ACE2/Apelin在睡眠呼吸暫停低氧大鼠肺損傷中的表達(dá)及意義

寇育樂，王立民，王紅陽，張嘉賓，譚曦舒，張 敏

（河北理工大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，河北唐山 063000）

ACE2/Apelin在睡眠呼吸暫停低氧大鼠肺損傷中的表達(dá)及意義

寇育樂，王立民，王紅陽，張嘉賓，譚曦舒，張 敏

（河北理工大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，河北唐山 063000）

目的 觀察慢性睡眠呼吸暫停低氧誘發(fā)大鼠肺損傷發(fā)病過程中腎素－血管緊張素－醛固酮（RAS）系統(tǒng)部分成員人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶相關(guān)肽2（ACE2）、Apelin及血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的動(dòng)態(tài)變化，并探討其在睡眠呼吸暫停低氧誘發(fā)肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將72只雄性Wistar大鼠分為對照組（UC組）、5％間歇低氧組（CIH組）和實(shí)驗(yàn)對照組（SC組），根據(jù)暴露時(shí)間不同分為1、2、3、4周4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只，CIH組大鼠循環(huán)給予氮?dú)夂蛪嚎s空氣，UC組不給予任何處理，SC組大鼠循環(huán)給予壓縮空氣，于不同時(shí)間點(diǎn)分別觀察各亞組大鼠肺組織病理、Apelin蛋白及Apelin、ACE2、AngⅡmRNA的表達(dá)。結(jié)果 UC組及SC組未見明顯病理損害，而CIH組肺泡壁水腫增厚，部分肺泡萎陷不張，肺間質(zhì)及支氣管上皮內(nèi)也可見中性粒細(xì)胞浸潤，且隨時(shí)間延長病理損傷逐漸加重。與UC組及SC組比較，CIH組Apelin蛋白表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)先逐漸降低，于2周達(dá)到低谷后逐漸增高（P＜0.05），而CIH各亞組Apelin mRNA較UC組及SC組未見顯著變化（P＞0.05）；ACE2mRNA表達(dá)初期呈輕度逐漸增高趨勢（P＜0.05），于2周達(dá)到峰值后逐漸下降；AngⅡmRNA于各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)逐漸增加（P＜0.05），于4周達(dá)峰值。結(jié)論 在慢性間歇低氧肺損傷中Apelin蛋白呈先低后高，而ACE2變化趨勢相反，提示Apelin蛋白可能與ACE2的降解以及AngⅡ的變化密切相關(guān)。

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）；間歇性低氧；ACE2；Apelin；AngⅡ；肺損傷

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1720.028.html（2016－02－02）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）患者在睡眠過程中反復(fù)出現(xiàn)呼吸暫?；虻屯猓L期可導(dǎo)致多種靶器官損害，其中呼吸系統(tǒng)不可避免受到累及，但具體發(fā)病機(jī)制至今未明。1998年，研究人員以反向藥理學(xué)方法從牛胃組織提取物中分離純化出了一種小分子血管活性肽Apelin，是腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（renin－angiotensin system，RAS）中新的重要組成部分，是一種重要的內(nèi)源性生理調(diào)節(jié)肽。初步研究發(fā)現(xiàn)，Apelin具有舒張血管、利尿、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及抗氧化等功能［1－2］。2002年，兩個(gè)研究小組先后通過克隆技術(shù)新發(fā)現(xiàn)的一種金屬蛋白酶、人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶相關(guān)肽2（angiotensin－converting enzyme 2，ACE2），既是RAS系統(tǒng)中的的負(fù)性調(diào)節(jié)因素，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一可以降解Apelin的酶［3］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，Apelin及ACE2在肺組織中均有極高的表達(dá)［4］。本研究通過免疫組化及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測ACE2及AngⅡ在慢性間歇低氧肺損傷中的表達(dá)，探討Apelin在間歇低氧肺損傷發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制及其與ACE2、AngⅡ的關(guān)系，探討Apelin在OSHSA發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將清潔級健康的成年雄性Wistar大鼠72只［許可證編號：SCXK（津）2009－ 0001］，體質(zhì)量（150±10）g，購于天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，大鼠分為空白對照組（UC）、5％間歇低氧組（CIH）、實(shí)驗(yàn)對照組（SC），各組又依據(jù)干預(yù)時(shí)間分為1、2、3、4周時(shí)間點(diǎn)亞組，每個(gè)時(shí)間亞組各6只。

