超濾管凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中喹諾酮類藥物殘留

鞠玲燕，宋曉華，谷　婕，徐成鋼，楊麗君

( 威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東　威?！?64200)

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超濾管凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中喹諾酮類藥物殘留

鞠玲燕，宋曉華，谷婕，徐成鋼，楊麗君*

( 威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東威海264200)

喹諾酮類(Quinolones，QNs)藥物是一類抗菌作用強(qiáng)、抗菌譜廣的人工合成抗菌藥，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、動物疾病預(yù)防及促生長。QNs在動物源食品中的過量或不當(dāng)使用會對食用者產(chǎn)生潛在“三致”(致癌、致畸、致突變)作用，誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而威脅人類健康[1]。因此，動物體內(nèi)的QNs殘留問題備受關(guān)注，許多國家和組織都限制其使用并制訂出相應(yīng)的最高殘留限量(MRLs)：美國禁止在食用動物養(yǎng)殖中使用氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones, FQNs)；日本批準(zhǔn)使用的QNs僅有恩諾沙星、二氟沙星、奧比沙星、達(dá)氟沙星、馬波沙星、氧氟沙星和惡喹酸；歐盟規(guī)定動物肌肉、肝臟和腎臟中達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星(環(huán)丙沙星與恩諾沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等的MRLs為0.01~1.9 mg；我國于2002年規(guī)定了環(huán)丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7種QNs藥物在動物肌肉組織中的最高殘留限量為10~500 μg/kg。因此，對動物源食品中QNs殘留量的檢測尤為重要。

目前QNs的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[2-3]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[4-5]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[6]等。其中HPLC-MS/MS法分析速度快、靈敏度高、選擇性和特異性好，是目前藥物殘留方面應(yīng)用最普遍的檢測技術(shù)[7]。樣品前處理技術(shù)對于藥物的檢測至關(guān)重要[8]。QNs樣品前處理的常用方法有液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)；LLE是凈化QNs的基本方法，但存在操作費(fèi)時(shí)、消耗高純?nèi)軇┒嘁约皹悠芬兹榛炔蛔鉡9-10]；SPE消耗溶劑少且不產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，是QNs凈化最常用的方法[11-13]，但目前商品化的固相萃取柱一般只能一次性使用，成本較高。另外還有分子印跡固相萃取、基質(zhì)固相分散萃取和超臨界流體萃取等較新的方法也被應(yīng)用于QNs殘留分析，但均處于研究階段，技術(shù)尚不成熟[14-15]。

超濾(Ultrafiltration，UF)是一種加壓膜分離技術(shù)，其膜孔徑介于微濾和反滲透之間，通過膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對物質(zhì)進(jìn)行選擇性分離。即在一定壓力下，使小分子物質(zhì)穿過一定孔徑的特制薄膜，而大分子物質(zhì)不能透過，從而將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)[16-18]。目前超濾技術(shù)較多應(yīng)用于水處理工程，將其與HPLC-MS/MS結(jié)合應(yīng)用于獸殘檢測的研究較少。本研究嘗試?yán)脤?shí)用和快捷的超濾管凈化樣品，采用高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定動物源食品中的10種喹諾酮類藥物殘留量，有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)，方法靈敏度高、重復(fù)性好，適合于動物源食品中多種喹諾酮類藥物殘留的快速確證和定量測定。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；API 4000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國AB公司)；配有電噴霧離子源(ESI)；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)(日立公司)；氮吹濃縮儀(美國Caliper公司)；MS3 旋渦混合器(IKA公司)。

乙腈(色譜純，美國默克公司)；甲酸、乙酸(色譜純，CNW公司)；無水硫酸鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)：650 ℃灼燒4 h，置于干燥器中備用；1%乙酸酸化乙腈：99 mL乙腈中加入1 mL乙酸，混勻。標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、惡喹酸(OXO)、沙拉沙星(SAR)、雙氟沙星(DIF)、氟甲喹(FLU)、萘啶酸(NDL)、氧氟沙星(OFL)、諾氟沙星(NOR)、丹諾沙星(DAN)均購自Dr.Ehrenstorfer，純度≥97.2%。

超濾管：體積為50 mL，截留分子量(MWCO)：選用3 kD和10 kD，購自美國Millipore公司。新超濾管使用前加入超純水，水量完全過膜，冰浴或冰箱中預(yù)冷幾分鐘，將水倒出，然后加入前處理液。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

