固本防哮飲對(duì)幼齡小鼠哮喘緩解期模型IKK/IκB/NF-κB信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用

袁雪晶， 曹建梅， 許慧潔

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京210029）

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固本防哮飲對(duì)幼齡小鼠哮喘緩解期模型IKK/IκB/NF-κB信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用

袁雪晶， 曹建梅， 許慧潔

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京210029）

摘要:目的 觀察固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠IKK/IκB/NF-κB信號(hào)途徑的影響。方法 采用幼齡BALB/c小鼠，雞卵蛋白腹腔注射和霧化吸入致敏，并多次霧化吸入激發(fā)的方法建立幼齡哮喘緩解期小鼠模型。造模成功后給藥4周，測(cè)小鼠氣道阻力、HE染色觀察小鼠肺組織病理變化、肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類(lèi)、Western b1ot法檢測(cè)肺組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞中IκB激酶β（IKKβ）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、核因子-κB（NF-κB）P65蛋白表達(dá)。結(jié)果 固本防哮飲可以降低幼齡哮喘緩解期小鼠的氣道阻力、降低肺泡灌洗液（BALF）中細(xì)胞總數(shù)，降低BALF中中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例（P＜0.05，P＜0.01），改善支氣管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)，減輕氣道重塑，并能增加肺組織和

關(guān)鍵詞:固本防哮飲；哮喘緩解期；氣道高反應(yīng)性；炎性細(xì)胞侵潤(rùn)；IKK/IκB/NF-κB通路

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.038

支氣管哮喘是一種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)以及細(xì)胞因子共同參與的慢性氣道非特異性炎癥性疾患，是兒童時(shí)期的多發(fā)病、常見(jiàn)病，此病的發(fā)病率正逐年上升［1-2］。目前尚無(wú)能夠根治哮喘的藥物，中醫(yī)藥治療哮喘具有良好療效［3-4］。固本防哮飲處方是著名兒科專(zhuān)家江育仁教授針對(duì)哮喘緩解期治療的經(jīng)驗(yàn)方，前期多中心隨機(jī)對(duì)照研究已證實(shí)其臨床應(yīng)用能夠延長(zhǎng)哮喘緩解天數(shù)，減少哮喘發(fā)作次數(shù)，改善患兒生存質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)其能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體Th1/Th2細(xì)胞的平衡，減輕氣道炎癥和氣道重塑［5-6］。

近來(lái)許多研究表明，核因子-κB（nuc1ear factor kaPPaB，NF-κB）通路可介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞的增殖、分化和炎癥因子的產(chǎn)生［7］。這條通路的活化與炎癥性的自身免疫性疾病相關(guān)，包括支氣管哮喘［8］。NF-κB抑制蛋白（inhibitor of nuc1ear factor kaPPa-B，IκB）可以抑制NF-κB的活性［9-10］。IκB激酶家族（the IkaPPaB kinases，IKKs）作為NF-κB信號(hào)途徑的關(guān)鍵成員，能解除IκB對(duì)NF-κB的抑制，激活參與應(yīng)激反應(yīng)和免疫細(xì)胞活化、增殖、分化、凋亡等多種相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。

本次研究中我們使用幼齡BALB/c小鼠，采用卵蛋白致敏引起的慢性過(guò)敏性氣道炎癥哮喘模型，觀察固本防哮飲對(duì)哮喘模型小鼠氣道反應(yīng)性、BALF炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺臟組織病理學(xué)以及對(duì)IKK/IκB/NF-κB信號(hào)途徑的影響。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)BALB/c雌性小鼠，3～4周齡，體質(zhì)量13～20 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證: SCXK（滬）2009-0001。適應(yīng)飼養(yǎng)3 d。

