晚期糖基化終末產(chǎn)物受體基因p．82G＞S多態(tài)性與炎癥性腸病易感性的關(guān)系

畢云天，金捷，閆峻（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江溫州505；溫州市中心醫(yī)院；溫州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院）

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晚期糖基化終末產(chǎn)物受體基因p．82G＞S多態(tài)性與炎癥性腸病易感性的關(guān)系

畢云天1，金捷2，閆峻3
（1溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江溫州325035；2溫州市中心醫(yī)院；3溫州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院）

摘要：目的 探討晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）基因p．82G＞S多態(tài)性與炎癥性腸病（IBD）易感性的關(guān)系。方法 選擇IBD患者211例（IBD組），其中潰瘍性結(jié)腸炎（UC）160例、克羅恩?。–D）51例，另選擇健康查體者177例作為對照組。采集患者靜脈血，采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性方法檢測RAGE基因p．82G ＞S等位基因頻率和基因型頻率。結(jié)果 IBD組RAGE S等位基因頻率為22．51%，高于對照組的16．95%；GS基因型頻率為29．86%，高于對照組的16．95%（P均＜0．05）。IBD組中，UC患者S等位基因頻率為23．44%，GS基因型頻率為34．38%，均較對照組顯著升高（P均＜0．05）。CD患者與對照組的等位基因和基因型頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0．05）。結(jié)論 RAGE基因p．82G＞S多態(tài)性與IBD中UC的易感性有一定相關(guān)性，攜帶GS基因型者更易患UC。

關(guān)鍵詞：炎癥性腸??；潰瘍性結(jié)腸炎；克羅恩??；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；單核苷酸多態(tài)性

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）屬于細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族一員［1］，RAGE基因的啟動子、外顯子和內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)存在多處多態(tài)位點(diǎn)，包括374T／A、429T／C、p．82G＞S、1704G／T和2184A／G等［2，3］。其中p．82G＞S多態(tài)性與糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［4］。研究顯示，正常腸道上皮細(xì)胞中RAGE表達(dá)較低，而炎癥狀態(tài)下RAGE表達(dá)顯著升高［5］，提示RAGE可能對炎癥性腸病（IBD）的發(fā)生起重要作用。本研究通過檢測IBD患者RAGE基因p．82G＞S多態(tài)性，探討其與IBD易感性的關(guān)系。

1　資料與方法

1．1臨床資料 選擇2004年1月～2012年12月溫州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的211例IBD患者（IBD組），男112例、女116例，年齡（38．6±14．3）歲。其中潰瘍性結(jié)腸炎（UC）160例，克羅恩?。–D）51例。另擇177例健康體檢者作為對照組，男、女各80例，年齡（39．4±9．8）歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1．2RAGE基因多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性方法。采集受試者靜脈血1 mL，應(yīng)用GFX小量血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，紫外分光光度計(jì)檢測DNA表達(dá)。正向引物5′-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3′；反向引物5′-GGCCAAGGCTGGGGTTGAAGG-3′；擴(kuò)增目的基因片段為含p．82G＞S多態(tài)位點(diǎn)的397 bp片段。PCR反應(yīng)體系：50 ng基因組DNA，1×NH4緩沖液，1 mmol／L MgCl2，0．2 mmol／L dNTPs，6．3 pmol／L引物，0．5 U Taq酶，1 mmol／L甜菜堿。反應(yīng)條件：95 ℃2 min，95℃30 s、52℃30 s、72℃30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。用5 U內(nèi)切酶AluI切割擴(kuò)增片段，瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，等位基因82G酶切片斷為248、123、26 bp；等位基因82S酶切片斷為181、123、67、26 bp。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件?；蛐皖l率分布的比較采用χ2檢驗(yàn)，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測，應(yīng)用OR以及95%可信區(qū)間（CI）計(jì)算和評估相對風(fēng)險。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

兩組RAGE G82S等位基因頻率和基因型頻率分布達(dá)到Hardy-Weinberg平衡。兩組等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4．086，P＝0．043，OR ＝1．439，95%CI為1．010～2．049），基因型頻率比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2＝9．404，P＝0．003，OR＝1．960，95%CI為1．271～3．021）。IBD組中，UC患者的S等位基因頻率高于對照組（χ2＝4．417，P＝0．036，OR＝1．500，95%CI為1．026～2．192），GS基因型頻率高于對照組（χ2＝8．832，P＝0．002，OR ＝2．007，95%CI為1．264～3．188）。CD患者的等位基因和基因型頻率與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0．05）。見表1。

