• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    染色體短期培養(yǎng)法的改良及在白血病患者染色體核型分析中的應(yīng)用

    2016-05-09 07:12:00張鵬宇張龍進陳社平蒙欣張王剛周伏玲
    關(guān)鍵詞:秋水仙素核型白血病

    張鵬宇,張龍進,羅 靜,陳社平,蒙欣,田 瑋,張王剛,周伏玲

    (西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,陜西西安 710004)

    染色體短期培養(yǎng)法的改良及在白血病患者染色體核型分析中的應(yīng)用

    張鵬宇,張龍進,羅 靜,陳社平,蒙欣,田 瑋,張王剛,周伏玲

    (西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,陜西西安 710004)

    目的 改良骨髓染色體短期培養(yǎng)法并對130例白血病患者進行染色體核型分析。方法 通過單因子梯度實驗,對影響骨髓染色體短期培養(yǎng)法的秋水仙素濃度、作用時間、低滲時間等主要因素進行優(yōu)化,并在改良基礎(chǔ)上,進行了3因素3水平正交實驗優(yōu)化骨髓染色體制備體系,進一步對我院130例白血病患者進行了染色體核型分析。結(jié)果 秋水仙素濃度、秋水仙素作用時間、低滲時間等因素都有適宜的范圍,過高或過低都會影響染色體制備成功率,正交實驗結(jié)果表明骨髓染色體制備的最適體系為秋水仙素質(zhì)量濃度0.07μg/mL,作用時間80min,低滲時間35min。通過改良的染色體短期培養(yǎng)法對130例白血病患者進行了染色體核型分析,染色體制備成功率達到了97.69%,異常核型檢出率為82.3%。結(jié)論 0.07μg/mL秋水仙素作用80min,低滲時間35min的改良骨髓染色體制備體系值得臨床推廣。

    正交設(shè)計;骨髓;染色體核型;染色體制備方法;白血??;染色體短期培養(yǎng);秋水仙素

    染色體核型分析對血液系統(tǒng)疾病的輔助診斷、治療、預(yù)后判斷及發(fā)病機制的探討具有不可替代的重要意義,是對傳統(tǒng)的血液和骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢查的重要補充[1-2]。然而,白血病骨髓染色體的成功制備是血液病細胞遺傳學(xué)研究中的一個難題,因染色體標本制備步驟眾多,易受多種因素的影響,因此,穩(wěn)定獲得形態(tài)良好、長度適宜、分散較好以及足量的中期分裂相染色體是我院血液科染色體室面臨的重大挑戰(zhàn)[3-4]。我們通過研究多因素多水平的正交實驗設(shè)計方法改進了傳統(tǒng)染色體制備過程,提高了染色體制備成功率,建立了適合我院染色體室白血病骨髓染色體的制備方法,并對130例白血病患者進行了染色體核型分析。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 小牛血清購自杭州四季青公司,谷氨酰胺、秋水仙素及Giemsa染液均購自Sigma公司,RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。

    1.2 研究對象 選取2014年1月~10月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科門診及住院患者130例,男性患者79例,女性患者51例,年齡13~83歲,中位年齡為48歲。病例均經(jīng)結(jié)合臨床及MICM分析(M:骨髓細胞形態(tài)學(xué);I:細胞免疫學(xué);C:細胞遺傳學(xué);M:分子生物學(xué)),并根據(jù)張之南等[5]主編的《血液病診斷及療效標準》進行診斷,初診標本慢性粒細胞白血?。–ML)53例,復(fù)查CML 4例,CML骨髓移植術(shù)后1例,急性非淋巴細胞白血病(AML)55例,AML骨髓移植術(shù)后1例,急性淋巴細胞白血?。ˋLL)14例,慢性淋巴細胞白血?。–LL)2例。

    1.3 骨髓標本采集 分別抽取骨髓液3mL,收集于肝素鈉抗凝管。

    1.4 單因素實驗 選取21例初診白血病患者,其中CML 15例,AML 4例,ALL 2例。每例患者根據(jù)傳統(tǒng)染色體制備方法,經(jīng)有核細胞計數(shù),按2×106/mL細胞密度接種到5mL RPMl 1640培養(yǎng)基中,接種6瓶,培養(yǎng)過夜。設(shè)立秋水仙素梯度質(zhì)量濃度依次為0.04、0.07、0.10、0.13、0.16、0.19μg/mL,按照數(shù)字1~6號標記好,保持秋水仙素作用時間為70min及低滲時間為25min不變,經(jīng)過3次固定、R顯帶后鏡下進行染色體分裂相數(shù)量統(tǒng)計。