1.1.2 藥物 固本防哮飲由炙黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、煅牡蠣、蟬蛻、陳皮、防風(fēng)、辛夷、五味子和生甘草11味藥組成，將上述11味藥按比例5∶3.3∶3.3∶3.3∶5∶2∶2∶1∶2∶2∶1配伍，然后取8倍量冷水浸藥30 min，煎30 min（沸后），濾過(guò)；第2煎加6倍量水煎30 min，將2次煎液濾過(guò)，合并濃縮調(diào)至含生藥2 g/mL的溶液，密封于無(wú)菌量瓶，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｋ幬镉山K省中醫(yī)院藥劑科加工制備和質(zhì)控。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 卵蛋白（OVA）（批號(hào)0009006591）、氯化乙酰膽堿（批號(hào)137751）、硫酸鉀鋁（批號(hào)1416173）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizo1（批號(hào)15596-026）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PMSF（苯甲基磺酰氟）、AProtinin購(gòu)自南京生興生物技術(shù)公司；蛋白定量試劑盒（Bio-Rad DC Protein Assay Kit）為Bio-Rad公司產(chǎn)品；GAPDH抗體（批號(hào)KC-5G5）購(gòu)自美國(guó)Stanta cruz公司；過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)KPL公司；ECL購(gòu)自瑞典Amersham公司；IKKβ Antibody（批號(hào)2684）、IκBαAntibody（批號(hào)9242）、NF-κB P65（C22B4）RabbitmAb（批號(hào)4764）購(gòu)自美國(guó)CST公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（批號(hào)2J162J16）、甘氨酸（批號(hào)2L262L26）、丙烯酰胺（批號(hào)2E252E25）、雙丙烯酰胺（批號(hào)9F039F03）、十二烷基硫酸鈉（SDS）（批號(hào)9L212C09）、過(guò)硫酸銨（批號(hào)0J110J11），以上試劑均購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖（批號(hào)0000190547）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；脫脂奶粉（批號(hào)2048823）購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.2 儀器 動(dòng)物肺功能體描箱、呼吸機(jī)及AniRes 2005軟件分析系統(tǒng)均由北京鑫奧成科技有限公司提供；S-888E型超聲霧化器由南京道芬電子有限公司生產(chǎn)，配套裝置是一個(gè)體積約22 cm×22 cm×50 cm的有機(jī)玻璃盒；C1iniBio 128D型酶標(biāo)儀為奧地利ASYS Hitech公司產(chǎn)品；SORVALL低溫離心機(jī)為德國(guó)Biofuge stratos公司產(chǎn)品。JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)為寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；Western電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；病理石蠟切片機(jī)為德國(guó)（SLEE）MNT公司產(chǎn)品；醫(yī)用X光片購(gòu)自美國(guó)Kodak公司；電轉(zhuǎn)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；Power Pac Basic凝膠成像及分析系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；垂直平板微電泳槽、直流穩(wěn)壓電泳儀為北京市六一儀器廠產(chǎn)品；

1.3 動(dòng)物造模方法 幼齡小鼠哮喘緩解期模型建立:參考文獻(xiàn)及前期實(shí)驗(yàn)方法，略加改進(jìn)［6，11-12］。采用BALB/c乳鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3 d后，除正常組外，小鼠予腹腔注射卵蛋白致敏，卵蛋白用硫酸鉀鋁混合，在第1天和第11天致敏（OVA 100 μg/只），同時(shí)第11天霧化吸入卵蛋白（5 mg/m L）30 min致敏，從第19日開(kāi)始，小鼠放入霧化器的有機(jī)玻璃盒中，以卵蛋白（1 mg/mL）霧化吸入30 min激發(fā)，每2周為一個(gè)激發(fā)周期，每個(gè)激發(fā)周期激發(fā)2次，2次激發(fā)為連續(xù)2日，共完成6個(gè)激發(fā)周期，第90日為末次激發(fā)。對(duì)照組小鼠以生理鹽水致敏和激發(fā)。

