染色體短期培養(yǎng)法的改良及在白血病患者染色體核型分析中的應(yīng)用

張鵬宇，張龍進，羅 靜，陳社平，蒙欣，田 瑋，張王剛，周伏玲

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西西安 710004）

染色體短期培養(yǎng)法的改良及在白血病患者染色體核型分析中的應(yīng)用

張鵬宇，張龍進，羅 靜，陳社平，蒙欣，田 瑋，張王剛，周伏玲

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西西安 710004）

目的 改良骨髓染色體短期培養(yǎng)法并對130例白血病患者進行染色體核型分析。方法 通過單因子梯度實驗，對影響骨髓染色體短期培養(yǎng)法的秋水仙素濃度、作用時間、低滲時間等主要因素進行優(yōu)化，并在改良基礎(chǔ)上，進行了3因素3水平正交實驗優(yōu)化骨髓染色體制備體系，進一步對我院130例白血病患者進行了染色體核型分析。結(jié)果 秋水仙素濃度、秋水仙素作用時間、低滲時間等因素都有適宜的范圍，過高或過低都會影響染色體制備成功率，正交實驗結(jié)果表明骨髓染色體制備的最適體系為秋水仙素質(zhì)量濃度0.07μg/mL，作用時間80min，低滲時間35min。通過改良的染色體短期培養(yǎng)法對130例白血病患者進行了染色體核型分析，染色體制備成功率達到了97.69％，異常核型檢出率為82.3％。結(jié)論 0.07μg/mL秋水仙素作用80min，低滲時間35min的改良骨髓染色體制備體系值得臨床推廣。

正交設(shè)計；骨髓；染色體核型；染色體制備方法；白血??；染色體短期培養(yǎng)；秋水仙素

染色體核型分析對血液系統(tǒng)疾病的輔助診斷、治療、預(yù)后判斷及發(fā)病機制的探討具有不可替代的重要意義，是對傳統(tǒng)的血液和骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢查的重要補充［1－2］。然而，白血病骨髓染色體的成功制備是血液病細胞遺傳學(xué)研究中的一個難題，因染色體標本制備步驟眾多，易受多種因素的影響，因此，穩(wěn)定獲得形態(tài)良好、長度適宜、分散較好以及足量的中期分裂相染色體是我院血液科染色體室面臨的重大挑戰(zhàn)［3－4］。我們通過研究多因素多水平的正交實驗設(shè)計方法改進了傳統(tǒng)染色體制備過程，提高了染色體制備成功率，建立了適合我院染色體室白血病骨髓染色體的制備方法，并對130例白血病患者進行了染色體核型分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小牛血清購自杭州四季青公司，谷氨酰胺、秋水仙素及Giemsa染液均購自Sigma公司，RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.2 研究對象 選取2014年1月～10月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科門診及住院患者130例，男性患者79例，女性患者51例，年齡13～83歲，中位年齡為48歲。病例均經(jīng)結(jié)合臨床及MICM分析（M：骨髓細胞形態(tài)學(xué)；I：細胞免疫學(xué)；C：細胞遺傳學(xué)；M：分子生物學(xué)），并根據(jù)張之南等［5］主編的《血液病診斷及療效標準》進行診斷，初診標本慢性粒細胞白血?。–ML）53例，復(fù)查CML 4例，CML骨髓移植術(shù)后1例，急性非淋巴細胞白血病（AML）55例，AML骨髓移植術(shù)后1例，急性淋巴細胞白血?。ˋLL）14例，慢性淋巴細胞白血?。–LL）2例。

1.3 骨髓標本采集 分別抽取骨髓液3mL，收集于肝素鈉抗凝管。

1.4 單因素實驗 選取21例初診白血病患者，其中CML 15例，AML 4例，ALL 2例。每例患者根據(jù)傳統(tǒng)染色體制備方法，經(jīng)有核細胞計數(shù)，按2×106/mL細胞密度接種到5mL RPMl 1640培養(yǎng)基中，接種6瓶，培養(yǎng)過夜。設(shè)立秋水仙素梯度質(zhì)量濃度依次為0.04、0.07、0.10、0.13、0.16、0.19μg/mL，按照數(shù)字1～6號標記好，保持秋水仙素作用時間為70min及低滲時間為25min不變，經(jīng)過3次固定、R顯帶后鏡下進行染色體分裂相數(shù)量統(tǒng)計。

