基于HepG2體外細(xì)胞培養(yǎng)的旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝

黃一凡， 王 帥，2，3， 孟憲生，2，3*， 包永睿，2，3

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600）

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基于HepG2體外細(xì)胞培養(yǎng)的旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝

黃一凡1， 王 帥1，2，3， 孟憲生1，2，3*， 包永睿1，2，3

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600）

摘要:目的 優(yōu)選旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝。方法 采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對影響提取工藝的3個因素（提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇用量）進(jìn)行考察，以腫瘤抑制率為考察指標(biāo)來優(yōu)選最佳提取工藝。同時(shí)結(jié)合層次分析法，優(yōu)選以總黃酮含有量和出膏率為綜合評價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)及其范圍，并采用Pearson相關(guān)性分析對其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 最佳工藝條件為20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。以總黃酮含有量和出膏率為指標(biāo)的綜合權(quán)重系數(shù)范圍為0.75～0.90、0.10～0.25。結(jié)論 該優(yōu)化工藝在保證藥效的前提下，簡化了考察指標(biāo)，避免了復(fù)雜的操作，可為其他中藥材有效組分提取工藝的優(yōu)選提供了思路和方法。

關(guān)鍵詞:旋覆花；抗腫瘤；正交設(shè)計(jì)；層次分析；抑制率；權(quán)重系數(shù)

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.050

旋覆花為菊科植物旋覆花Inula jaPonica Thunb.或歐亞旋覆花Inula britannica L.的干燥頭狀花序［1］，其化學(xué)成分主要有黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類、三萜、甾體和揮發(fā)油成分［2］，具有抗炎、保肝、抗腫瘤等多種生物活性。已有文獻(xiàn)報(bào)道，旋覆花的抗氧化活性與其含有的黃酮有關(guān)［3］，但未見其抗腫瘤方面的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于HePG2細(xì)胞體外藥效實(shí)驗(yàn)，通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以腫瘤細(xì)胞抑制率為指標(biāo)，對旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝進(jìn)行篩選，并結(jié)合層次分析法，優(yōu)選可代替藥效指標(biāo)綜合評分的權(quán)重系數(shù)，為該植物的合理開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

UV-1750紫外可見分光光度計(jì)（島津儀器蘇州有限公司）；Sunrise型酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；UAIRETM US Autof1ow型CO2培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司）。

旋覆花藥材購自大連民大中藥飲片有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為歐亞旋覆花Inula britannica L.的干燥頭狀花序。蘆?。ê辛繙y定用，中國藥品生物制品檢定所，批號100080200707）。DMEM培養(yǎng)粉、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、胎牛血清（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司）；人肝癌細(xì)胞株HePG2（大連醫(yī)科大學(xué)）。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 旋覆花總黃酮含有量的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.20 mg的溶液，即得。

2.1.2 檢測波長的選擇 取對照品溶液和正交試驗(yàn)中的1號樣品溶液（15倍55％乙醇提取1 h一次，總黃酮含有量為7.246％）各2 mL，置于25 mL量瓶中，加入5％亞硝酸鈉（現(xiàn)配）1 mL，放置6 min，再加入10％硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加入4％氫氧化鈉10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁的試液為空白對照，于400～800 nm處掃描。結(jié)果，對照品溶液和樣品溶液均在510 nm處有最大吸收，故確定510 nm作為檢測波長［4-5］。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取蘆丁對照品溶液0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=12.41X+0.004 6，r=0.999 5，表明蘆丁在0.012～0.048 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 HePG2細(xì)胞培養(yǎng)與藥效學(xué)檢測

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中（含青鏈霉素100 U/mL），于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞長滿后，用0.25％胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

2.2.2 MTT法細(xì)胞抑制率檢測 取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HePG2細(xì)胞，用胰酶制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37℃，5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入樣品溶液100 μL（每組設(shè)5個復(fù)孔），空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，避光下每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄除上清液，每孔加入DMSO150 μL，搖床上振搖10 min后，于酶標(biāo)儀492 nm處測定吸光度（A值），計(jì)算藥物對細(xì)胞的增殖抑制率。抑制率=（1-試驗(yàn)組A值/對照組A值）×100％。