    同樣,保持秋水仙素質(zhì)量濃度0.07μg/mL、低滲時間為25min不變,設(shè)立秋水仙素作用時間梯度(10、30、50、70、90、110min);保持秋水仙素質(zhì)量濃度0.07μg/mL、秋水仙素作用時間為70min不變,設(shè)立低滲時間梯度(5、25、45、65、85、105min),經(jīng)過3次固定、R顯帶后鏡下進行染色體分裂相數(shù)量統(tǒng)計。

    1.5 正交設(shè)計實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取1例初發(fā)的CML患者的骨髓標本,進行正交實驗。在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,設(shè)計三因素三水平的正交實驗表,進行9次不同組合的實驗,實驗重復(fù)3次,選取染色體制備成功率高的組合作為染色體短期培養(yǎng)法的優(yōu)化體系。

    1.6 染色體核型分析與評價標準 按《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 1995)》進行描述。至少2個細胞有同樣的染色體增加或結(jié)構(gòu)重排,或者3個細胞有同樣的染色體丟失,方可確認為一個異??寺?。染色體制備成功率換算公式為:染色體制備成功率=可供分析分裂相數(shù)量/分裂相總數(shù),制備成功率越高,則說明制備染色體的條件越好[3]。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。單因素實驗結(jié)果進行χ2檢驗,正交實驗結(jié)果應(yīng)用極差分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 單因素實驗結(jié)果 單因素實驗結(jié)果如表1所示。6組秋水仙素不同濃度組中,0.07μg/mL(第2組)組的染色體制備成功率最高為77.50%;與0.19 μg/mL(第6組)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.04,P<0.05);但與0.04、0.1、0.13、0.16μg/mL(第1、3、4、5組)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);這表明秋水仙素作用的質(zhì)量濃度不宜超過0.16μg/mL。

    秋水仙素作用不同時間的實驗中,70min時(第4組)染色體制備成功率最高為72.09%,與第1組(10min)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.03,P<0.05;但與30、50、90、110min(第2、3、5、6組)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);這表明秋水仙素的作用時間最少應(yīng)大于10min。

    不同低滲時間的實驗中,45min(第3組)時染色體制備成功率最高為76.84%;與5min(第1組)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.34,P<0.01);與85 min(第5組)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.65,P<0.05);但與第2、4組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這表明低滲時間對染色體的制備成功率影響明顯,其時間應(yīng)控制在25~60min之間。

    表1 染色體制備單因素實驗結(jié)果Tab.1 Result of single factor experiment for chromosome preparation

    2.2 正交設(shè)計實驗結(jié)果 根據(jù)單因素的實驗結(jié)果即獲得較高染色體制備成功率的秋水仙素質(zhì)量濃度不宜超過0.16μg/mL、作用時間應(yīng)大于10min、低滲時間應(yīng)控制在25~60min。故分別以3因素的最佳水平為中心向下及向上各擴大一個水平進行正交實驗的設(shè)計,具體設(shè)計方案見表2。3次重復(fù)實驗的平均成功率的正交設(shè)計實驗結(jié)果(表3)顯示,通過正交極差分析表明處理組合6的染色體制備成功率最高,為最佳水平組合。因此,選取組合6作為染色體短期培養(yǎng)法的最優(yōu)條件,即秋水仙素濃度0.07μg/mL、作用時間80min、低滲時間35min。

    表2 正交設(shè)計的因素與水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal design

    表3 正交實驗設(shè)計L9(33)Tab.3 Orthogonal design L9(33)of the amplification system

    2.3 白血病病例分析 利用前期實驗獲得的改良的染色體短期培養(yǎng)法(秋水仙素質(zhì)量濃度0.07μg/mL、作用時間80min、低滲時間35min),將本組130例骨髓標本實驗培養(yǎng)并分析,結(jié)果制備失敗了3例,成功了127例,染色體制備成功率為97.69%(表4)。124例初診標本中,104例檢出異常核型,其中53例CML標本中51例發(fā)現(xiàn)異常,異常檢出率96.2%;55 例AML標本44例發(fā)現(xiàn)異常,異常檢出率80.0%;14 例ALL標本9例發(fā)現(xiàn)異常,異常檢出率64.3%;2例CLL均未見明顯異常。復(fù)診標本中4例CML標本3例發(fā)現(xiàn)異常,2例骨髓移植后的標本未見明顯異常。