1.4 分組和給藥 末次激發(fā)后第2天，將模型小鼠隨機(jī)分為4組，即模型組和固本防哮飲6.5、13、26 g（生藥）/kg組。受試藥物從第90日開(kāi)始給藥，每日灌胃1次，共給藥28日。正常組和模型組均以等體積的0.9％的氯化鈉溶液灌胃。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 氣道反應(yīng)性測(cè)定 使用小動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)測(cè)定乙酰膽堿激發(fā)的氣道高反應(yīng)性［12-13］。小鼠末次給藥24 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，分離氣管，剪開(kāi)一小口，插入一2 mm塑料管，固定插管，連接于動(dòng)物肺功能儀；用4號(hào)頭皮針做尾靜脈穿刺，并連接含乙酰膽堿的注射器備用；將小鼠置于密閉的體描箱中，按呼吸頻率90次/min、潮氣量5～6 mL/kg調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)；等小鼠氣道壓力穩(wěn)定后，從低劑量逐漸遞增尾靜脈給予乙酰膽堿（11、33、100、300 μg/mL）0.1 mL；記錄每次給予相應(yīng)劑量的乙酰膽堿后5 s到1 min的數(shù)據(jù)，利用AniRes 2005分析軟件計(jì)算最大肺阻力（RL）。

1.5.2 肺泡灌洗液（BALF）中細(xì)胞計(jì)數(shù) 在環(huán)狀軟骨上用血管鉗固定氣管，其下做橫行切口，26G針頭置入，固定，用0.4 mL PBS進(jìn)行肺泡灌洗，每次灌洗后立即回收BALF置于離心管中，計(jì)回收率，于4℃儲(chǔ)存，2 h內(nèi)作細(xì)胞分離。BALF于1 000×g離心10 min，上清液置-70℃保存。沉淀細(xì)胞重懸，吹打均勻后取0.1 mL于血細(xì)胞計(jì)數(shù)臺(tái)測(cè)定細(xì)胞總數(shù)，取0.2 mL涂片、甲醇固定、Wright's染色的方法計(jì)數(shù)，至少數(shù)200個(gè)細(xì)胞作細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。

1.5.3 肺組織病理學(xué)觀察 行支氣管肺泡灌洗后，打開(kāi)胸腔，取右側(cè)肺組織4％多聚甲醛固定，酒精脫水，石蠟切片后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察氣道壁厚度和肺組織的炎性改變等病理變化。取左側(cè)肺組織進(jìn)行蛋白檢測(cè)。

1.5.4 小鼠肺組織IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白檢測(cè)

采用Western b1ot法檢測(cè)小鼠肺組織IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白表達(dá)。用10倍體積于組織體積的RIPA裂解液對(duì)組織進(jìn)行勻漿，收集上清液，用BCA法測(cè)定蛋白水平，將蛋白統(tǒng)一稀釋成3 mg/mL，再加入3×1oading buffer及1/20體積的巰基乙醇，制成蛋白上樣液，沸水浴5 min后，-20℃冰箱凍存。用該樣品進(jìn)行Western b1ot檢測(cè)，點(diǎn)樣前均要再沸水浴5 min。取30 μL樣品，進(jìn)行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳。待分離膠凝集后，配制5％濃縮膠。倒入5％濃縮膠后，插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。待膠凝集好后，上樣，進(jìn)行電泳分離蛋白，上層膠用85 V電壓電泳，當(dāng)樣品至分離膠時(shí)，改用130 V電壓電泳。一般電泳時(shí)間在1.5 h左右。然后將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上，半干法轉(zhuǎn)膜。PVDF膜在5％的Mi1k（TBST溶解）封閉液中室溫?fù)u動(dòng)2 h。按相應(yīng)比例稀釋好相應(yīng)抗體，將稀釋好的抗體和膜一起孵育，4℃冰箱過(guò)夜。用TBST（Tris鹽緩沖液含0.05％ Tween-20）洗一抗，洗滌3次，每次5 min。孵育相應(yīng)二抗（按1∶5 000，用TBST溶解）3 h（搖床）。用TBST洗二抗，洗滌3次，每次5 min。將ECL的A和B兩種試劑吸出，在EP管內(nèi)等體積混合，然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應(yīng)1～2 min后，將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后轉(zhuǎn)移到在X片夾中預(yù)先鋪好的保鮮膜上一側(cè)，把另一側(cè)翻過(guò)來(lái)蓋在其上。根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，然后顯影、定影，掃描膠片，分析結(jié)果。