同樣，保持秋水仙素質(zhì)量濃度0.07μg/mL、低滲時間為25min不變，設(shè)立秋水仙素作用時間梯度（10、30、50、70、90、110min）；保持秋水仙素質(zhì)量濃度0.07μg/mL、秋水仙素作用時間為70min不變，設(shè)立低滲時間梯度（5、25、45、65、85、105min），經(jīng)過3次固定、R顯帶后鏡下進行染色體分裂相數(shù)量統(tǒng)計。

1.5 正交設(shè)計實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取1例初發(fā)的CML患者的骨髓標本，進行正交實驗。在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計三因素三水平的正交實驗表，進行9次不同組合的實驗，實驗重復(fù)3次，選取染色體制備成功率高的組合作為染色體短期培養(yǎng)法的優(yōu)化體系。

1.6 染色體核型分析與評價標準 按《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN 1995）》進行描述。至少2個細胞有同樣的染色體增加或結(jié)構(gòu)重排，或者3個細胞有同樣的染色體丟失，方可確認為一個異?？寺?。染色體制備成功率換算公式為：染色體制備成功率＝可供分析分裂相數(shù)量/分裂相總數(shù)，制備成功率越高，則說明制備染色體的條件越好［3］。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。單因素實驗結(jié)果進行χ2檢驗，正交實驗結(jié)果應(yīng)用極差分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單因素實驗結(jié)果 單因素實驗結(jié)果如表1所示。6組秋水仙素不同濃度組中，0.07μg/mL（第2組）組的染色體制備成功率最高為77.50％；與0.19 μg/mL（第6組）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5.04，P＜0.05）；但與0.04、0.1、0.13、0.16μg/mL（第1、3、4、5組）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；這表明秋水仙素作用的質(zhì)量濃度不宜超過0.16μg/mL。

秋水仙素作用不同時間的實驗中，70min時（第4組）染色體制備成功率最高為72.09％，與第1組（10min）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5.03，P＜0.05；但與30、50、90、110min（第2、3、5、6組）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；這表明秋水仙素的作用時間最少應(yīng)大于10min。

不同低滲時間的實驗中，45min（第3組）時染色體制備成功率最高為76.84％；與5min（第1組）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝8.34，P＜0.01）；與85 min（第5組）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5.65，P＜0.05）；但與第2、4組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這表明低滲時間對染色體的制備成功率影響明顯，其時間應(yīng)控制在25～60min之間。

表1 染色體制備單因素實驗結(jié)果Tab.1 Result of single factor experiment for chromosome preparation

2.2 正交設(shè)計實驗結(jié)果 根據(jù)單因素的實驗結(jié)果即獲得較高染色體制備成功率的秋水仙素質(zhì)量濃度不宜超過0.16μg/mL、作用時間應(yīng)大于10min、低滲時間應(yīng)控制在25～60min。故分別以3因素的最佳水平為中心向下及向上各擴大一個水平進行正交實驗的設(shè)計，具體設(shè)計方案見表2。3次重復(fù)實驗的平均成功率的正交設(shè)計實驗結(jié)果（表3）顯示，通過正交極差分析表明處理組合6的染色體制備成功率最高，為最佳水平組合。因此，選取組合6作為染色體短期培養(yǎng)法的最優(yōu)條件，即秋水仙素濃度0.07μg/mL、作用時間80min、低滲時間35min。

表2 正交設(shè)計的因素與水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal design

表3 正交實驗設(shè)計L9（33）Tab.3 Orthogonal design L9（33）of the amplification system

2.3 白血病病例分析 利用前期實驗獲得的改良的染色體短期培養(yǎng)法（秋水仙素質(zhì)量濃度0.07μg/mL、作用時間80min、低滲時間35min），將本組130例骨髓標本實驗培養(yǎng)并分析，結(jié)果制備失敗了3例，成功了127例，染色體制備成功率為97.69％（表4）。124例初診標本中，104例檢出異常核型，其中53例CML標本中51例發(fā)現(xiàn)異常，異常檢出率96.2％；55 例AML標本44例發(fā)現(xiàn)異常，異常檢出率80.0％；14 例ALL標本9例發(fā)現(xiàn)異常，異常檢出率64.3％；2例CLL均未見明顯異常。復(fù)診標本中4例CML標本3例發(fā)現(xiàn)異常，2例骨髓移植后的標本未見明顯異常。