    我院血液實驗室目前發(fā)現(xiàn)白血病染色體核型異常類型主要有25種,t(9;22)、t(8;21)、t(15;17)和inv(16)是最常見類型,占所有異??倲?shù)的69.2%;+8、+ph是較為常見的繼發(fā)性改變,而其余t(1;9;22)、t(1;5)、t(1;19)、t(2;14)、t(3;11)、+4、t(4;11)、t(5;9)、t(7;11)、del(9q)、del(12q)、dic(13;14)、del(14q)、+19、add(19q)、del(19q)、+22、多倍體異常和復(fù)雜異常等19種異常都是較為少見的異常,僅占所有異??倲?shù)的30.8%。

    表4 130例白血病患者染色體核型分析結(jié)果Tab.4 Result of chromosome karyotype analysis of 130leukemia patients

    3 討論

    骨髓染色體的制備方法主要有直接法、短期培養(yǎng)法和同步化法[6],其各有優(yōu)缺點。然而,目前國內(nèi)外學(xué)者認為短期培養(yǎng)法能很好揭示更多的染色體異常[3],并且能夠符合臨床上需要快速、簡潔和穩(wěn)定的要求,因此大多數(shù)醫(yī)院都采用短期培養(yǎng)法進行染色體檢查。3種染色體制備方法均包括細胞收獲、低滲、固定、制片和染色等步驟。在細胞收獲過程中,秋水仙素濃度與作用時間一直都是爭論的焦點:秋水仙素能阻留中期分裂象,同時也會使染色體濃縮;若終濃度過高或處理時間過長,分裂象雖然有所增加,但染色體長度卻反而縮短,以致帶紋減少。故在制備過程中,各實驗室應(yīng)根據(jù)自身實驗條件找出適合的秋水仙素濃度及作用時間,以達到最佳的制備效果。應(yīng)用低滲液處理細胞,可使染色體分散;低滲時間過長,會導(dǎo)致染色體丟失,使染色體過分腫脹,造成形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊影響顯帶;低滲時間過短,則會導(dǎo)致染色體分散不佳。而固定、制片和染色過程的影響因素相對較小,實驗條件易于控制。因此,該研究采用了單因子梯度實驗和正交設(shè)計實驗,研究了短期培養(yǎng)法中秋水仙素濃度、秋水仙素作用時間及低滲時間。

    該實驗發(fā)現(xiàn)在單因子梯度實驗中,其他條件不變,隨著秋水仙素濃度和低滲時間的增大,染色體制備成功率從逐漸變高到逐漸變低,表明秋水仙素濃度和低滲時間過低或過高都會影響染色體制備成功率,而隨著秋水仙素作用時間的延長,染色體制備成功率高低起伏不定。宋蘭林等[3]同時應(yīng)用直接法、即刻低滲法、短期培養(yǎng)法和同步化4種方法對48例白血病患者制備其骨髓染色體,其染色體制備成功率為93.75%;其中單獨應(yīng)用短期培養(yǎng)法的染色體制備成功率為89.58%。本研究從單因子梯度實驗中選取染色體制備成功率最高的條件進行正交實驗設(shè)計,通過直觀分析和正交極差分析,本研究認為短期培養(yǎng)法的最適體系為秋水仙素濃度0.07μg/mL,秋水仙素作用時間80min,低滲時間35min。并通過選擇的最優(yōu)體系,分析了130例白血病標本,其僅有3例標本制備失敗,成功率達到了97.69%,且124例初診白血病標本104例檢出異常核型,異常檢出率高,進一步證明了改良后的染色體短期培養(yǎng)法能夠提高染色體制備成功率。當然,不同地區(qū)實驗室間在制備染色體的方法學(xué)上較難保持一致,而不同細胞類型的染色體對相關(guān)變量依賴程度也存在差異,在具體實施過程中,染色體標本制備過程必須結(jié)合本實驗室的自身條件,定期進行染色體室內(nèi)質(zhì)控,才能夠長期有效保持染色體標本制備質(zhì)量的穩(wěn)定性[7-9]。

