UPLC法測(cè)定梔子中的4種成分

錢 珺， 石燕紅， 陳紹成， 王 瑞 *（.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海00；.重慶市三峽天然藥物研究所，重慶404000；.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶400067）

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UPLC法測(cè)定梔子中的4種成分

錢 珺1， 石燕紅2， 陳紹成3， 王 瑞1 *
（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203；2.重慶市三峽天然藥物研究所，重慶404000；3.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶400067）

摘要：目的 建立超高效液相色譜（UPLC）法同時(shí)測(cè)定梔子中京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2的含有量。方法 分析采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm和440 nm；體積流量0.3 mL/min；柱溫30℃。結(jié)果 京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2分別在0.016～0.510 mg/mL（r＝0.999 9）、0.032～1.020 mg/mL（r＝0.999 9）、0.016～0.515 mg/mL（r＝1.000 0）和0.002～0.063 mg/mL（r＝0.999 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.5%、99.0%、100.1%、100.9%，ISD分別為1.2%、1.4%、1.6%、1.7%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便快速，重復(fù)性好，可為梔子質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞：梔子；京尼平龍膽二糖苷；梔子苷；西紅花苷-1；西紅花苷-2；UPLC

梔子為茜草科植物梔子Gardenia Jasminoides E11is的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒以及外用消腫止痛的功效［1］，而炒梔子、焦梔子為梔子的加工炮制品，苦寒之性較弱，更適于脾胃虛弱者［2］。梔子所含化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜、二萜（西紅花苷）、有機(jī)酸、黃酮、香豆素、揮發(fā)油、皂苷、木脂素、多糖等，其中具有較強(qiáng)藥理活性者主要為環(huán)烯醚萜類及西紅花苷類［3-5］。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜（HPLC）法，以這兩類成分為指標(biāo)，對(duì)梔子進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，但分析時(shí)間較長(zhǎng)［6-10］。

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)，建立雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定梔子及其炮制品中2個(gè)環(huán)烯醚萜類成分（京尼平龍膽二糖苷、梔子苷）和2個(gè)西紅花苷類成分（西紅花苷-1和西紅花苷-2）的方法，其簡(jiǎn)便可靠，分析時(shí)間短，能顯著提高分析效率，可為梔子的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

Waters Acquity超高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA檢測(cè)器和Empower工作站（美國Waters公司）；AE200電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙腈、磷酸為色譜純（德國Merck公司）；水為超純水（美國Mi11ipore公司產(chǎn)品所制）；其他試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。梔子苷（批號(hào)110749-201316）、西紅花苷-1（批號(hào)111588-201303）、西紅花苷-2對(duì)照品（批號(hào)111589-201304）和梔子對(duì)照藥材（批號(hào)120986-201307）均購自中國食品藥品檢定研究院；京尼平龍膽二糖苷對(duì)照品（批號(hào)ZM0507BA14，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。30批生梔子、2批炒梔子和2批焦梔子均為市售品和產(chǎn)地收集，經(jīng)重慶第二師范學(xué)院陳曉麟教授鑒定為茜草科植物梔子Gardenia Jasminoides E11is的干燥成熟果實(shí)，見表1。

表1 不同批次梔子樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～3 min，8%～20%A；3～8 min，20%～35%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm（0～5 min）、440 nm（5～8 min）；體積流量0.3 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 μL。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2 80、250、40和10 μg的溶液，即得。

圖1 混合對(duì)照品和梔子的UPLC色譜圖

2.3 供試品溶液制備 精密稱取樣品粉末0.2 g（過4號(hào)篩），置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲提?。?50 W、40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，70%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2對(duì)照品適量，置于20 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.510、1.020、0.515、0.630 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再精密吸取不同儲(chǔ)備液，稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，進(jìn)樣2 μL，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg/m L）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表2。由表可知，各化合物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密稱取樣品粉末（批號(hào)ZZ-15052830）1份（0.2 g），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2峰面積的ISD分別為0.2%、0.2%、0.2%和0.9%，表明儀器精密度良好。