我院血液實驗室目前發(fā)現(xiàn)白血病染色體核型異常類型主要有25種，t（9；22）、t（8；21）、t（15；17）和inv（16）是最常見類型，占所有異?？倲?shù)的69.2％；＋8、＋ph是較為常見的繼發(fā)性改變，而其余t（1；9；22）、t（1；5）、t（1；19）、t（2；14）、t（3；11）、＋4、t（4；11）、t（5；9）、t（7；11）、del（9q）、del（12q）、dic（13；14）、del（14q）、＋19、add（19q）、del（19q）、＋22、多倍體異常和復(fù)雜異常等19種異常都是較為少見的異常，僅占所有異?？倲?shù)的30.8％。

表4 130例白血病患者染色體核型分析結(jié)果Tab.4 Result of chromosome karyotype analysis of 130leukemia patients

3 討論

骨髓染色體的制備方法主要有直接法、短期培養(yǎng)法和同步化法［6］，其各有優(yōu)缺點。然而，目前國內(nèi)外學(xué)者認為短期培養(yǎng)法能很好揭示更多的染色體異常［3］，并且能夠符合臨床上需要快速、簡潔和穩(wěn)定的要求，因此大多數(shù)醫(yī)院都采用短期培養(yǎng)法進行染色體檢查。3種染色體制備方法均包括細胞收獲、低滲、固定、制片和染色等步驟。在細胞收獲過程中，秋水仙素濃度與作用時間一直都是爭論的焦點：秋水仙素能阻留中期分裂象，同時也會使染色體濃縮；若終濃度過高或處理時間過長，分裂象雖然有所增加，但染色體長度卻反而縮短，以致帶紋減少。故在制備過程中，各實驗室應(yīng)根據(jù)自身實驗條件找出適合的秋水仙素濃度及作用時間，以達到最佳的制備效果。應(yīng)用低滲液處理細胞，可使染色體分散；低滲時間過長，會導(dǎo)致染色體丟失，使染色體過分腫脹，造成形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊影響顯帶；低滲時間過短，則會導(dǎo)致染色體分散不佳。而固定、制片和染色過程的影響因素相對較小，實驗條件易于控制。因此，該研究采用了單因子梯度實驗和正交設(shè)計實驗，研究了短期培養(yǎng)法中秋水仙素濃度、秋水仙素作用時間及低滲時間。

該實驗發(fā)現(xiàn)在單因子梯度實驗中，其他條件不變，隨著秋水仙素濃度和低滲時間的增大，染色體制備成功率從逐漸變高到逐漸變低，表明秋水仙素濃度和低滲時間過低或過高都會影響染色體制備成功率，而隨著秋水仙素作用時間的延長，染色體制備成功率高低起伏不定。宋蘭林等［3］同時應(yīng)用直接法、即刻低滲法、短期培養(yǎng)法和同步化4種方法對48例白血病患者制備其骨髓染色體，其染色體制備成功率為93.75％；其中單獨應(yīng)用短期培養(yǎng)法的染色體制備成功率為89.58％。本研究從單因子梯度實驗中選取染色體制備成功率最高的條件進行正交實驗設(shè)計，通過直觀分析和正交極差分析，本研究認為短期培養(yǎng)法的最適體系為秋水仙素濃度0.07μg/mL，秋水仙素作用時間80min，低滲時間35min。并通過選擇的最優(yōu)體系，分析了130例白血病標本，其僅有3例標本制備失敗，成功率達到了97.69％，且124例初診白血病標本104例檢出異常核型，異常檢出率高，進一步證明了改良后的染色體短期培養(yǎng)法能夠提高染色體制備成功率。當然，不同地區(qū)實驗室間在制備染色體的方法學(xué)上較難保持一致，而不同細胞類型的染色體對相關(guān)變量依賴程度也存在差異，在具體實施過程中，染色體標本制備過程必須結(jié)合本實驗室的自身條件，定期進行染色體室內(nèi)質(zhì)控，才能夠長期有效保持染色體標本制備質(zhì)量的穩(wěn)定性［7－9］。