    白血病是一類發(fā)生在骨髓中的造血干細胞異常的克隆性惡性疾病,其中大多數(shù)患者伴隨著染色體改變,而由染色體改變引起的融合基因、原癌基因的點突變、癌基因的擴增以及抑癌基因的失活與白血病發(fā)病息息相關(guān)。因此,由最初的FAB分型發(fā)展為MICM分型,最能反映白血病疾病的本質(zhì)[10-11]。白血病染色體核型異常的類型主要有數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常[12],其異常有助于白血病的診斷和鑒別診斷。對于收集的130份白血病染色體核型類型中,與FAB亞型相關(guān)的特異性染色體異常主要有t(9;22)、t(8;21)、t (15;17)和inv(16),主要存在于CML、M2、M3和M4中;值得注意的是t(9;22)也可見于ALL、ANLL及個別的MDS、真性紅細胞增多癥、骨髓纖維化、淋巴瘤等疾病中;7%的M4及個別的M1也會出現(xiàn)t (8;21),因此對疾病的診斷仍需結(jié)合臨床癥狀。t(4;11)常見于2%~6%的ALL中。自1979年VAN DEN BERGHE首次報道t(4;11)急淋以來,迄今文獻報道了不到600例,而研究表明其具有獨特的臨床、血液學(xué)和預(yù)后特點,因而構(gòu)成一種獨特的臨床、細胞遺傳學(xué)亞型[13-14]。在本研究的14份ALL中,發(fā)現(xiàn)了2 例t(4;11),其臨床資料有待整理。染色體改變是影響白血病預(yù)后的獨立因素[15]。根據(jù)染色體異常將白血病的預(yù)后危險程度分為:高危即-5、-7、5q-、3q-異常、亞二倍體、近單倍體、t(9;22)、t(4;11)、t(1;19)、t (8;14),復(fù)合染色體異常;中危即染色體正常、+8、+21、+22、47-50的超二倍體以及低危即(t(8;21)、t (15;17)、inv(16)、t(12;21)、染色體數(shù)目>50的超二倍體[16]。而本實驗發(fā)現(xiàn)的白血病染色體核型異常類型主要有25種,利于預(yù)后危險程度劃分,在白血病診斷、治療及預(yù)后判斷中具有重要的臨床意義。

    [1]MULLER S,O’BRIEN PCM,F(xiàn)ERGUSON-SMITH MA,et al.Crossspecies colour segmenting:a novel tool in human karyotyping analysis[J].Cytometry,1998,33(4):445-452.

    [2]BARBOUTI A,JOHANSSON B,HOGLUND M,et al.Multicolor COBRA-FISH analysis of chronic myeloid leukemia reveals novel cryptic balanced translocations during disease progression[J].Gene Chromosome Canc,2002,35(2):127-37.

    [3]宋蘭林,劉曉力,周淑蕓.白血病骨髓染色體制備法評估[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2002,10(5):40-42.

    [4]CLAUSSEN U,MICHEL S,MüHLIG P,et al.Demystifying chromosome preparation and the implications for the concept of chromosome condensation during mitosis[J].Cytogenet Genome Res,2002,98(2-3):136-146.

    [5]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].3版.北京:科學(xué)出版社,2007:103-139.

    [6]薛志科,薛永權(quán),林寶爵.骨髓直接培養(yǎng)法、短期培養(yǎng)法和同步化法在白血病染色體分析中的比較[J].中華血液學(xué)雜志,1993,10(2):102-103.

    [7]DENG W,TSAO SW,LUCAS JN,et al.A new method for improving metaphase chromosome spreading[J].Cytometry,2003,51(1):46-51.

    [8]HENEGARIU O,HEEREMA NA,WRIGHT LL,et al.Improvements in cytogenetic slide preparation controlled chromosomesp reading,chemical ageing and gradual denaturing[J].Cytometry,2001,43(2):101-109.

    [9]HLISCS R,MUHLIG P,CLAUSSEN U.The spreading of metaphases is a slow process which leads to a stretching of chromosomes[J].Cytogenet Cell Genet,1997,76(3-4):167-171.

    [10]MRóZEK K,HARPER DP,APLAN PD.Cytogenetics and molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia[J].Hematol Oncol Clin North Am,2009,23(5):991-1010.

