MicroRNA-218下調肝細胞癌中的E2F2基因表達抑制細胞增殖的研究

王濤　馬思聰　戚星星　湯曉寅　崔丹　王智　池嘉昌　李萍　翟博

200127　上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院腫瘤介入科

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·論著·

MicroRNA-218下調肝細胞癌中的E2F2基因表達抑制細胞增殖的研究

王濤馬思聰戚星星湯曉寅崔丹王智池嘉昌李萍翟博

200127上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院腫瘤介入科

【摘要】目的探討MicroRNA-218(miRNA-218)下調肝細胞癌中的E2F2基因表達，從而抑制細胞增殖的機制。方法從細胞庫中取得人類肝癌細胞株HepG2、Huh7、MHCC-97H、BEL-7402和正常肝細胞株L02。隨后進行細胞培養(yǎng)和轉移、反轉錄多聚酶鏈反應、免疫印跡分析、細胞增殖和集落形成試驗、細胞周期分析和相應的統(tǒng)計學處理。結果miR-218表達水平在癌細胞中下調。MTT生長曲線表明,當miR-218過度表達時(Huh7中的miR-218 P=0.001;在 MHCC-97中的miR-218 P=0.013)細胞增殖能力明顯降低。雙熒光素酶實驗證實，轉染了miRNA-218模擬物的細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，熒光酶報告基因含有E2F2野生型的第3′非翻譯區(qū)。這些結果表明E2F2是 miR-218的直接作用對象。與陰性對照組相比,轉染了miR-218 模擬物的Huh7和 MHCC-97細胞株中的E2F2的相對mRNA表達顯著下調(P<0.05)。結論miR-218通過直接作用于E2F2基因的第3′非翻譯區(qū)調節(jié)E2F2的表達，從而抑制HCC細胞增殖。

【關鍵詞】MicroRNA-218；肝細胞癌；E2F2基因；細胞增殖

MicroRNAs(miRNAs)可以有效調節(jié)各種生物過程,包括細胞增殖、遷移、分化和細胞凋亡。研究表明，miRNAs的調節(jié)異常與各種類型人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關，而miR-218與腫瘤發(fā)病機制和各種類型癌癥的形成相關[1-2]。miR-218的表達下調,可能作為細胞瘤、透明細胞性腎細胞癌和胃癌、鼻咽癌、宮頸癌、乳腺癌、口腔癌和小細胞肺癌的一種潛在的腫瘤抑制劑[3]。目前的研究都是基于假設與正常肝細胞相比，miR-218在肝癌細胞中表達下調,從而誘導細胞周期阻滯于G0/G1期檢查點，恢復miR-218可抑制細胞增殖[4]。本研究將在此基礎上進一步分析，旨在提供較為直接依據(jù)表明miR-218作用于E2F2來調節(jié)其在肝癌細胞中的表達。

資料和方法

一、細胞培養(yǎng)和轉移

從中國科學院(上海)的細胞庫中取得人類肝癌細胞株HepG2 Huh7,MHCC.97H BEL.7402和正常肝細胞株L02。將這些細胞株培養(yǎng)在37 ℃、二氧化碳濃度低于5%、含10%胎牛血清(Gibco.BRL)的良伊格爾培養(yǎng)基(Gibco.BRL,Invitrogen Life Technologies,卡爾斯巴德、CA、美國)中。miR-218的模擬物和陰性對照(NC) 購自上海GenePharma有限公司。根據(jù)制造商的指導說明，利用Lipofectamine 2000(生命表達載體技術)進行miRNA的瞬時轉染分析。

二、反轉錄多聚酶鏈反應(RT-qPCR)。

使用TRIzol試劑(英杰公司)從培養(yǎng)的細胞中提取RNA。測量miR-218的表達水平使用TaqMan MicroRNA反轉錄工具包(pplied Biosystems, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)合成互補脫氧核糖核酸。使用TaqMan微分析工具包(應用生物系統(tǒng)公司)測量miR-218和內(nèi)源性控制的U6的表達水平。使用7500 實時PCR系統(tǒng)(應用生物系統(tǒng)公司)、SYBR Premix Ex Taq(豆類生物技術有限公司)并以β-actin作為內(nèi)部控制進行RT-qPCR實驗分析。引物由GeneCore生物技術有限公司(上海)設計并合成，序列如下:E2F2開頭,5′CGT CCC TGA GTT CCC AAC C3′和反向序列,5′GCG AAG TGT CAT ACC GAG TCT T3′; 和β-actin開頭,5′AGG CAC CAG GGC GTG AT3′和反向序列,5′TGC TCC CAG TTG GTG ACG AT3′。每個樣本一式3份。