白血病是一類發(fā)生在骨髓中的造血干細胞異常的克隆性惡性疾病，其中大多數(shù)患者伴隨著染色體改變，而由染色體改變引起的融合基因、原癌基因的點突變、癌基因的擴增以及抑癌基因的失活與白血病發(fā)病息息相關(guān)。因此，由最初的FAB分型發(fā)展為MICM分型，最能反映白血病疾病的本質(zhì)［10－11］。白血病染色體核型異常的類型主要有數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常［12］，其異常有助于白血病的診斷和鑒別診斷。對于收集的130份白血病染色體核型類型中，與FAB亞型相關(guān)的特異性染色體異常主要有t（9；22）、t（8；21）、t （15；17）和inv（16），主要存在于CML、M2、M3和M4中；值得注意的是t（9；22）也可見于ALL、ANLL及個別的MDS、真性紅細胞增多癥、骨髓纖維化、淋巴瘤等疾病中；7％的M4及個別的M1也會出現(xiàn)t （8；21），因此對疾病的診斷仍需結(jié)合臨床癥狀。t（4；11）常見于2％～6％的ALL中。自1979年VAN DEN BERGHE首次報道t（4；11）急淋以來，迄今文獻報道了不到600例，而研究表明其具有獨特的臨床、血液學(xué)和預(yù)后特點，因而構(gòu)成一種獨特的臨床、細胞遺傳學(xué)亞型［13－14］。在本研究的14份ALL中，發(fā)現(xiàn)了2 例t（4；11），其臨床資料有待整理。染色體改變是影響白血病預(yù)后的獨立因素［15］。根據(jù)染色體異常將白血病的預(yù)后危險程度分為：高危即－5、－7、5q－、3q－異常、亞二倍體、近單倍體、t（9；22）、t（4；11）、t（1；19）、t （8；14），復(fù)合染色體異常；中危即染色體正常、＋8、＋21、＋22、47－50的超二倍體以及低危即（t（8；21）、t （15；17）、inv（16）、t（12；21）、染色體數(shù)目＞50的超二倍體［16］。而本實驗發(fā)現(xiàn)的白血病染色體核型異常類型主要有25種，利于預(yù)后危險程度劃分，在白血病診斷、治療及預(yù)后判斷中具有重要的臨床意義。

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（編輯 國 榮）

Application of improved chromosome short－term culture method in the chromosome karyotype analysis of leukemia patients

ZHANG Peng－yu，ZHANG Long－jin，LUO Jing，CHEN She－ping，MENG Xin，TIAN Wei，ZHANG Wang－gang，ZHOU Fu－ling
（Department of Hematology，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China）

Objective To make the chromosome karyotype analysis of 130 patients with leukemia by using the improved chromosome short－term culture method.Methods We optimized the main factors with a single factor gradient experiment in short－term culture of bone marrow chromosome，including colchicines concentration，duration of action of colchicines，and hypotonic time.On this basis，we conducted the three－factors and three－level orthogonal experiment to achieve improved bone marrow chromosome preparation system，which was later applied in 130 patients with leukemia in our hospital.Results The orthogonal experiment results showed that the optimum conditions were colchicines concentration of 0.07μg/mL，colchicines action time of 80 min，and hypotonic time of 35 min during the preparation of the bone marrow chromosome.Using this method，the chromosome preparation success rate reached 97.69％and the detection rate of abnormal karyotype reached 82.3％in the chromosome karyotype analysis.Conclusion Bone marrow chromosome preparation system with colchicines concentration of 0.07μg/mL and colchicines action time of 80 min，and hypotonic time of 35 min is worthy of clinical promotion.

orthogonal design；bone marrow；chromosome karyotype analysis；chromosome preparation method；leukemia；chromosome short－term culture；colchicines

R733.7

A

10.7652/jdyxb201602029

2015－02－26

2015－06－28

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院新技術(shù)新療法資助項目（No.09－016）、國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81270597）和2011年中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目（No.0602－08143041）Supported by the New Technology Funds of the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University（No.09－016），the National Natural Science Foundation of China（No.81270597）and the Fundamental Research Funds for the Central Universities（No.0602－08143041）

張鵬宇.E－mail：zhangpengyu2004@126.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1634.020.html（2016－02－02）