華山松松塔提取物對人白血病、卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

李春艷， 張 楨， 賴 泳， 劉 熙， 丁 云， 劉光明（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院藥理教研室，云南大理671000）

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華山松松塔提取物對人白血病、卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

李春艷， 張 楨， 賴 泳， 劉 熙， 丁 云， 劉光明*
（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院藥理教研室，云南大理671000）

摘要：目的 研究華山松松塔提取物體外對人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（K562）、卵巢癌細(xì)胞（SKOV3）的影響。方法采用MTT法，觀察華山松松塔提取物對K562細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 48 h，華山松松塔不同溶劑提取物在1 000 μg/m L時，對K562細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞均有抑制作用（P＜0.05）；72 h，華山松松塔石油醚提取物高劑量下（1 000 μg/mL）對SKOV3細(xì)胞無抑制作用，但對K562細(xì)胞有抑制作用（P＜0.05）；氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物在高劑量下均對K562細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞有抑制作用（P＜0.05）。結(jié)論 華山松松塔氯仿、正丁醇、乙酸乙酯提取物均具有抑制人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、人卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。

關(guān)鍵詞：華山松松塔；提取物；抗腫瘤；K562；SKOV3

松科松屬植物全世界約100種，分布于北半球直達(dá)北極圈，在熱帶和亞熱帶地區(qū)只生于山地。我國有22種，10個變種，另引進(jìn)16種，2個變種，合計50余種，分布極廣［1］。華山松松塔系松科（Pinaceae）松屬（Pinus）華山松（Pinus armandii Franch.）植物的球果，可入藥?！侗静菥V目》記載，松塔具有祛痰、止咳平喘、祛風(fēng)、潤腸、安神的功效［2］。近年來，國內(nèi)外已有多位學(xué)者對不同松科植物進(jìn)行了研究。Sakagami H等對日本五針?biāo)桑≒inus Parviflora）的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)日本五針?biāo)傻哪举|(zhì)素與糖的結(jié)合體具有抗腫瘤活性［3-4］。Hiroshi Sakagami等發(fā)現(xiàn)赤松（Pinus densiflora Sieb.et Zucc.），濕地松（Pinuselliottii Enge1m.），火炬松

（Pinus taeda L.），加勒比松（Pinus caribaea More1et）以及樟子松（Pinus sylvestris L.var.mongo1ica Litv.）松塔中的木質(zhì)素-糖復(fù)合物具有良好的體內(nèi)抗腫瘤和抗菌活性［5］。此外，樟子松松塔具有抗氧化及抗炎作用［6］。國內(nèi)學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)紅松球果鱗片多糖具有一定的抗腫瘤活性［7］，但未見對華山松塔抗癌活性的研究，故本實驗以人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株和人卵巢癌細(xì)胞株為研究對象，初步探討采集于云南巍山縣的華山松松塔的不同溶劑提取物是否有體外抗腫瘤活性，為華山松松塔的藥用開發(fā)及后續(xù)機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 華山松松塔采自云南省巍山縣，經(jīng)大理學(xué)院夏從龍教授鑒定為松科（Pinaceae）松屬華山松（Pinus armandii Franch.）的果實（松塔），樣品存于大理學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室的標(biāo)本室。取華山松松塔10 kg，95%乙醇回流提取3次，回收乙醇得到浸膏，加水懸浮，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚（收率為2.05%）、氯仿（收率為0.11%）、乙酸乙酯（收率為0.08%）、正丁醇提取物（收率為1.34%）。K562（人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株）、SKOV3（人卵巢癌細(xì)胞株），均購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。

1.2 試劑 胎牛血清（DMEM，美國Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶、MTT（噻唑藍(lán)）、100×雙抗（Sigma公司）；DDP（順鉑）（粉針劑，山東羅欣藥業(yè)股份有限公司）；羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）和二甲基亞砜（DMSO），購自美國Sigma公司；0.22 μm微孔濾膜，購自美國Mi11ipore公司。

1.3 儀器 IX-7型倒置相差顯微鏡（日本O1ympus公司）；連續(xù)波長酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Thermo）；YJ-1450型無菌操作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ES-315型高壓滅菌器（日本Tomykogyo公司）；96孔板（香港Nest公司）。

2 方法

2.1 樣品配制 華山松松塔提取物及DDP用含10%滅活FBS的DMEM培養(yǎng)基超聲溶解，0.22 μm微孔膜過濾，配制成1 g/L溶液。實驗時，用含有10%胎牛血清的DMEM稀釋成梯度質(zhì)量濃度。