表1　IBD組與對照組RAGE　G82S等位基因和基因型分布比較［例（%）］

3　討論

RAGE屬于細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族成員，其分子結(jié)構(gòu)分為細(xì)胞膜外區(qū)、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞膜外區(qū)有3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)，即一個Vd區(qū)和兩個C區(qū)，RAGE與配體的結(jié)合主要發(fā)生在Vd區(qū)［1，3］。RAGE基因的啟動子、外顯子和內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)存在多處多態(tài)位點(diǎn)，包括374T／A、429T／C、p．82G＞S、1704G／T和2184A／G等。p．82G＞S是位于RAGE配體結(jié)合域Vd區(qū)的功能性氨基酸變異［4］。RAGE基因p．82G＞S多態(tài)性與糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。腸道免疫反應(yīng)異常所致的炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中起重要作用，炎癥因子表達(dá)升高是腸黏膜出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的重要特征［6］。RAGE能與多種配體結(jié)合，激活胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生炎癥因子，導(dǎo)致持久的炎癥反應(yīng)發(fā)生［7～9］。研究發(fā)現(xiàn)，配體S100A12與RAGE的結(jié)合介導(dǎo)了腸道的促炎反應(yīng)過程［10］，誘發(fā)了核轉(zhuǎn)錄因子-κB依賴性的細(xì)胞因子的分泌［11］。RAGE基因p．82G＞S多態(tài)是影響血液中可溶性RAGE（sRAGE）水平的重要遺傳因素，與82G等位基因攜帶者相比，82S等位基因攜帶者會出現(xiàn)血液sRAGE顯著降低的現(xiàn)象［12］。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，攜帶RAGE 82S等位基因的個體會出現(xiàn)血液sRAGE表達(dá)水平顯著下降的現(xiàn)象，而且這種基因型依賴的sRAGE表達(dá)下降在病理?xiàng)l件下（如多發(fā)性硬化）更加突出。較低的sRAGE水平可導(dǎo)致患者中和RAGE有害配體（如S100A12）能力的下降，增加與RAGE受體結(jié)合的配體數(shù)量，最終導(dǎo)致RAGE介導(dǎo)作用增強(qiáng)，產(chǎn)生更多炎癥因子。

近年研究發(fā)現(xiàn)，RAGE基因變異會放大配體與RAGE結(jié)合后下游炎癥因子的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，在中國倉鼠卵巢細(xì)胞和人類單核細(xì)胞中，RAGE p．82G＞S多態(tài)可以顯著影響RAGE與配體結(jié)合的親和力，表現(xiàn)為82S等位基因編碼的RAGE受體與S100／calgranulin的親和力強(qiáng)于82G等位基因編碼的RAGE受體蛋白，且RAGE受體被配體激活后產(chǎn)生的TNF-α、IL-6、MMP-9表達(dá)增加，具有放大免疫、炎癥反應(yīng)的作用［2］。韓國的一項(xiàng)大樣本人群研究發(fā)現(xiàn)，RAGE基因p．82G＞S多態(tài)性對人體TNF-α表達(dá)、氧化應(yīng)激及胰島素抵抗等均有顯著影響［12］。本研究結(jié)果顯示，IBD組RAGE S等位基因頻率和GS基因型頻率均高于對照組；IBD組中，UC患者S等位基因頻率和GS基因型頻率均高于對照組，CD患者各等位基因和基因型頻率與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明RAGE基因p．82G＞S多態(tài)性與UC的易感性有一定相關(guān)性，攜帶GS基因型者更易患UC。

綜上所述，RAGE基因p．82G＞S多態(tài)性與IBD易感性有關(guān)。這將為IBD的治療策略和方法提供幫助，為IBD的治療提供新的靶點(diǎn)，并有助于指導(dǎo)IBD個體化的抗炎治療。

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Correlation between p．82G＞S polymorphisms of receptor for advanced glycation end-product gene and susceptibility to inflammatory bowel diseases

BI Yuntian1，JIN Jie，YAN Jun
（1 Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China）

Abstract：Objective To investigate the correlations between p．82G＞S polymorphisms of receptor for advanced glycation end-product（RAGE）gene and susceptibility to inflammatory bowel diseases（IBD）．Methods Genomic DNA from IBD patients（n＝211）with Crohn′s disease（CD，n＝51）and with ulcerative colitis（UC，n＝160）and from healthy controls（control group）（n＝177）was extracted to detect the allele frequencies and genotype frequencies of RAGE gene p．82G＞S polymorphisms by restriction fragment length polymorphism assay（PCR-RFLP）．Results The RAGE S allele frequencies（22．51%）of the IBD group was higher than that of the control group（16．95%），P＜0．05．The GS genotype frequencies（29．86%）of the IBD group was higher than that of the control group（16．95%），P＜0．05．In the IBD group，UC patients also had higher S allele frequencies（23．44%）and GS genotype frequencies（34．38%）than those of the control group（all P＜0．05）．However，no significant differences were found in the allele frequencies and genotype frequencies between CD patients and healthy controls（all P＞0．05）．Conclusion RAGE gene p．82G＞S polymorphism has certain association with susceptibility to UC，and patients with GS genotype are more susceptible to UC．

Key words：inflammatory bowel disease；ulcerative colitis；Crohn′s disease；receptor for advanced glycation endproduct；single nucleotide polymorphism

收稿日期：（2015-09-30）

作者簡介：第一畢云天（1969-），女，副教授，主要研究方向?yàn)榧膊〉倪z傳分析。E-mail：642274912＠qq．com

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY12H03004）。

中圖分類號：R394．3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0008-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．003