三、免疫印跡分析

使用放射免疫沉淀法從細胞中提取蛋白質，并用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。使用8% 的SDS-PAGE分離等量的蛋白質，然后將其轉移到聚偏氟乙烯膜中。加入5%脫脂奶阻滯后,細胞膜用兔抗人E2F2多克隆抗體(1∶200;sc-632;Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)在4 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)整夜。隨后用吐溫20(TBST;Sigma-Aldrich)0.9%氯化鈉溶液(Affymetrix公司)沖洗,在室溫下，用辣根過氧化物酶標記的二級山羊抗兔免疫球蛋白G抗體 (1∶1 000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)培養(yǎng)1 h。用TBST再次清洗，可用化學發(fā)光法檢測到蛋白帶。使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)捕捉數(shù)字圖像。β-actin被用作蛋白質加載控制劑。蛋白質片段的濃度使用Quantity One軟件4.5.0版本測量獲得。

四、細胞增殖和集落形成試驗

用MTT法檢測細胞增殖，然后分別將Huh7和MHCC-97H轉染NC-miR-218基因48 h,將細胞培養(yǎng)在96個孔中，每個孔中放入3000個細胞。然后將細胞分別培養(yǎng)12、24、36和48 h,在每個孔中加入20 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h,將細胞溶解在150 μL二甲亞砜中，490 nm測量吸光度評估細胞增殖。針對集落形成試驗,將400個細胞放置到6個培養(yǎng)井中，并在37 ℃培養(yǎng),直到細胞增長到可見的菌落。使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗該菌落兩次,使用甲醇(Sigma-Aldrich)固定和用0.1%結晶紫(Sigma-Aldrich)標記,然后統(tǒng)計每口井中的菌落數(shù)量。所有實驗執(zhí)行三次。

五、細胞周期分析

Huh7和 MHCC-97H細胞培養(yǎng)在60 cm的培養(yǎng)皿中，并分別用NC、miR-218放置一夜。PBS洗滌3次,在37 ℃的環(huán)境下，將這些細胞培養(yǎng)在100 μL核糖核酸酶(南京凱基生物技術有限公司)中30 min，并在400 μL 碘化丙啶(南京凱基生物技術有限公司)中額外浸染30 min。然后使用BD FACSCalibur細胞分析儀(BD生物科學,富蘭克林湖,新澤西,美國)對樣品進行細胞周期分析。

六、雙熒光素酶實驗。

使用MicroRNA的目標預測工具米蘭達(http://www.microrna.org)評估m(xù)iR-218的目標基因。為了檢測E2F2是否為miR-218的直接下游靶基因，進行了雙熒光素酶報告分析實驗。E2F2野生型(WT)的第3非翻譯區(qū)，包含miR-218的潛在結合位點和相應E2F2的突變第3′非翻譯區(qū)被克隆到psiCheck2雙熒光素酶報告基因中。將Hug7細胞暫時轉染含有第3′非翻譯區(qū)的報告基因，使用Pikkagene雙熒光素酶報告實驗系統(tǒng)(TOYOB-Net有限公司,東京,日本)報告后轉錄miR-218模擬物及陰性對照48 h后的熒光素酶活性。

七、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。對兩組之間的差異性進行分析,并在超過兩組以上分別使用t檢驗和單因素方差分析。所有統(tǒng)計分析進行雙側檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、miR-218表達在人肝癌細胞株中下調

在進行RT-qPCR實驗以確定miRNA在四個肝癌細胞系(Huh7、MHCC-97H、HepG2和BEL-7402)中的表達,并與在人類正常肝細胞株(L02)的表達相對比。如圖1所示,miR-218在人類肝癌細胞中的表達水平顯著下調。此外,與HepG2和BEL-7402細胞相比，Huh7和 MHCC-97H細胞中的miR-218表達水平更低。這些結果表明miR-218可用于抑制肝癌細胞。

二、miR-218抑制HCC細胞的增殖

如圖2所示,通過MTT法測量細胞活性。 MTT生長曲線表明,當miR-218過度表達時(Huh7中的miR-218P=0.001;在 MHCC-97中的miR-218P=0.013)細胞增殖能力明顯降低。此外, 菌落集落形成試驗表明,轉染了miR-218模擬物的細胞菌落數(shù)量明顯低于未轉染者。

三、miR-218誘導細胞周期(G0/G1階段)停滯

流式細胞術分析表明,在G0/G1階段轉染了miR-218的 Huh7 和MHCC-97H細胞的百分比分別為16%(Huh7)和13%(MHCC-97H)，明顯高于陰性對照組,這與在S期細胞比例分別削減18%(Huh7)和23%(MHCC-97H)相一致。雙熒光素酶實驗證實，轉染了miR-218模擬物的細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，螢光素酶報告基因含有 E2F2基因的WT 第3′非翻譯區(qū)。這些結果表明E2F2是 miR-218的直接作用對象。與陰性對照組相比,轉染了miR-218 模擬物的Huh7和 MHCC-97細胞株中的E2F2相對mRNA表達顯著下調(P<0.05)。這與RT-qPCR的結果相一致,免疫印跡分析表明，轉染了miR-218的Huh7和MHCC-97細胞中的E2F2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3。