    [11]BENCH AJ,ERBER WN,SCOTT MA.Molecular genetic analysis of haematological malignancies:I.Acute leukaemias and myeloproliferative disorders[J].Clin Lab Haematol,2005,27(3):148-171.

    [12]PEDERSON-BJERGAARD J,ROWLEY JD.The balanced and the unbalanced chromosome aberrations of acute myeloid leukemia may develop in different ways and may contribute differently to malignant transformation[J].Blood,1994,83 (10):2780-2786.

    [13]JOHANSSON B,MOORMAN AV,HASS OA,et al.Hematologic malignancies with t(4;11)(q21;q23)—a cytogenetic,morphologic,immunophenotypic and clinical study of 183 cases.European 11q23 Workshop participants[J].Leukemia,1998,12(5):779-787.

    [14]過宇,薛永權(quán),謝新,等.染色體t(4;11)急性淋巴細胞白血?。?0例臨床和實驗室分析[J].中華血液學(xué)雜志,2000,21(2):71-73.

    [15]VARDIMAN JW,THIELE J,ARBER DA,et al.The 2008 revision of the World Health Organization(WHO)classification of myeloid neoplasms and acute leukemia:rationale and important changes[J].Blood,2009,114(5):937-951.

    [16]MICHALOVA K,ZEMANOVA Z,BREZINOVA J.Multicolor fluorescence in situ hybridization(mFISH)[J].Cas Lek Cesk,2001,140(4):99-103.

    (編輯 國 榮)

    Application of improved chromosome short-term culture method in the chromosome karyotype analysis of leukemia patients

    ZHANG Peng-yu,ZHANG Long-jin,LUO Jing,CHEN She-ping,MENG Xin,TIAN Wei,ZHANG Wang-gang,ZHOU Fu-ling
    (Department of Hematology,the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710004,China)

    Objective To make the chromosome karyotype analysis of 130 patients with leukemia by using the improved chromosome short-term culture method.Methods We optimized the main factors with a single factor gradient experiment in short-term culture of bone marrow chromosome,including colchicines concentration,duration of action of colchicines,and hypotonic time.On this basis,we conducted the three-factors and three-level orthogonal experiment to achieve improved bone marrow chromosome preparation system,which was later applied in 130 patients with leukemia in our hospital.Results The orthogonal experiment results showed that the optimum conditions were colchicines concentration of 0.07μg/mL,colchicines action time of 80 min,and hypotonic time of 35 min during the preparation of the bone marrow chromosome.Using this method,the chromosome preparation success rate reached 97.69%and the detection rate of abnormal karyotype reached 82.3%in the chromosome karyotype analysis.Conclusion Bone marrow chromosome preparation system with colchicines concentration of 0.07μg/mL and colchicines action time of 80 min,and hypotonic time of 35 min is worthy of clinical promotion.

    orthogonal design;bone marrow;chromosome karyotype analysis;chromosome preparation method;leukemia;chromosome short-term culture;colchicines

    R733.7

    A

    10.7652/jdyxb201602029

    2015-02-26

    2015-06-28

    西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院新技術(shù)新療法資助項目(No.09-016)、國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81270597)和2011年中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(No.0602-08143041)Supported by the New Technology Funds of the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(No.09-016),the National Natural Science Foundation of China(No.81270597)and the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.0602-08143041)

    張鵬宇.E-mail:zhangpengyu2004@126.com

    優(yōu)先出版:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1634.020.html(2016-02-02)