1.5.5 小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白檢測(cè) 小鼠眼眶取血，肝素抗凝，離心分離血漿后，將全血用Hank's液倍比稀釋?zhuān)捎肍ico11密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。將稀釋后的全血緩慢疊加于分離液上，保持液體界面清晰，水平離心（2 000 r/min）20 min，吸取中間白色單個(gè)核細(xì)胞層，Hank's液洗滌2次，用Hank's液重懸，臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)，使細(xì)胞計(jì)數(shù)為1× 106/mL。超聲破碎細(xì)胞，提取總蛋白，用Western b1ot法測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白水平（方法同“1.5.4”項(xiàng)）。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)推斷進(jìn)行單因素方差分析，并運(yùn)用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠氣道反應(yīng)性的影響 肺功能檢測(cè)結(jié)果顯示各組小鼠的肺阻力（RL）基礎(chǔ)值無(wú)明顯差異。氯化乙酰膽堿激發(fā)后模型組氣道阻力顯著高于正常對(duì)照組，固本防哮飲可以劑量依賴(lài)性降低氯化乙酰膽堿激發(fā)后小鼠肺阻力（RL）（P＜0.05，P＜0.01），降低氣道反應(yīng)性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠氣道反應(yīng)性（RL）的影響［±s，n=5，cmH20/（mL·s），1 cmH20=0.1 k Pa］

表1　固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠氣道反應(yīng)性（RL）的影響［±s，n=5，cmH20/（mL·s），1 cmH20=0.1 k Pa］

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

11　33　100　300正常對(duì)照組　　—　1.48±0.46　1.80±0.42*　2.31±1.10**　3.05±2.61**　3.78±2.92**模型組　　—　1.42±0.72　6.69±4.29　13.43±6.47　16.85±5.49　19.80±4.21固本防哮飲低劑量組　6.5　1.48±0.39　3.29±1.36　5.59±1.83*　9.87±2.68*　13.56±2.85*固本防哮飲中劑量組　13　1.33±0.37　2.57±1.63　2.98±1.40**　6.33±4.00**　10.61±3.52**固本防哮飲高劑量組　26　1.34±0.31　2.07±0.62*　2.53±0.37**　3.33±1.11**　5.84±2.19組別　　劑量/ （g·kg-1）乙酰膽堿/（μg·mL-1）0 **

3.2 對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類(lèi)的影響 模型組小鼠細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于正常對(duì)照組，且細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)中，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞也顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。固本防哮飲可以降低BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞百分率（P＜0.05，P＜0.01），提示給予固本防哮飲后，可以減輕模型小鼠的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠肺組織病理改變的影響 對(duì)照組小鼠肺臟未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管壁完整，黏膜未見(jiàn)充血水腫，管壁和平滑肌厚度正常；而模型組小鼠肺臟可見(jiàn)氣道上皮不完整，氣道黏膜水腫明顯及平滑肌增生、增厚，周?chē)?jiàn)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主。給予固本防哮飲后，小鼠肺臟病理改變顯著改善，氣道黏膜水腫明顯減輕，平滑肌厚度顯著減小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也顯著減輕，表明固本防哮飲可以改善哮喘小鼠的氣道病理進(jìn)展。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2　固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠BA L F細(xì)胞計(jì)數(shù)以及細(xì)胞分類(lèi)的影響（±s，n=5）

表2　固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠BA L F細(xì)胞計(jì)數(shù)以及細(xì)胞分類(lèi)的影響（±s，n=5）

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/ （g·kg-1）炎性細(xì)胞總數(shù)/ （×104·mL-1）　　中性粒細(xì)胞/％　　嗜酸性粒細(xì)胞/％　　淋巴細(xì)胞/％　　單核細(xì)胞/％正常對(duì)照組　　—　42.40±14.29**　9.36±3.48*　2.28±0.39*　65.70±9.99　0.86±0.38*模型組　　—　78.80±11.90　20.80±11.42　3.94±1.43　61.48±11.65　 11.76±7.32固本防哮飲低劑量組　6.5　51.60±19.23*　12.88±7.66　4.96±5.08　53.10±14.00　1.80±1.14*固本防哮飲中劑量組　13　35.20±16.10**　13.98±7.13　4.34±2.65　45.66±7.14　2.80±1.18*固本防哮飲高劑量組　26　49.00±23.09*　11.38±2.99*　2.90±0.83　69.04±18.11　2.58±2.46*