2.3 提取工藝的考察

2.3.1 醇濃度單因素考察 對0％、35％、55％、75％、95％乙醇進(jìn)行考察，其總黃酮含有量分別為4.71％、6.61％、7.10％、6.17％、2.15％。結(jié)果表明，55％乙醇對旋覆花中總黃酮類成分的提取率最高，因此選用55％乙醇作為最佳提取溶劑。

2.3.2 提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 精密稱取旋覆花粉末10 g，以55％乙醇為提取溶劑進(jìn)行提取。選擇提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇用量作為考察因素［6］，各因素取3個水平，以細(xì)胞抑制率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)考察。稱取9組正交設(shè)計(jì)的提取物粉末（相當(dāng)于0.1 g生藥材）溶解，2‰DMSO助溶，0.22 μm微孔濾膜濾過，作用于HePG2細(xì)胞，以細(xì)胞抑制率為指標(biāo)，優(yōu)選提取工藝，結(jié)果見表1和表2。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果

表2　正交試驗(yàn)方差分析

以細(xì)胞抑制率為指標(biāo)，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序?yàn)锽＞C＞A，其中提取次數(shù)（B）、乙醇用量（C）對細(xì)胞抑制率影響較大，而且有顯著性差異（P＜0.05）。另外，提取次數(shù)為3次時(shí)，已達(dá)到工廠日工作量，因此不再增加提取次數(shù)，確定最佳提取次數(shù)為3次。由于乙醇用量（C）也是影響提取工藝的主要因素，故為驗(yàn)證優(yōu)選乙醇用量的準(zhǔn)確性，在其他提取條件均為最優(yōu)時(shí)，對其進(jìn)行單因素考察。

分別對17.5、20、22.5倍乙醇用量進(jìn)行單因素考察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞抑制率分別為62.79％、65.17％、65.19％，即乙醇用量為20倍時(shí)，細(xì)胞抑制率明顯高于17.5倍，而與22.5倍的抑制率相差不大。因此，從節(jié)約溶劑的角度考慮，確定溶劑用量為20倍。

綜上所述，篩選出的最佳提取條件為A1B3C2，即20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。

2.4 層次分析法對總黃酮含量和出膏率權(quán)重系數(shù)的確定以總黃酮含有量和出膏率為指標(biāo)，評價(jià)旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝，建立評價(jià)目標(biāo)樹圖，結(jié)果見圖1。

圖1　旋覆花抗腫瘤有效組分提取工藝的評價(jià)目標(biāo)樹

通過比較同一層次目標(biāo)（即總黃酮含有量和出膏率）的相對重要程度，構(gòu)成一系列兩兩比較矩陣。通過AHP軟件，計(jì)算權(quán)重系數(shù)隨機(jī)一致性比率CR（CR=CI/RI），其可作為衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的指標(biāo)。通過軟件，得到9組CR=0.000 0＜0.1，即認(rèn)為矩陣具有滿意的一致性，表明9組權(quán)重系數(shù)合理有效，可用于提取工藝優(yōu)選的綜合評分中，見表3。

表3　兩種指標(biāo)在不同重要程度下的權(quán)重系數(shù)

按照各指標(biāo)不同的權(quán)重系數(shù)來計(jì)算綜合評分，作為提取工藝的評價(jià)指標(biāo)，以“比較重要”為例（總黃酮含有量和出膏率的權(quán)重系數(shù)分別為0.833 3、0.166 7、0.166 7、0.833 3），實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4和表5［綜合評分1 =（總黃酮含有量/最大總黃酮含有量）×0.833 3 +（出膏率/最大出膏率）×0.166 7；綜合評分2 =（總黃酮含有量/最大總黃酮含有量）×0.166 7 +（出膏率/最大出膏率）×0.833 3）］。