1.2 間歇低氧模型的建立及各組干預(yù)情況 通過氮?dú)庀♂屧恚罁?jù)文獻(xiàn)［5］，UC組暴露于空氣中，CIH組循環(huán)暴露于氮?dú)夂蛪嚎s空氣中（每一循環(huán)120s，使艙內(nèi)最低氧體積分?jǐn)?shù)達(dá)5％，然后恢復(fù)至21％，8h/d；SC組：向低氧箱內(nèi)持續(xù)注入壓縮空氣120s，流速為10L/min，監(jiān)測氧體積分?jǐn)?shù)維持在21％，用數(shù)字測氧儀監(jiān)測艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)變化，維持各組氧體積分?jǐn)?shù)，波動(dòng)范圍在±0.5％以內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，送入常規(guī)飼養(yǎng)箱內(nèi)自由飲水與攝食，生活環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。分別在實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4周結(jié)束后，腹腔麻醉（300mg/只）下開胸，經(jīng)右心室插管至肺動(dòng)脈，將右側(cè)肺組織固定于40g/L多聚甲醛，進(jìn)行HE染色及免疫組化檢測。取左肺上下葉經(jīng)液氮速凍后保存于－80℃冰箱行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

1.3 各組大鼠肺組織HE染色 肺組織經(jīng)40g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，選取平行肺門方向切片（德國LEICA），片厚4μm。常規(guī)蘇木素－伊紅染色。鏡下觀察并攝片，取各組各時(shí)間點(diǎn)每只大鼠10張切片，在光學(xué)顯微鏡下以相同倍數(shù)（20×10）分別選取不同部位攝片。

1.4 Apelin蛋白免疫組化染色 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽高壓修復(fù)，一抗為Apelin兔抗鼠多克隆抗體（1︰200，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），濕盒中4℃放置12h，IgG抗體－HRP多聚體（PV二步法，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片，取各組各時(shí)間點(diǎn)6張標(biāo)本片在光學(xué)顯微鏡下，以相同放大倍數(shù)（20×10）分別選取不同部位攝片，利用Motic醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)的免疫組化分析模塊中單點(diǎn)分割法分析，取相同面積陽性目標(biāo)的積分吸光度值（IA）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測肺組織Apelin、ACE2及AngⅡmRNA表達(dá) 冰上分別取材各組凍存的左肺組織約30mg，用組織RNA提取試劑盒（北京博邁德生物有限公司）提取RNA并測定濃度，瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA完整性。采用TaKaRa試劑盒合成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。20μL體系擴(kuò)增，上下游引物各0.4μL，cDNA模板2.0μL，ROX1 0.4μL，熒光（避光）10μL。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30s，95℃5s，60℃31s，共40個(gè)循環(huán)。其中各上下游引物由上海生工合成。Apelin的正向引物：3′－CAGCAGGAATAGCACCCTCT－5′；反向引物：5′－AAGTTGGGCATCAGGCTCT－3′；ACE2的正向引物3′－ACGAAGCCGAAGACCTGTT－3′；反向引物：5′－GGAAGGTGTGGACTGTTCCT－3′；AngⅡ的正向引物：5′－GGGAAGGGAATGAGGCTTAC－3′；反向引物：5′－GGTTGGCTGATGCTGCTTAT－3′。分別得到擴(kuò)增曲線、溶解曲線和待測樣本表達(dá)量，應(yīng)用分析軟件Rotor－Gene3000判斷溶解曲線特異性及擴(kuò)增曲線是否為陽性，采用2－△△Ct相對定量分析法計(jì)算出各組ACE2、AngⅡmRNA的相對含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（珔x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，經(jīng)檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化 UC組及SC組未見明顯肺損傷；CIH組可見肺泡壁增厚伴少量的肺泡萎縮不張，肺間質(zhì)內(nèi)及支氣管上皮可見中性粒細(xì)胞浸潤，隨時(shí)間延長病理損傷越重（圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變Fig.1The pathological changes of pulmonary tissues in different groups of rats（HE，×200）