圖1　各組小鼠肺組織HE染色病理圖片（×2 0 0）

3.4 對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠肺IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白表達(dá)的影響 采用Western b1ot法對(duì)各組IKKβ、IκBα、NF-κB P65（C22B4）蛋白表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)分子質(zhì)量為87、39、65、36 kDa區(qū)域分布出現(xiàn)目的條帶，分別是IKKβ、IκBα、NF-κB P65（C22B4）和內(nèi)參GAPDH（見(jiàn)圖2）。

1.正常對(duì)照組 2.模型組 3固本防哮飲低劑量組4.固本防哮飲中劑量組 5.固本防哮飲高劑量組圖2　各組肺組織IKKβ、IκBα、NF-κBp 6 5 （C22B4）蛋白表達(dá)

通過(guò)對(duì)目的條帶的定量分析，模型組和正常對(duì)照組比較IKKβ、NF-κB P65（C22B4）表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），IκBα表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，固本防哮飲中、高劑量組IKKβ表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；固本防哮飲各劑量組NF-κB P65（C22B4）表達(dá)均顯著降低，其中固本防哮飲中、高劑量組降低更為明顯（P＜0.01）；而固本防哮飲中、高劑量組IκBα表達(dá)量增加（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.5對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中IKKβ、IκBα、NF-κB P65 (C22B4)蛋白表達(dá)的影響 采用Western b1ot法對(duì)各組IKKβ、IκBα、NF-κB P65（C22B4）蛋白表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)分子質(zhì)量為87、39、65、36 kDa區(qū)域分布出現(xiàn)目的條帶，分別是IKKβ、IκBα、NF-κB P65

（C22B4）和內(nèi)參GAPDH（見(jiàn)圖3）。

1.正常對(duì)照組 2.模型組 3.固本防哮飲低劑量組4.固本防哮飲中劑量組 5.固本防哮飲高劑量組圖3　各組外周血單個(gè)核細(xì)胞中I KKβ、IκBα、NF-κB p65（C22B4）蛋白表達(dá)

通過(guò)對(duì)目的條帶的定量分析，模型組和正常對(duì)照組比較IKKβ、NF-κB P65（C22B4）表達(dá)均明顯增高（P＜0.01），IκBα表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。給藥后與模型組比較，固本防哮飲低、中、高3個(gè)劑量組IKKβ表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；固本防哮飲中、高劑量組NF-κB P65 （C22B4）表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；而固本防哮飲高劑量組IκBα表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

為了制備一種更符合兒童哮喘特點(diǎn)的哮喘模型來(lái)開(kāi)展研究，此次試驗(yàn)選用幼齡小鼠造模，建立幼齡小鼠哮喘緩解期模型。目前哮喘發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，氣道慢性炎癥以及炎癥導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)性和氣道重塑是哮喘的基本病理特征［13-14］。本次實(shí)驗(yàn)肺功能分析結(jié)果顯示，模型小鼠氣道阻力顯著高于正常對(duì)照組，而固本防哮飲可以降低小鼠氣道RL值，降低模型小鼠的氣道高反應(yīng)性。模型小鼠的BALF中炎性細(xì)胞總數(shù)明顯升高，細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)中以嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例升高為主，表明哮喘緩解期小鼠氣道炎癥仍然存在，固本防哮飲可以降低模型小鼠BALF中炎性細(xì)胞總數(shù)，降低中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞百分率，來(lái)減輕氣道慢性炎癥。肺臟病理學(xué)觀察表明模型組小鼠氣道壁炎性浸潤(rùn)并存在明顯增生，而固本防哮飲可以顯著減輕肺臟支氣管壁周?chē)仔越?rùn)和氣道壁增生、增厚，改善氣道重塑。

表3　固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠肺組織中IKKβ、IκBα、NF-κBp 6 5（C 2 2 B 4）相對(duì)光密度值的影響（±s，n=5）