表2 回歸方程及線性范圍

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品粉末（批號(hào)ZZ-15052830）6份，每份0.2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2平均含有量分別為1.54%、5.18%、0.86%、0.08%，ISD分別為1.1%、0.9%、1.3%、1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取樣品粉末（批號(hào)ZZ-15052830）1份（0.2 g），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h進(jìn)樣，測(cè)得京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2峰面積的ISD分別為0.6%、0.6%、0.8%和1.1%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的樣品粉末（ZZ-15052830）9份，每份0.1 g，分別按樣品含有量的50%、100%和150% 3個(gè)水平加入京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品測(cè)定 精密稱取樣品粉末0.2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2的含有量，結(jié)果見表4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PDA檢測(cè)器，分別對(duì)4個(gè)指標(biāo)成分（京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2）對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)京尼平龍膽二糖苷和梔子苷的最大吸收波長(zhǎng)為238 nm，而西紅花苷-1和西紅花苷-2為440 nm。此外，前2個(gè)成分的出峰時(shí)間為2～5 min，而后2個(gè)成分為5～8 min，故添加波長(zhǎng)切換時(shí)間，使檢測(cè)波長(zhǎng)在5 min后自動(dòng)切換，建立的可變波長(zhǎng)UPLC法可以同時(shí)測(cè)定梔子及其加工炮制品中4個(gè)指標(biāo)成分的含有量。目前文獻(xiàn)報(bào)道，采用HPLC法對(duì)梔子中環(huán)烯醚萜類和西紅花苷類成分進(jìn)行含有量測(cè)定，分析時(shí)間在45 min以上，而本實(shí)驗(yàn)中UPLC法的一次分析時(shí)間僅需8 min，大幅縮短分析時(shí)間，提高了分析效率。

梔子為常用大宗藥材，江西、四川、重慶和湖南為全國四大梔子產(chǎn)地。本實(shí)驗(yàn)所用樣品來自江西、四川、重慶、湖南、湖北、福建、河北、河南、山東和浙江10個(gè)地區(qū)，測(cè)定結(jié)果表明，京尼平龍膽二糖苷含有量為0.33%～1.72%，梔子苷為1.59%～5.90%，西紅花苷-1為0.19%～1.26%，西紅花苷-2為0.04%～0.17%。

現(xiàn)行《中國藥典》2015版以梔子苷為指標(biāo)性成分，規(guī)定梔子中其含有量不得低于1.8%，炒梔子中不得低于1.5%，焦梔子中不得低于1.0%。本實(shí)驗(yàn)收集的樣品中除1批生梔子（批號(hào)ZZ-15090105）不合格外，其他樣品中梔子苷的含有量均明顯高于藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

同時(shí)，梔子還是重要的食用色素和天然染料原料，被廣泛應(yīng)用于食品、化工等行業(yè)。藥典規(guī)定，梔子在9～11月果實(shí)成熟，呈紅黃色時(shí)采收，“表面紅黃色或棕紅色”為梔子中西紅花苷類成分的外觀性狀指示，說明其也是梔子品質(zhì)優(yōu)良的重要指標(biāo)之一［11］。含有量測(cè)定結(jié)果表明，西紅花苷-1為生梔子中主要的西紅花苷類成分，含有量越高，梔子表面顏色越紅。其含有量低的樣品外觀顏色為灰棕色或棕黃色，而含有量高的樣品外觀顏色為紅黃色，甚至棕紅色。

表3 4種成分的加樣回收率（n＝9）

表4 4種成分含有量測(cè)定結(jié)果

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［醫(yī)院藥房］

*通信作者：王 瑞（1973—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥活性成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Te1：（021）51322181，E-mai1：e11ewang@163.com

作者簡(jiǎn)介：錢 珺（1993—），女，碩士生，從事中藥活性成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Te1：（021）51322181，E-mai1：qianjun9334@ 163.com

基金項(xiàng)目：上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”國內(nèi)科技合作領(lǐng)域項(xiàng)目（14495800400）；重慶市前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（cstc2014jcyjA1466）；重慶市科委社會(huì)民生項(xiàng)目（cstc2015shmszx0738）

收稿日期：2015-11-07

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.053

中圖分類號(hào)：I 284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0708-04