2.2 各組大鼠Apelin蛋白的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示，各組、各時(shí)間點(diǎn)均有Apelin蛋白表達(dá)，主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞以胞質(zhì)表達(dá)為主，呈棕黃色或淺黃色（圖2）。UC組有一定的基礎(chǔ)表達(dá)。與UC、SC組比較，CIH組Apelin蛋白總體表達(dá)呈先降低后升高過程，于2周時(shí)表達(dá)量最低，后又逐漸升高，于4周時(shí)表達(dá)量最高（表1）。

表1 各組大鼠肺組織中Apelin蛋白表達(dá)水平Tab.1 The protein level of Apelin in the rats’pulmonary tissues in different groups （珔x±s）

圖2 免疫組化檢測各組大鼠Apelin蛋白的表達(dá)情況Fig.2The expression of Apelin protein in the lung in different groups of rats（SP，×200）

2.3 各組大鼠Apelin、ACE2及AngⅡmRNA的表達(dá)情況CIH組Apelin mRNA與UC組及SC組比較，無明顯差異（P＞0.05，表2）；與UC組及SC組比較，CIH組ACE2mRNA總體呈先高后低趨勢，于2周即出現(xiàn)最強(qiáng)表達(dá)量，隨后表達(dá)逐漸下降（表3）；CIH組AngⅡmRNA表達(dá)于各時(shí)間點(diǎn)與UC組比較，均逐漸增高（P＜0.05），于4周表達(dá)最強(qiáng)（表4）。

表2 各組大鼠肺組織中Apelin mRNA水平Tab.2 The mRNA level of Apelin in the rats’pulmonary tissues in different groups （珔x±s）

表3 各組大鼠肺組織中ACE2mRNA水平Tab.3 The mRNA level ACE2in the rats’pulmonary tissues in different groups （珔x±s）

表4 各組慢性間歇低氧肺組織中AngⅡmRNA水平Tab.4 The mRNA level of AngⅡin the rats’pulmonary tissues in different groups （珔x±s）

3 討論

OSAHS是一種累及全身多系統(tǒng)的睡眠呼吸障礙性疾病。臨床統(tǒng)計(jì)未經(jīng)治療的OSAHS患者5年病死率高達(dá)11％～13％。全球每天約有3 000人的死亡與OSAHS有關(guān)［6］。有研究表明，OSAHS患者中COPD的發(fā)病率為10％～20％［7］，肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病率為17％～42％［8－9］，且與其他呼吸系統(tǒng)疾病如慢性咳嗽、哮喘發(fā)作等有極高的共存率。本研究中CIH組與UC組及SC組相比，出現(xiàn)明顯病理損傷，且隨間歇低氧時(shí)間延長，病理損傷愈顯著。提示CIH可能是導(dǎo)致OSAHS相關(guān)性肺組織病理損害的機(jī)制之一。

近年研究發(fā)現(xiàn)，RAS系統(tǒng)參與了OSAHS的發(fā)生發(fā)展，但鮮見局部RAS系統(tǒng)如肺組織RAS通路在OSAHS相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病中作用機(jī)制的研究。有報(bào)道RAS的主要效應(yīng)物質(zhì)AngⅡ在OSAHS患者體內(nèi)顯著升高，并且經(jīng)CPAP治療后可恢復(fù)正常［9］。模擬OSAHS的間歇低氧模型中反復(fù)出現(xiàn)的低氧復(fù)氧過程類似于缺血再灌注，曾有研究報(bào)道在肺缺血再灌注損傷中AngⅡ顯著升高［10－11］，其作為一種前炎癥調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)表達(dá)、氧化應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，參與肺組織損傷的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)間歇低氧大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達(dá)升高，說明AngⅡ參與慢性間歇低氧所致的肺損傷過程，并與間歇低氧持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)。