表3　固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠肺組織中IKKβ、IκBα、NF-κBp 6 5（C 2 2 B 4）相對(duì)光密度值的影響（±s，n=5）

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/（g·kg-1）　IKKβ/GAPDH　IκBα/GAPDH　NF-κB P65（C22B4）/GAPDH正常對(duì)照組模型組固本防哮飲低劑量組固本防哮飲中劑量組固本防哮飲高劑量組—1.494±0.110*　2.783±0.267**　1.861±0.560*2.714±0.470　1.350±0.380　2.945±0.154 6.5　2.028±0.153　1.942±0.484　2.478±0.190*13　1.610±0.019*　2.043±0.106*　1.704±0.191**26　1.560±0.454*　2.909±0.724*　1.502±0.228 —**

表4　固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中I KKβ、IκBα、NF-κB p 6 5（C 2 2 B 4）相對(duì)光密度值的影響（±s，n=5）

表4　固本防哮飲對(duì)幼齡哮喘緩解期小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中I KKβ、IκBα、NF-κB p 6 5（C 2 2 B 4）相對(duì)光密度值的影響（±s，n=5）

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/（g·kg-1）　IKKβ/GAPDH　IκBα/GAPDH　NF-κB P65/GAPDH正常對(duì)照組模型組固本防哮飲低劑量組固本防哮飲中劑量組固本防哮飲高劑量組0.509±0.035**　1.070±0.107*　0.423±0.114**—1.123±0.067　0.603±0.186　1.242±0.270 6.5　0.807±0.073**　0.706±0.103　1.001±0.248 13　0.733±0.084**　0.890±0.271　0.758±0.125*26　0.626±0.036**　1.113±0.163*　0.533±0.154 —*

NF-κB通路在控制宿主免疫、炎癥反應(yīng)和調(diào)控細(xì)胞增殖、生存的基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，是已知最重要、最萬(wàn)能的信號(hào)網(wǎng)代表之一。在哺乳動(dòng)物中，NF-κB家族包含五個(gè)相應(yīng)成員: Re1（也稱(chēng)為c-Re1）、Re1A（也稱(chēng)為P65）、Re1B、P50（編碼的NF-κB1基因）和P52（編碼的NF-κB2基因）。這些蛋白相互作用形成具有轉(zhuǎn)錄活性的二聚體或異質(zhì)二聚體家族。這五個(gè)蛋白都有Re1同源域（RHD），在二聚作用和DNA捆綁中發(fā)揮作用。RHD羧基端有一個(gè)核定位序列（NLS），轉(zhuǎn)錄激活功能就是由NF-κB蛋白羧基端露出RHD介導(dǎo)的［15］。

IκB能夠控制NF-κB信號(hào)途徑。目前發(fā)現(xiàn)IκBs家族有9個(gè)成員: IκBα、IκBβ、IκBε、IκBζ、bc1-3、IκBNS、P100、P105和新近發(fā)現(xiàn)的IκBη。不同IκB蛋白與不同的NF-κB亞基結(jié)合，發(fā)揮不同的生理功能［15-17］。IκBα主要介導(dǎo)NF-κB的基礎(chǔ)抑制，是IκB家族中降解速度最快，抑制NF-κB活性的最重要成分［18-19］。靜息細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中NF-κB（通常是P65與P50異質(zhì)二聚體）與IκBα組成復(fù)合體。NF-κB與IκB在細(xì)胞中的平衡狀態(tài)會(huì)被細(xì)胞外的快速特異性的信號(hào)打破。IκBs有一個(gè)錨蛋白重復(fù)序列域（ARD），是由6到7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列組成的，能夠捆綁到P65的RHD，掩蓋NLS。NF-κB激活有兩方面:通過(guò)蛋白媒體的信號(hào)依賴(lài)的磷酸化和泛素依賴(lài)的IκBα降解及降解后的以細(xì)胞核為靶目標(biāo)的NF-κB P65 NLS釋放。除了IκBα介導(dǎo)的NF-κB同源DNA位點(diǎn)的剝奪，這個(gè)過(guò)程的許多方面依賴(lài)于所有涉及蛋白的折疊狀態(tài)的改變來(lái)改變轉(zhuǎn)錄。經(jīng)典IκB家族，像IκBα典型蛋白，通過(guò)掩蓋NF-κBNLS，使他們的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞質(zhì)中被隔絕，從而抑制NF-κB與DNA的結(jié)合。NLS可接近性受IκBα降解控制，一旦NLS可接近，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控他們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄的作用［15，19］。