2.2 華山松松塔提取物對K562細(xì)胞增殖的影響［8］MTT比色法測定華山松松塔提取物對K562細(xì)胞增殖的影響。取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，在96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板上將K562細(xì)胞懸液與不同劑量華山松松塔提取物溶液混勻，終體積為100 μL，細(xì)胞密度為1×105/mL。每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置陰性對照（細(xì)胞對照，未加入藥物）、空白對照（空白調(diào)零孔）及DDP藥物對照。37℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)48、72 h后，加入20 μL/孔MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸走上清后，每孔分別加入150 μL DMSO，待每孔紫色結(jié)晶溶解后，Bio-Tek連續(xù)波長酶標(biāo)儀測定48、72 h吸光度（D）值。測定波長為570 nm，并按下式計算按下式計算抑制率。

抑制率＝（1 -實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值）×100%

2.3 華山松松塔提取物對SKOV3細(xì)胞增殖的影響［8］取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，0.25%胰酶消化后1×105/m L密度接種于96板，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后，棄去上清，加入華山松松塔提取物，其終劑量分別為1 000、250、62.5、15.63、3.91、0.98 μg/mL，每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置陰性、空白及DDP藥物對照。37℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)48、72 h后，加入20 μL/孔MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清后，分別加入150 μL/孔DMSO，待紫色結(jié)晶溶解后，Bio-Tek連續(xù)波長酶標(biāo)儀測定48、72 h吸光度（D）值，測定波長為570 nm。抑制率計算方法同“2.2”項。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗。多組間均數(shù)比較首先采用方差齊性檢驗后用單因素方差分析（one-way ANVOA）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

4 結(jié)果

4.1 華山松松塔提取物對K562細(xì)胞的作用 華山松松塔提取物與K562細(xì)胞共同孵育48 h后，對K562細(xì)胞增殖的影響見表1。4個華山松松塔提取物中，高劑量下（1 000 μg/mL）正丁醇提取物對K562細(xì)胞增殖的抑制作用較好（與陰性對照組比較，P＜0.01）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物在1 000 μg/mL時，對K562細(xì)胞增殖的抑制率分別為20.27%、34.80%、25.10%。72 h時，華山松松塔提取物對K562細(xì)胞的抑制率在高劑量下均比48 h大，抑制作用增強。正丁醇提取物在72 h高劑量下仍表現(xiàn)出很好的抑制作用，其抑制率為88.94%。石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物的抑制率（1 000 μg/mL時）分別為30.55%、55.25%、50.25%。隨著作用時間的延長，平行劑量下的抑制作用均比48 h強，可見華山松松塔提取物對K562細(xì)胞增殖的抑制最佳時間為72 h。

表1 作用48、72 h時華山松松塔不同提取物對K 562細(xì)胞增殖作用的影響（±s，n＝3）

表1 作用48、72 h時華山松松塔不同提取物對K 562細(xì)胞增殖作用的影響（±s，n＝3）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

石油醚　　氯仿　　正丁醇　　乙酸乙酯　　石油醚　　氯仿　　正丁醇　　乙酸乙酯陰性對照組組別　　劑量/ （μg·mL-148 h抑制率/% 72 h抑制率/% ）0.00±0.26順鉑組　3.91　61.43±0.02**　55.99±0.02**華山松松　1 000　 20.27±7.05*34.80±0.94*80.17±5.72**25.10±4.52*30.55±4.40*55.25±1.39**88.94±3.20**50.52±4.17**塔提取物組　250　 5.02±7.91 18.39±0.79　 7.18±7.36　 19.97±3.88　 5.08±1.83 47.67±1.89**26.60±2.52*　48.93±1.46**62.5　 4.76±6.79　 0.00±2.67　 0.00±5.11　 15.54±4.30　 1.32±4.60　 25.75±1.15　 9.47±9.01　 45.98±4.86**15.63　 4.60±7.07　 0.00±2.71　 0.00±8.90　 8.94±5.73　 0.00±2.35　 5.98±2.96　 6.08±0.21　 17.84±3.92 3.91　 0.00±8.33　 0.00±2.91　 0.00±6.93　 8.55±1.28　 0.00±2.35　 0.00±4.03　 0.00±3.00　 14.89±8.64 0.98　 0.00±15.88　 0.00±4.23　 0.00±3.73　 8.08±4.46　 0.00±3.43　 0.00±1.42　 0.00±1.82　 4.05±3.45 -0.00±0.36