    猜你喜歡
    秋水仙素核型白血病
    白血病男孩終于摘到了星星
    軍事文摘(2024年2期)2024-01-10 01:59:00
    不同濃度秋水仙素對蠶豆根部形態(tài)特征及染色體的影響
    園藝與種苗(2023年1期)2023-03-17 16:33:36
    不同濃度秋水仙素處理下蠶豆發(fā)芽形態(tài)指標及氣孔分析
    園藝與種苗(2023年1期)2023-03-17 16:33:34
    SNP-array技術(shù)聯(lián)合染色體核型分析在胎兒超聲異常產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用
    秋水仙素對紅肉火龍果種子萌發(fā)和幼苗生長的影響
    一例蛋雞白血病繼發(fā)細菌感染的診治
    鮮黃花菜如何處理才不會中毒
    2040例不孕不育及不良孕育人群的染色體核型分析
    白血病外周血體外診斷技術(shù)及產(chǎn)品
    染色體核型異?;颊呷蚪M芯片掃描結(jié)果分析
    国产精品99久久久久久久久| 性色avwww在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 我的老师免费观看完整版| 免费看光身美女| h视频一区二区三区| 自线自在国产av| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲av男天堂| 日本与韩国留学比较| 男的添女的下面高潮视频| 人体艺术视频欧美日本| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 另类亚洲欧美激情| 成年av动漫网址| 久久人人爽人人片av| 91久久精品国产一区二区成人| 美女国产视频在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男女免费视频国产| 久久久久久久久久久免费av| 午夜福利,免费看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 99久久人妻综合| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 性色avwww在线观看| 国精品久久久久久国模美| 18禁在线播放成人免费| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产av新网站| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 亚洲,一卡二卡三卡| 丰满乱子伦码专区| 各种免费的搞黄视频| 只有这里有精品99| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产在线男女| 涩涩av久久男人的天堂| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 午夜久久久在线观看| 成人国产麻豆网| 国产极品天堂在线| 中文天堂在线官网| 黄色日韩在线| 亚洲性久久影院| 日韩在线高清观看一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲av综合色区一区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看三级黄色| 亚洲av中文av极速乱| 永久免费av网站大全| av有码第一页| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品人妻久久久久久| 乱人伦中国视频| 中文字幕制服av| 内地一区二区视频在线| 如何舔出高潮| 欧美3d第一页| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久国内精品自在自线图片| 久久97久久精品| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲欧洲日产国产| 美女主播在线视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 另类精品久久| 婷婷色av中文字幕| 国产日韩欧美视频二区| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲国产色片| 日韩亚洲欧美综合| 一本大道久久a久久精品| 大香蕉97超碰在线| 高清欧美精品videossex| av卡一久久| 亚洲成人手机| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费大片18禁| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 人人澡人人妻人| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本爱情动作片www.在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 综合色丁香网| 人人澡人人妻人| 国产av国产精品国产| 国产黄片视频在线免费观看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产综合精华液| 人人澡人人妻人| 嫩草影院入口| 亚洲va在线va天堂va国产| 国内精品宾馆在线| a级毛色黄片| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 人体艺术视频欧美日本| 高清午夜精品一区二区三区| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲欧美精品自产自拍| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久免费观看电影| 这个男人来自地球电影免费观看 | 麻豆成人午夜福利视频| 熟女人妻精品中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产黄色视频一区二区在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品一二三区在线看| 精品一区二区三区视频在线| 99久国产av精品国产电影| 国产在视频线精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 黄色毛片三级朝国网站 | 亚洲三级黄色毛片| 国产乱人偷精品视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 丝瓜视频免费看黄片| 观看免费一级毛片| 丁香六月天网| 亚洲第一av免费看| 亚洲三级黄色毛片| 久久狼人影院| 国产伦精品一区二区三区四那| 免费少妇av软件| 在线观看一区二区三区激情| 日本欧美视频一区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲国产av新网站| 国产男女内射视频| 精品一区在线观看国产| 青青草视频在线视频观看| 久久久精品94久久精品| 多毛熟女@视频| 有码 亚洲区| 偷拍熟女少妇极品色| 中文字幕av电影在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品一区www在线观看| 少妇 在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲av综合色区一区| 欧美3d第一页| 国产精品久久久久久精品古装| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 三上悠亚av全集在线观看 | 国产永久视频网站| 久久99蜜桃精品久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩亚洲欧美综合| 91在线精品国自产拍蜜月| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲情色 制服丝袜| 国产免费视频播放在线视频| 久久97久久精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| av不卡在线播放| 少妇熟女欧美另类| 欧美丝袜亚洲另类| 伊人久久国产一区二区| 男女无遮挡免费网站观看| 午夜影院在线不卡| 国产精品人妻久久久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品久久久久久久电影| 日日啪夜夜撸| 日韩中字成人| 亚洲国产欧美在线一区| av天堂久久9| 六月丁香七月| 最近手机中文字幕大全| 国产中年淑女户外野战色| 日本黄色片子视频| 美女视频免费永久观看网站| 乱人伦中国视频| 老女人水多毛片| 国产精品人妻久久久久久| 国产黄片美女视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩av免费高清视频| 一级片'在线观看视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久精品久久精品一区二区三区| 午夜91福利影院| 一本大道久久a久久精品| 亚洲精品第二区| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久精品免费免费高清| 女性生殖器流出的白浆| av.