GOETZE等［12］報(bào)道了慢性肺疾病患者的Apelin水平較正常組顯著降低。在心肌與腦組織缺血再灌注損傷模型中亦證實(shí)局部組織的Apelin蛋白明顯減少，從而對抗AngⅡ的作用減弱［13］。此外，研究表明外源性給予超早期Apelin干預(yù)可以增強(qiáng)局部抗氧化作用減輕組織損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，隨著間歇低氧肺損傷的出現(xiàn)，各亞組Apeiln mRNA無明顯變化，與其基因表達(dá)變化不同的是，肺組織Apelin蛋白水平隨間歇低氧時(shí)間的延長呈先降后升的變化趨勢，具體表現(xiàn)為1、2周組Apelin表達(dá)量減少，自3、4周組開始升高。CIH組大鼠肺組織Apelni mRNA與蛋白表達(dá)變化的這種差異的確切機(jī)制尚不清楚，可能與Apelin轉(zhuǎn)錄體翻譯、翻譯后修飾某個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)。有報(bào)道OSHSA患者體內(nèi)存在RAS系統(tǒng)激活以及AngⅡ升高，Apelin作為心血管保護(hù)因子，可以對抗RAS系統(tǒng)的效應(yīng)［7］。因此，推測間歇低氧肺組織中，Apelin可能通過對抗AngⅡ及抗炎、抗氧化等機(jī)制起著肺組織保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，ACE2在RAS系統(tǒng)中的作用與ACE截然相反，其可以通過降解AngⅡ產(chǎn)生血管緊張素1～7（angiotensin 1～7，Ang 1～7），可促使血管擴(kuò)張、抗增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。體外研究發(fā)現(xiàn)，ACE2對AngⅡ的催化效率要比AngⅠ高出近400倍，并且這種催化效率不受ACE抑制劑的影響。由此可見，催化AngⅡ?yàn)锳ng（1～7）是ACE2的主要保護(hù)機(jī)制。隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)ACE2參與多種肺部疾病的病理過程，在相同強(qiáng)度的致病因子打擊下（如膿毒血癥），ACE2基因敲除小鼠急性肺損傷比野生型小鼠更顯著，而給這兩種小鼠注射重組人ACE2均能夠減輕急性肺損傷的程度［15］。本研究中CIH2組1、2周組的肺組織病理損傷較輕，ACE2呈高表達(dá)，由此推測在疾病發(fā)生早期ACE2高表達(dá)是機(jī)體的一種代償性保護(hù)機(jī)制，而3、4周組肺組織病理損傷較重，AngⅡ含量顯著升高，ACE2顯著下降，提示間歇低氧作用下，ACE2的降低使血清中AngⅡ的降解減少，高水平的AngⅡ進(jìn)一步導(dǎo)致肺組織損傷。因此，ACE2是負(fù)性調(diào)節(jié)因子，對肺組織有顯著保護(hù)作用；而RAS系統(tǒng)中主要效應(yīng)因子AngⅡ則促進(jìn)間歇低氧肺損傷的發(fā)生、發(fā)展。

ACE2作為Apelin目前已知的唯一降解酶，對Apelin的體內(nèi)濃度變化具有重要影響。初步推測，在初期Apelin的表達(dá)下降可能與ACE2升高導(dǎo)致Apelin降解，后期又因ACE2下降時(shí)對Apelin降解減少，Apelin含量較前有所升高。臨床研究表明OSAHS患者血漿Apelin較健康對照組低；有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，低氧性肺動(dòng)脈高壓模型研究中肺組織Apelin表達(dá)在低氧第4周、第7周時(shí)上調(diào)［16］，再結(jié)合本研究間歇低氧肺損傷研究結(jié)果，推測在OSAHS相關(guān)肺損傷發(fā)展過程中，肺組織Apelin水平可能出現(xiàn)先低后高再低的過程，其高低水平變化可以作為機(jī)體肺組織疾病轉(zhuǎn)歸的一種變化。

綜上所述，本研究表明在慢性間歇性低氧肺損傷中出現(xiàn)RAS系統(tǒng)失衡，主要的損傷效應(yīng)因子AngⅡ隨間歇低氧暴露時(shí)間延長逐漸升高趨勢，Apelin蛋白呈先高后低表達(dá)趨勢，而ACE2呈先高后低變化，且ACE2作為Apelin目前已知的唯一降解酶，提示Apelin蛋白的變化可能與ACE2的降解及AngⅡ的變化關(guān)系密切并起重要作用。

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（編輯 國 榮）（編輯 卓選鵬）（編輯 卓選鵬）（編輯 卓選鵬）

R563

B

10.7652/jdyxb201602032

2015－06－30

2015－11－18

河北省重大醫(yī)學(xué)科研課題（No.zd2013091）Supported by Major Project of Medical Science of Hebei Province（No.zd2013091）

王紅陽.E－mail：tsmywhy@163.com