛋白的表達(dá)水平又明顯回升（P＝0.03、P＝0.02），而TGF－β1＋FOD＋5－FU組E－cadherin蛋白的表達(dá)水平上調(diào)更為顯著（P＝0.01）。

同時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，TGF－β1誘導(dǎo)EMT組細(xì)胞vimentin蛋白的表達(dá)水平明顯上升（P＝0.01）；TGF－β1＋FOD組、TGF－β1＋5－FU組和TGF－β1誘導(dǎo)EMT組相比，vimentin蛋白表達(dá)水平又明顯回降（P＝0.04、P＝0.03），而TGF－β1＋FOD＋5－FU組vimentin蛋白的表達(dá)水平抑制較單藥干預(yù)組更為明顯（P＝0.01）。

圖3 不同組別中E－cadherin、vimentin蛋白的表達(dá)變化Fig.3The protein expressions of E－cadherin and vimentin in different groups

3 討論

EMT是指上皮細(xì)胞與周圍間質(zhì)的相互作用過(guò)程中，逐漸獲得了某些間質(zhì)細(xì)胞特有的性狀，其主要特征是上皮細(xì)胞極性的喪失，間質(zhì)特性的獲得，最終導(dǎo)致細(xì)胞活性和侵襲性增強(qiáng)［5－6］。因EMT轉(zhuǎn)化的許多特點(diǎn)和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移極其相似，目前成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)［7］。

EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，EMT的發(fā)生可受環(huán)境刺激或胞外基質(zhì)因子調(diào)節(jié)。TGF－β1是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的TGF－β超家族的一員。在一些腫瘤模型中，如乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌，TGF－β1可誘導(dǎo)EMT發(fā)生，降低腫瘤細(xì)胞間的黏附并能增強(qiáng)侵襲力。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)TGF－β1的誘導(dǎo)成功建立了肝癌MHCC97－H細(xì)胞EMT模型。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TGF－β1誘導(dǎo)48h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，可見(jiàn)MHCC97－H發(fā)生EMT的形態(tài)改變。原本在正常培養(yǎng)條件下呈多角形“鋪路石樣”的細(xì)胞外形向長(zhǎng)梭形“間質(zhì)細(xì)胞樣”轉(zhuǎn)變，細(xì)胞間連接喪失，散在分布。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示TGF－β1可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化。

而這種形態(tài)變化可能與上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E－cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白vimentin表達(dá)增加有關(guān)。E－cadherin表達(dá)下調(diào)可以啟動(dòng)細(xì)胞的EMT［8－9］，vimentin的表達(dá)增加也與EMT呈正比［10］，E－cadherin向vimentin轉(zhuǎn)化可以代表腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGF－β1誘導(dǎo)后MHCC97－H肝癌細(xì)胞發(fā)生丟失E－cadherin并獲得vimentin現(xiàn)象，表示細(xì)胞失去上皮表型，開(kāi)始間質(zhì)化，且增殖能力和遷移能力都增強(qiáng)。

FOD是從白花蛇舌草中提取的有效成分，具有抗炎和抗菌作用［11］，是白花蛇舌草最主要的生物活性成分，因其對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，被視為具有極大開(kāi)發(fā)前景的惡性腫瘤預(yù)防及治療藥物。

我們觀察到TGF－β1誘導(dǎo)使肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的形態(tài)變化，并通過(guò)EMT標(biāo)志性蛋白分子進(jìn)一步證明了EMT的發(fā)生。在加入FOD、5－FU干預(yù)后，侵襲能力明顯降低，同時(shí)檢測(cè)到標(biāo)志性蛋白分子變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞E－cadherin蛋白表達(dá)相對(duì)于EMT模型明顯上調(diào)，vimentin蛋白表達(dá)則明顯下調(diào)。該結(jié)果提示，F(xiàn)OD的抗腫瘤作用的機(jī)制可能就是通過(guò)逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。

總之，本研究結(jié)論提示FOD可以抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力，此抑制作用是通過(guò)逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞EMT的改變而發(fā)揮作用的。為FOD可能作為EMT抑制劑提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Effect and mechanism of total flavones of oldenlendia diffusa willd on epithelial－mesenchymal transition of cell line MHCC97－H induced by TGF－β1

ZHANG Yan－bing1，ZHU Jiao2，XIAO Ju－xiang2，GUO Ya－h(huán)uan1，LIAO Zi－jun1，XU Rui1
（1.Department of Oncology，Affiliated Shaanxi Provincial Tumor Hospital；2.Department of Oncology，the First Affiliated Hospital，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To investigate the effects of total flavones of oldenlandia diffusa（FOD）on epithelialmesenchymal transition in hepatocellular cancer cell line MHCC97－H.Methods TGF－β1induced EMT in routinely cultured liver cancer cell line MHCC97－H；then MHCC97－H cell was divided into 5 groups：normal control group，TGF－β1 group，TGF－β1＋FOD group，TGF－β1＋5－FU group，and TGF－β1＋FOD＋5－FU group.After 48 h of treatment，the invasion ability of MHCC97－H cell was detected by Transwell；the proteins of E－cadherin and vimentin were determined by Western blot.Results Compared with the normal form of MHCC97－H cell line，the cell had obvious long fusiform after TGF－β1 induction，and the invasion ability enhanced（P＝0.02）.But after treatment，the invasion ability of MHCC97－H cell decreased in FOD group and 5－FU group compared with that in TGF－β1 group（P＝0.03，P＝0.02），and decreased more significantly in FOD＋5－FU group（P＝0.01）.The expression of E－cadherin at the protein level decreased significantly（P＝0.01）in TGF－β1 group，which was abolished in FOD group（P＝0.03）and 5－FU group（P＝0.02）.The expression of vimentin at the protein level increased significantly（P＝0.01）in TGF－β1 group，which was abolished in FOD group（P＝0.04）and 5－FU group （P＝0.03）and more obviously in FOD＋5－FU group（P＝0.01）.ConclusionFOD can reverse the invasion of MHCC97－H cells in EMT induced by TGF－β1 through decreasing the expression of E－cadherin protein and inhibiting the epithelial－mesenchymal transition of MHCC97－H cell.

MHCC97－H cell；transforming growth factor－β1（TGF－β1）；epithelial－mesenchymal transition；total flavones of oldenlandia diffusa willd；invasion；E－cadherin；vimentin

R735.7

A

10.7652/jdyxb201602027

2015－03－23

2015－04－23

陜西省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013K12－07－12）Supported by Social Development Research Plan of Shaanxi Province（No.2013K12－07－12）

肖菊香.E－mail：1983181726@qq.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1526.016.html（2016－02－02）