在线天堂| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚州av有码| a级毛片免费高清观看在线播放| 中国国产av一级| 婷婷色综合www| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲av不卡在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 又爽又黄a免费视频| av女优亚洲男人天堂| √禁漫天堂资源中文www| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日本欧美视频一区| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲内射少妇av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 乱系列少妇在线播放| av线在线观看网站| 日韩一区二区视频免费看| 免费看光身美女| 免费观看av网站的网址| 欧美精品一区二区免费开放| 一级毛片 在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 男人舔奶头视频| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 欧美三级亚洲精品| 日韩欧美 国产精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| av国产久精品久网站免费入址| 51国产日韩欧美| 99热这里只有是精品50| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久青草综合色| 婷婷色综合www| 日韩一区二区三区影片| 免费黄网站久久成人精品| 午夜视频国产福利| 欧美最新免费一区二区三区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| av福利片在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 大片免费播放器 马上看| 99热全是精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美区成人在线视频| 国产一区二区在线观看日韩| 免费大片18禁| 在线免费观看不下载黄p国产| 丝袜喷水一区| 欧美高清成人免费视频www| 永久免费av网站大全| 美女国产视频在线观看| 观看美女的网站| 18禁动态无遮挡网站| 欧美97在线视频| 国产探花极品一区二区| 亚洲精品亚洲一区二区| 少妇人妻 视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | www.色视频.com| 黄色怎么调成土黄色| 久久精品夜色国产| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品偷伦视频观看了| 亚州av有码| 久久6这里有精品| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产成人精品无人区| 一区在线观看完整版| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 水蜜桃什么品种好| 国产深夜福利视频在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产黄色免费在线视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 国产视频内射| 在线观看免费视频网站a站| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产黄频视频在线观看| 日韩强制内射视频| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲欧美日韩东京热| 国产亚洲5aaaaa淫片| 欧美精品国产亚洲| 亚洲va在线va天堂va国产| 婷婷色av中文字幕| 欧美人与善性xxx| 国产黄频视频在线观看| 多毛熟女@视频| 曰老女人黄片| 久久久a久久爽久久v久久| 看十八女毛片水多多多| 国产精品成人在线| 日韩中文字幕视频在线看片| 日日爽夜夜爽网站| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产高清三级在线| 成人亚洲精品一区在线观看| av播播在线观看一区| 男女国产视频网站| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一个人看视频在线观看www免费| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久久久久伊人网av| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美丝袜亚洲另类| 国产伦理片在线播放av一区| 久久99精品国语久久久| 青青草视频在线视频观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品国产av在线观看| av网站免费在线观看视频| 国产亚洲欧美精品永久| 男人爽女人下面视频在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲成色77777| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日韩av免费高清视频| 一区二区三区乱码不卡18| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美+日韩+精品| 国产极品天堂在线| 久久久国产一区二区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| tube8黄色片| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产黄色免费在线视频| 精品一区在线观看国产| 97精品久久久久久久久久精品| 久久狼人影院| 高清黄色对白视频在线免费看 | 日日啪夜夜爽| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久精品国产自在天天线| 亚洲高清免费不卡视频| 乱人伦中国视频| 看十八女毛片水多多多| 国产成人免费观看mmmm| 日韩免费高清中文字幕av| 国产高清三级在线| 免费观看av网站的网址| 在线观看三级黄色| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产爽快片一区二区三区| 精品酒店卫生间| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 成人无遮挡网站| 国产乱人偷精品视频| 欧美xxⅹ黑人| 伦理电影免费视频| 青春草国产在线视频| kizo精华| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 99九九在线精品视频 | 中文欧美无线码| 国产精品久久久久久av不卡| 老熟女久久久| 老司机影院毛片| 在线观看三级黄色| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲在久久综合| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲av免费高清在线观看| 一个人免费看片子| 性色avwww在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产成人精品婷婷| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久久久久久久成人| 26uuu在线亚洲综合色| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲自偷自拍三级| 国产乱来视频区| 内射极品少妇av片p| 