4.2 華山松松塔提取物對SKOV3的作用 華山松松塔提取48 h對人卵巢癌細(xì)胞的抑制的作用見表2。石油醚和正丁醇在（1 000～62.5）μg/mL時，對SKOV3細(xì)胞均表現(xiàn)出抑制作用，與陰性對照組比較，P＜0.05或P＜0.01；氯仿和乙酸乙酯提取物則在（1 000～250）μg/mL時對SKOV3細(xì)胞有抑制作用。華山松松塔的4個提取物在48 h高劑量下，對SKOV3增殖的抑制抑制率分別為43.71%、22.65%、39.79%、31.91%。72 h后，石油醚提取物在高劑量下（1 000 μg/mL）對SKOV3無抑制作用，抑制率從48 h的43.71%下降到72 h的14.96%；氯仿提取物在高劑量下仍表現(xiàn)出抑制作用，抑制率為21.64%，與48 h的抑制率22.65%（1 000 μg/mL時）相差不大；正丁醇提取物除在0.98 μg/mL時無抑制作用，其余劑量均表現(xiàn)出抑制作用（與陰性對照組比較，P＜0.05）；乙酸乙酯提取物對SKOV3增殖的影響在各劑量梯度下，隨著作用時間的延長，均有抑制作用（與陰性對照組比較，P＜0.05）。

表2 作用48、72 h時華山松松塔提取物對SK 0 V3增殖作用的影響（±s，n＝3）

表2 作用48、72 h時華山松松塔提取物對SK 0 V3增殖作用的影響（±s，n＝3）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

石油醚　　氯仿　　正丁醇　　乙酸乙酯　　石油醚　　氯仿　　正丁醇　　乙酸乙酯陰性對照組組別　　劑量/ （μg·mL-148 h抑制率/% 72 h抑制率/% ）0.00±0.25順鉑組　3.91　79.82±0.03**　69.42±0.04**華山松松　1 000　 43.71±3.54**22.65±9.06*39.79±4.89*31.91±2.49*14.96±3.61 21.64±4.16*45.56±7.95**　47.04±8.12**塔提取物組　250　 43.21±3.91**21.26±6.31*32.73±3.07*20.87±3.16*　3.56±8.25 16.05±1.33 41.17±2.95**　38.02±2.24*62.5　 38.62±3.50*15.37±1.54 27.63±5.53*12.01±5.99　 2.03±0.24　 9.59±4.21 25.12±5.81*　37.90±3.31*15.63　 33.93±8.59*9.18±5.36 23.87±9.81*11.94±2.22　 0.00±3.97　 4.21±7.04 24.01±1.82*　36.54±4.83*3.91　 10.68±0.74　 0.00±2.29　 14.49±6.03　 2.55±3.26　 0.00±5.46　 0.00±9.82　 22.72±3.62*　27.41±6.21*0.98　 10.18±0.67　 0.00±7.07　 8.86±8.46　 0.00±5.74　 0.00±5.71　 0.00±3.95　 14.63±9.36　 21.91±7.01 -0.00±0.42 *

5 討論

近年來，我國白血病的發(fā)病呈逐漸上升態(tài)勢。白血病是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，受累細(xì)胞（白血病細(xì)胞）出現(xiàn)增殖失控，分化障礙，凋亡受阻，大量蓄積于骨髓和其他造血組織，從而抑制骨髓正常造血功能并浸潤淋巴結(jié)、肝、脾等組織器官。根據(jù)白血病的分化程度和自然病程，一般分為急性和慢性兩大類。急性白血?。╝cute 1eukemia，AL）的分化停滯于早期階段，多為原始細(xì)胞和早期幼稚細(xì)胞，病情發(fā)展迅速，自然病程僅數(shù)月；慢性白血病（chronic 1eukemia，CL）的分化停滯于晚期階段，多為較成熟細(xì)胞和成熟細(xì)胞，病情相對緩慢，自然病程可達(dá)數(shù)年。根據(jù)受累的細(xì)胞系，AL可分為急性髓系白血病（acutemye1oid 1eukemia，AML）和急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute 1ymphob1astic 1eukemia，ALL）；CL分為慢性髓系白血?。╟hronic mye1oid 1eukemia，CML，慣稱慢粒）和慢性淋巴細(xì)胞白血病（chronic 1ymphob1astic 1eukemia，CLL）［9］。慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic mye1ogenous 1eukemia，CML）是我國慢性白血病中常見的一種類型，可發(fā)生于各年齡人群。Bcr/Ab1蛋白抑制劑依馬替尼（IM）是目前治療慢性粒細(xì)胞白血病的靶點藥，雖取得一定效果［10］，但存在原發(fā)及繼發(fā)耐藥等問題。對于復(fù)發(fā)難治患者，大多數(shù)還需接受細(xì)胞毒藥物聯(lián)合化療。而細(xì)胞毒藥物的嚴(yán)重毒副作用不但削弱了患者接受治療的順應(yīng)性，還會嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至繼發(fā)其他腫瘤［11］。因此，具有抗腫瘤作用且毒副作用較小的一些非細(xì)胞毒藥物引起學(xué)者們的關(guān)注。在本實驗中討論了華山松不同溶劑提取物對K562細(xì)胞增殖的影響，在48 h時，華山松松塔不同溶劑提取物高劑量下均對K562細(xì)胞有抑制作用，其中華山松松塔正丁醇提取物在高劑量下對K562細(xì)胞增殖的抑制作用較好。72 h時，隨著華山松松塔提取物與K562細(xì)胞作用時間的延長，各提取物平行劑量下對其的抑制作用也相應(yīng)加強，同樣，華山松松塔正丁醇提取物對K562細(xì)胞增殖的抑制表現(xiàn)出較好的作用。

卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，其死亡率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤首位。由于位于盆腔深部，缺乏有效的早期篩查方法，當(dāng)患者出現(xiàn)明顯癥狀時，疾病多已處于晚期，已成為嚴(yán)重威脅婦女生命和健康的主要腫瘤，應(yīng)高度警惕［11］目前卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是以手術(shù)為主，輔以術(shù)后化療的聯(lián)合治療，手術(shù)可行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，目的是盡最大努力切除卵巢癌之原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶，使殘余腫瘤直徑小于1 cm。也可先行新輔助化療，減少腫瘤負(fù)荷，提高手術(shù)質(zhì)量［12］。卵巢癌術(shù)后化療首選紫杉醇加鉑類藥物，但逐漸出現(xiàn)的化療耐藥已成為影響卵巢癌臨床治療效果的重要障礙［13］。中醫(yī)藥在卵巢癌的治療中發(fā)揮著積極的作用，在術(shù)后及放，化療過程中配合中醫(yī)藥治療能扶助正氣，保護(hù)脾胃功能，提高機體免疫力，降低化療帶來的毒副反應(yīng)，減少并發(fā)癥，提高生活質(zhì)量及生存期［14］。對華山松的藥理活性研究中，發(fā)現(xiàn)華山松籽油有降低TC、LDL-C及升高HDL-C的作用［15］，華山松松塔中的多糖成分具有體外抑制HIV活性［16］。但未見對華山松松塔抗腫瘤活性的報告，故本文討論華山松松塔4個提取物對人卵巢癌增殖的影響。48 h時，華山松松塔不同溶劑提取物高劑量下對SKOV3均表現(xiàn)出抑制作用（與陰性對照組比較，P＜0.05），到72 h時，華山松松塔石油醚提取物對SKOV3細(xì)胞的增殖無抑制作用，華山松松塔氯仿提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物對SKOV3細(xì)胞仍表現(xiàn)出抑制作用，其中華山松松塔乙酸乙酯提取物72 h的抑制作用較好。

中醫(yī)藥在治療腫瘤方面，積累了豐富的經(jīng)驗，且療效顯著，無明顯不良反應(yīng)，具有多靶點，多部位，多途徑，多效應(yīng)的作用。通過實驗發(fā)現(xiàn)華山松松塔4個不同溶劑提取物中，在48 h和72 h時，對K562細(xì)胞抑制作用較好的是華山松松塔正丁醇提取物；對SKOV3的抑制，48 h時華山松松塔石油醚提取物表現(xiàn)出較好的抑制作用，而72h時則是華山松松塔乙酸乙酯提取物抑制作用好。華山松松塔提取物后續(xù)抗腫瘤機制的研究，除對有效成分進(jìn)一步分離，提取，純化得到活性單體外，還應(yīng)結(jié)合細(xì)胞實驗中得出的數(shù)據(jù)，從整體藥效學(xué)確證及分子藥理學(xué)實驗出發(fā)，尋找新的分子作用靶點，為腫瘤臨床開發(fā)出生物活性高且低毒的新型中成藥及中藥靶向干預(yù)卵巢癌，人慢性粒性白血病和其他實體瘤打下堅實的基礎(chǔ)。

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*通信作者：劉光明（1953—），男，碩士，教授，研究方向為中藥藥效學(xué)。Te1：（0872）2257412，E-mai1：1gm13330555378 @ 126.com

作者簡介：李春艷（1983—），女，碩士，講師，研究方向為中藥藥效學(xué)。Te1：（0872）2257412，E-mai1：1cyyanyan@126.com

基金項目：國家自然基金（81102350，81260632）；大理學(xué)院校級青年基金（KYQN2009-40）

收稿日期：2014-12-30

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.041

中圖分類號：I 285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）03-0668-04