表4　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果

表5　正交試驗(yàn)方差分析

以綜合評分1為指標(biāo)，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序?yàn)锽＞C＞A，其中提取次數(shù)（B）影響最大，而且有顯著性差異（P＜0.05）。另外，提取次數(shù)為3次時(shí)已達(dá)到工廠日工作量，因此不再增加提取次數(shù)，確定最佳提取次數(shù)為3次。另外，乙醇用量和提取時(shí)間無顯著性差異（P＞0.05），而且20倍和25倍乙醇用量相差不大，從節(jié)約溶劑角度考慮，確定乙醇用量為20倍；提取時(shí)間也相差不大，因此為提高生產(chǎn)效率、節(jié)約成本，確定提取時(shí)間為1 h。綜上所述，最佳提取條件為A1B3C2，即20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。

以綜合評分2為指標(biāo)，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序?yàn)锽＞A＞C，各因素均無顯著性差異（P＞0.05）。從提高生產(chǎn)效率和節(jié)約溶劑角度考慮，優(yōu)選出的工藝條件為A3B2C2，即20倍量55％乙醇，回流提取2次，每次3 h。

當(dāng)總黃酮含有量和出膏率的權(quán)重系數(shù)分別為0.833 3、0.166 7時(shí)，以綜合評分與細(xì)胞抑制率為指標(biāo)優(yōu)選的最佳提取條件一致，說明在此權(quán)重系數(shù)下，兩者的綜合評分可代替抑制率，作為旋覆花抗腫瘤有效組分提取工藝的考察指標(biāo)。當(dāng)權(quán)重系數(shù)為0.166 7、0.833 3時(shí)，與以藥效為指標(biāo)優(yōu)選出的提取工藝不一致。

同時(shí)，對其它7組權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合評分，進(jìn)行正交試驗(yàn)直觀分析和方差分析，得到總黃酮和出膏率最佳的權(quán)重系數(shù)范圍分別為0.75～0.90、0.10～0.25。在此權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)，其綜合評分可代替抑制率，作為提取工藝的考察指標(biāo)。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 平行稱取3份等量藥材，按照優(yōu)選出的最佳提取工藝進(jìn)行提取，按“2.1”、“2.2”項(xiàng)下方法驗(yàn)證提取工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果，總黃酮含有量為8.952％、8.810％、8.783％，出膏率為20.87％、21.16％、20.17％，細(xì)胞抑制率為63.13％、65.76％、66.48％，3項(xiàng)指標(biāo)的RSD分別為1.03％、2.45％、2.71％，說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，而且藥效學(xué)結(jié)果穩(wěn)定。

選取2個權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)外的數(shù)值，對其綜合評分分別與細(xì)胞抑制率進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析［7-10］，確定權(quán)重系數(shù)范圍的準(zhǔn)確性和合理性，結(jié)果見表6。

表6　權(quán)重系數(shù)范圍驗(yàn)證結(jié)果

由表可知，在確定的權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)，綜合評分與細(xì)胞抑制率的相關(guān)系數(shù)較大；在權(quán)重系數(shù)范圍外，相關(guān)系數(shù)較小，說明總黃酮含有量和出膏率的權(quán)重系數(shù)范圍是合理的。