草草在线视频免费看| 国产美女午夜福利| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久精品国产自在天天线| 最近手机中文字幕大全| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美日韩在线观看h| 一区二区三区免费毛片| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲美女黄色视频免费看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 人妻 亚洲 视频| 26uuu在线亚洲综合色| 美女cb高潮喷水在线观看| 尾随美女入室| 亚洲av男天堂| 国产日韩欧美视频二区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | av线在线观看网站| 日韩人妻高清精品专区| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲真实伦在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 老司机亚洲免费影院| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品乱久久久久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| av线在线观看网站| 国产极品天堂在线| 久久 成人 亚洲| 久久毛片免费看一区二区三区| 人人妻人人澡人人看| 简卡轻食公司| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产极品天堂在线| videossex国产| 熟女av电影| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 国产精品久久久久成人av| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久精品久久久久真实原创| 在现免费观看毛片| 少妇高潮的动态图| 夫妻午夜视频| 又爽又黄a免费视频| 黄片无遮挡物在线观看| 精品少妇内射三级| 免费看不卡的av| 成人国产av品久久久| 麻豆成人午夜福利视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 丝袜在线中文字幕| 91久久精品电影网| 热re99久久国产66热| 蜜桃在线观看..| 亚洲欧洲国产日韩| 国产日韩欧美视频二区| 嫩草影院新地址| 99热这里只有是精品在线观看| 在线天堂最新版资源| 在线观看国产h片| 老女人水多毛片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 久久av网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 男人狂女人下面高潮的视频| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品女同一区二区软件| 在线观看一区二区三区激情| 日韩精品有码人妻一区| 秋霞在线观看毛片| 免费观看av网站的网址| 嫩草影院新地址| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 天堂8中文在线网| 国产av一区二区精品久久| 十分钟在线观看高清视频www | 夜夜爽夜夜爽视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲人与动物交配视频| 99视频精品全部免费 在线| 偷拍熟女少妇极品色| 国产伦精品一区二区三区四那| 黑人高潮一二区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 久久鲁丝午夜福利片| 国国产精品蜜臀av免费| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲美女黄色视频免费看| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品久久久久久久电影| 高清不卡的av网站| kizo精华| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美日韩亚洲高清精品| 日本免费在线观看一区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看| 99热国产这里只有精品6| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 99精国产麻豆久久婷婷| 91精品伊人久久大香线蕉| 十八禁网站网址无遮挡 | 美女中出高潮动态图| av免费在线看不卡| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日韩av不卡免费在线播放| 老司机亚洲免费影院| 欧美三级亚洲精品| av卡一久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 色视频在线一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 99热全是精品| 91久久精品电影网| 婷婷色综合www| av天堂中文字幕网| 美女福利国产在线| kizo精华| 国产视频首页在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久视频综合| 九九爱精品视频在线观看| 日本午夜av视频| 成人二区视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲av日韩在线播放| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲成人av在线免费| 六月丁香七月| 亚洲成色77777| 精品少妇内射三级| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一二三四中文在线观看免费高清| 伦精品一区二区三区| 丰满迷人的少妇在线观看| 另类亚洲欧美激情| a级毛片免费高清观看在线播放| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲av福利一区| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 99久久人妻综合| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产91av在线免费观看| 99热国产这里只有精品6| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产黄频视频在线观看| 三级国产精品片| 久久99精品国语久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 久久热精品热| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av中文av极速乱| 狂野欧美激情性bbbbbb| freevideosex欧美| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 2022亚洲国产成人精品| av女优亚洲男人天堂| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产在视频线精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 日本欧美视频一区| 91aial.com中文字幕在线观看| 午夜91福利影院| 午夜视频国产福利| 精品久久久久久电影网| 免费黄色在线免费观看| 亚洲成色77777| 在线观看国产h片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 99热网站在线观看| 五月天丁香电影| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美日韩av久久| 亚洲精品视频女| 色视频www国产| 精品久久久久久久久亚洲| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久久久久伊人网av| 国产一区有黄有色的免费视频| 高清av免费在线| 久久久欧美国产精品| 在线观看美女被高潮喷水网站| 高清视频免费观看一区二区| 久久6这里有精品| 老司机影院毛片| 热99国产精品久久久久久7| 高清黄色对白视频在线免费看 | 国产熟女欧美一区二区| 2021少妇久久久久久久久久久| 两个人的视频大全免费|