IKK復(fù)合體是NF-κB活化作用的信號(hào)整合中心，由兩個(gè)絲氨酸-蘇氨酸激酶（IKKαand IKKβ）和調(diào)節(jié)亞單位NEMO（又稱(chēng)為IKKγ）組成。IKK復(fù)合體整合來(lái)自所有NF-κB活化刺激信號(hào)，并催化各種各樣的IκB和NF-κB蛋白的磷酸化［20］。盡管IKKα和IKKβ在結(jié)構(gòu)和生化方面有相似之處，但是他們有不同的亞細(xì)胞位點(diǎn)和磷酸化靶點(diǎn)，因而表現(xiàn)不同的生理病理學(xué)作用。IKKβ主要存在于細(xì)胞質(zhì)，IKKα在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭［21］。IKKβ的作用靶點(diǎn)是IκB兩個(gè)鄰近絲氨酸殘基，導(dǎo)致IκB的泛素化和蛋白降解，隨后釋放和激活NF-κB。炎癥因子IL-1、TNFα、內(nèi)毒素（脂多糖）、病毒感染、雙鏈RNA以及物理信號(hào)如紫外線輻射等刺激會(huì)導(dǎo)致IKKβ活化和隨后的NF-κB信號(hào)途徑的激活［22-23］。

實(shí)驗(yàn)中我們采用肺組織和外周血兩方面來(lái)研究哮喘和藥物對(duì)IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路所產(chǎn)生的影響，分別反映哮喘及固本防哮飲對(duì)機(jī)體局部和整體免疫功能的作用。在幼齡哮喘緩解期小鼠肺組織中IκBα表達(dá)顯著降低（P＜0.01），IKKβ、NF-κB P65（C22B4）表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），固本防哮飲能夠增加IκBα表達(dá)量，降低IKKβ、NF-κB P65 （C22B4）的表達(dá)，尤其是中高劑量組作用顯著（P＜0.05，P＜0.01）。在外周血單個(gè)核細(xì)胞中，IκBα表達(dá)也顯著降低（P＜0.05），IKKβ、NF-κB P65（C22B4）表達(dá)均明顯增高（P＜0.01），固本防哮飲高劑量組能顯著增加IκBα表達(dá)量（P＜0.05），而固本防哮飲各劑量組均能顯著降低IKKβ的表達(dá)（P＜0.01）；中高劑量組能顯著降低NF-κB P65 （C22B4）的表達(dá)（P＜0.05）。提示幼齡哮喘緩解期小鼠模型中存在IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路功能異常，中藥效方固本防哮飲治療哮喘可能的機(jī)制是通過(guò)調(diào)控IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即增加IκBα的表達(dá)，并抑制IKK、NF-κB的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮其抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用。

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中圖分類(lèi)號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0409-06

作者簡(jiǎn)介:袁雪晶（1976—），女，副教授，副主任醫(yī)師，博士，主要從事兒童呼吸系統(tǒng)和免疫相關(guān)性疾病的研究。Te1: 13913893416，E-mai1: yuanxuejing2007@126.combook=410,ebook=188外周血單個(gè)核細(xì)胞中IκBα表達(dá)量（P＜0.01，P＜0.05），降低肺組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞中IKKβ（P＜0.05，P＜0.01）、NF-κB P65（P＜0.01，P＜0.05）的高表達(dá)。結(jié)論 固本防哮飲降低氣道高反應(yīng)性，減輕支氣管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及調(diào)節(jié)機(jī)體IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的功能失調(diào)可能是其防止哮喘復(fù)發(fā)的作用機(jī)制。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金-青年基金（81102615）；江蘇省科技廳-自然基金項(xiàng)目（BK2011868）；康緣中醫(yī)藥科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（HZ1008KY）

收稿日期:2014-09-25