A:miRNA-218在Huh7、MHCC-97H、HepG2、BEL-7402中的表達;B:Huh7細胞中的miR-218表達水平C:MHCC-97H細胞中的miR-218表達水平；*P<0.05，**P<0.01

圖1miRNA-218在四個肝癌細胞系(Huh7、MHCC-97H、HepG2、BEL-7402)中的表達

A:Huh7和MHCC-97H細胞中的miR-218 在490 nm吸光值；B:Huh7和MHCC-97H細胞中的miR-218拷貝數(shù)

A:Huh7和MHCC-97H細胞中的E2F2基因表達水平；B:Huh7和MHCC-97H細胞中的E2F2基因表達水平(Western-blot)；C:Huh7和MHCC-97H細胞中的E2F2蛋白表達水平

圖3MicroRNA-218下調肝細胞癌中的E2F2基因表達

討論

普遍認為miRNAs可以調節(jié)多種生物進程,包括腫瘤。目前的研究表明了miR-218在肝癌細胞中的表達及如何在分子機制上發(fā)揮它們的功能[5,6]。本研究結果表明,miR-218表達水平在肝癌細胞中下調,這與以前的研究結果一致[7]。本研究選取Huh7和MHCC-97H細胞，進行MTT和集落形成試驗，結果顯示，轉染了miR-218模擬物的肝癌細胞與對照組相比，表現(xiàn)出較弱的增殖能力。此外,發(fā)現(xiàn)miR-218的過度表達誘導細胞周期阻滯于G0 / G1期。因此推斷miR-218有腫瘤抑制功能。為了進一步分析miR-218抑制肝癌細胞增殖的分子機制，本研究進行了基于生物信息學的預測和雙熒光素酶報告實驗,E2F2被確定為miR-218的直接作用對象。RT.qPCR和免疫印跡分析結果顯示，miR-218的上調可以下調E2F2的 mRNA和蛋白表達水平。這些結果表明，miR-218通過直接作用于E2F2基因的第3′非翻譯區(qū)調節(jié)E2F2的表達，從而抑制肝癌細胞的增殖。

作為主要的細胞周期調控劑，E2F蛋白質在細胞周期信號轉導通路的下半游起作用，對細胞周期進展中的細胞增殖及生長起至關重要的作用。E2F2作為 E2F的一種,激活E2F靶基因的轉錄和調控G1 / S段相變。在正常的細胞周期控制中，細胞周期蛋白質依賴激酶類(CDKs)的磷酸化作用是至關重要的,其導致Rb類蛋白質的磷酸化[7-9]。Rb隨后激活E2Fs并允許G1 / S的相變[10,11]。有研究報道m(xù)iR-218抑制結腸癌中CDK4的表達?；谶@些因素,可以假設miR-218調節(jié)E2F2的表達;這種調節(jié)不僅通過直接針對E2F2起作用，還通過抑制CDK4的表達,還需要進一步的研究來驗證這個假設。

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(本文編輯：易玲)

Study on microRNA-218 inhibiting proliferation of hepatocellular carcinoma cell by down-regulating E2F2 gene expression

WANGTao,MASi-cong,QIXing-xing,TANGXiao-yin,CUIDan,WANGZhi,CHIJia-chang,LIPing,ZHAIBo.

DepartmentofInterventionalOncology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism for microRNA-218 (miR-218) dampening E2F2 gene expression to inhibit proliferation in hepatocellular carcinoma (HCC). MethodsHCC cell lines (HepG2, Huh7, MHCC.97H and BEL.7402) and normal hepatocyte cell line L02 were obtained from cell bank, which were subjected for reverse transcription-polymerase chain reaction, immunoblot analysis, cell proliferation and colony formation test, cell cycle analysis and relevant statistics analysis. ResultsThe miR-218 level was down-regulated in cancer cells (P<0.05). The growth curve of MTT indicated that proliferative capacity of cells was significantly reduced in miR-218-overexpressed cells (Huh7: P=0.001; MHCC.97: P=0.013). These results revealed that E2F2 was the direct target of miR-218. In comparison to control group of L02, the relative mRNA of E2F2 in Huh7 and MHCC.97 cell lines transfected with the stimulant of miR-218 was significantly down-regulated (P<0.05). ConclusionmiR-218 can directly act on the 3' untranslated region of E2F2 gene to inhibit the development of HCC.

【Key words】MicroRNA-218; Hepatocellular carcinoma; E2F2; Cell proliferation

(收稿日期：2015-10-15)

Corresponding author:ZHAI Bo, Email:zhaiboshi@sina.com

通信作者：翟博，Email：zhaiboshi@sina.com

基金項目：國家自然科學基金(青年項目，81201678)；國家自然科學基金(面上項目，81472845)