3 討論

旋覆花為常用的止咳化痰、降逆止嘔中藥，臨床療效顯著，同時(shí)具有抗炎、抗肝炎、抗肝損傷、抗腫瘤等多種生物活性。由于文獻(xiàn)并沒有其在抗腫瘤有效組分提取工藝方面的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行研究，為開發(fā)以旋覆花為原料的，具有廣泛臨床使用價(jià)值和商業(yè)開發(fā)價(jià)值的抗癌新藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，每味中藥相當(dāng)于一個復(fù)方，包含各種化學(xué)物質(zhì)組，其之間相互影響，同時(shí)各有效物質(zhì)組內(nèi)單體成分之間也有相互影響，因此有效組分的含有量與藥效之間并不呈完全線性相關(guān)。若只單純以有效組分或指標(biāo)性成分的含有量為提取工藝的考察指標(biāo)，不能保證優(yōu)選的提取工藝所提組分的藥效能夠達(dá)到最佳，存在片面性；若以細(xì)胞抑制率為評價(jià)指標(biāo)，雖能保證提取工藝的藥理藥效，但操作復(fù)雜、耗時(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)針對中藥多組分、復(fù)雜性的特點(diǎn)，運(yùn)用多指標(biāo)綜合評價(jià)方法［11-14］中常用的層次分析法，將旋覆花抗腫瘤有效組分提取工藝的評價(jià)目標(biāo)構(gòu)成單層次、兩指標(biāo)體系，在主觀判斷的基礎(chǔ)上作進(jìn)一步數(shù)學(xué)處理，使其在權(quán)重系數(shù)的賦予上更加科學(xué)、合理，同時(shí)建立總黃酮含有量、出膏率與藥效的關(guān)聯(lián)，即以抑制率為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選代替抑制率的總黃酮含有量和出膏率綜合指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)及其范圍。本實(shí)驗(yàn)篩選出影響評價(jià)目標(biāo)（提取工藝）的主要和次要相關(guān)指標(biāo)，避免了工業(yè)生產(chǎn)中賦予權(quán)重系數(shù)的偶然性，不僅能確保提取工藝的藥理藥效，還簡化了考察指標(biāo)，避免操作的復(fù)雜性，使優(yōu)選的工藝更加合理可行，為旋覆花抗腫瘤有效組分提取工藝的優(yōu)選提供方便。

通過Pearson相關(guān)性分析，當(dāng)總黃酮含有量和出膏率的權(quán)重系數(shù)為0.80、0.20時(shí)，其與抑制率的相關(guān)系數(shù)為0.850 7；當(dāng)兩者為0.20、0.80時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.684 9。由此可知，在確定的權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)，綜合評分與細(xì)胞抑制率的相關(guān)系數(shù)較大；在權(quán)重系數(shù)范圍外，相關(guān)系數(shù)較小，驗(yàn)證了綜合評分權(quán)重系數(shù)范圍的合理性，同時(shí)證明了總黃酮含有量的相對出膏率更為重要，在合理的權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)，其綜合評分可代替藥效指標(biāo)，作為其抗腫瘤有效組分提取工藝的評價(jià)指標(biāo)?？傸S酮含有量和細(xì)胞抑制率的相關(guān)系數(shù)為0.862 5，兩者呈一定的相關(guān)性，即量效關(guān)系，說明總黃酮類成分為其抗腫瘤的有效組分。但量效關(guān)系并不為函數(shù)關(guān)系（完全相關(guān)），其影響因素很多，一方面可能由于旋覆花中抗腫瘤有效組分種類復(fù)雜，黃酮類成分只是其中一部分，同時(shí)藥材中也存在抑制其發(fā)揮藥效的成分；另一方面，黃酮類成分是一類有效組分，不同單體對藥效貢獻(xiàn)的大小不盡相同。當(dāng)干膏中總黃酮的含有量升高時(shí)，發(fā)揮藥效與不起作用的單體成分含有量的變化不一致，因此總黃酮的含有量與藥效的量效關(guān)系并不呈完全相關(guān)。

以藥效指標(biāo)為導(dǎo)向的藥材提取工藝研究雖能從根本上保證其藥理藥效，但本實(shí)驗(yàn)以綜合評價(jià)指標(biāo)代替藥效，使得相關(guān)研究有了新的思路。對旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝進(jìn)行研究可為該植物的開發(fā)和利用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床抗腫瘤新藥的研制提供理論依據(jù)，同時(shí)也為工業(yè)生產(chǎn)和中藥及其復(fù)方提取工藝的合理優(yōu)選提供參考和借鑒。

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*通信作者:孟憲生（1964—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幗M分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析。Te1:（0411）85890185，E-mai1: mxsvvv@126.com

作者簡介:黃一凡（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)樗幬锓治觥e1:（0411）85890185，E-mai1: 383539919@qq.com

基金項(xiàng)目:“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2013ZX09507005）

收稿日期:2014-12-19

中圖分類號:R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0450-04