用乙腈溶解標(biāo)準(zhǔn)品，配成濃度為100 mg/L的單標(biāo)儲備液，于-18 ℃下儲存?zhèn)溆?。使用時(shí)根據(jù)需要配成適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3液相色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge C18(3.5 μm×2.1 mm×150 mm)；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液；B為乙腈；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫條件：0~1.0 min,80%A；1.0~6.0 min，80%~40%A;6.0~10.0 min，40%~20%A;10.0~14.0 min，20%A;14.0~14.1 min，20%~80%A;14.1~20.0 min，80%A。

1.4質(zhì)譜條件

電噴霧電離源正離子掃描(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；電噴霧電壓:5.0 kV；離子源溫度:500 ℃；霧化氣壓力(GS1):70 psi；輔助氣流速(GS2):55 psi；氣簾氣壓力(CUR):20 psi；碰撞室入口電壓(EP):10 V；碰撞室出口電壓(CXP):10 V。監(jiān)測離子對、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)如表1所示。

表1　10種喹諾酮的優(yōu)化質(zhì)譜分析參數(shù)

*quantitative ion

1.5樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.00 g粉碎好的樣品，加入20 mL 1%乙酸酸化乙腈，混勻，超聲20 min，加入5 g無水硫酸鈉，混勻，以8 000 r/min離心5 min，取12 mL左右上清液沿管壁慢慢加入超濾管中。離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃，5 000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確移取離心出的液體10 mL用氮?dú)饬鞔蹈?，以流動相定容?.0 mL，供HPLC-MS/MS測定分析。

2結(jié)果與討論

2.1樣品前處理?xiàng)l件的比較

2.1.1超濾膜分子量的選擇通常情況下選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，MWCO不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，若待測蛋白的分子量為10 kD左右，則可以用截留分子量3 kD的超濾管。而本實(shí)驗(yàn)是需要離心透析出的液體，因此在選用超濾管時(shí)不但要考慮能否透析出目標(biāo)化合物，還要考慮被截留的大分子物質(zhì)在離心時(shí)是否會損壞超濾膜。10種喹諾酮類藥物的分子量均在200~400之間，根據(jù)現(xiàn)有的50 mL超濾管的型號規(guī)格(3，10，30，50，100 kD)，選用膜MWCO為3 kD和10 kD的超濾管進(jìn)行試驗(yàn)。

先加入10 mL 1%乙酸酸化乙腈離心10 min，3，10 kD超濾管均能全部濾出；選用豬肉和豬肝樣品，按“1.5”方法進(jìn)行樣品處理后，取10 mL上清液加入超濾管中，5 000 r/min離心10 min，3，10 kD超濾膜均能夠離心徹底，且未見破損。為了更好地截留生物大分子物質(zhì)，達(dá)到最佳凈化效果，本實(shí)驗(yàn)選用截留分子量最小的3 kD超濾管。

2.1.2離心條件的選擇超濾管推薦的離心速率約為5 000 r/min。在空白樣品中添加10種喹諾酮類藥物混標(biāo)(加標(biāo)水平10.0 μg/kg)，加入20 mL 1%乙酸酸化乙腈，混勻，超聲20 min，加烘干的無水硫酸鈉5 g混勻，8 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液加入超濾管中，分別對不同離心速率(3 000，4 000，5 000，6 000 r/min)和離心時(shí)間(5，10，15，20 min)進(jìn)行比較，上機(jī)檢測后計(jì)算10種目標(biāo)物的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，離心速率對回收率無明顯影響，與離心出的液體快慢有關(guān)，即離心速率越大，達(dá)到相同凈化效果所需的離心時(shí)間越短，但離心速率過快，會損壞超濾膜，故在實(shí)際使用中采用 5 000 r/min離心10 min，其離心出的液體量滿足實(shí)驗(yàn)要求且濾膜無破損。

2.1.3超濾管的凈化效果在空白牛肉樣品中添加10種喹諾酮藥物混標(biāo)(加標(biāo)水平為5.0 μg/kg)，加入20 mL 1%乙酸酸化乙腈提取后，取10 mL上清液加入超濾管中，進(jìn)行凈化處理，離心液經(jīng)氮吹后復(fù)溶，上機(jī)檢測；另取10 mL上清液直接氮吹復(fù)溶后檢測。經(jīng)超濾管凈化處理和未處理的牛肉樣品的總離子流圖見圖1，由圖可以看出，經(jīng)超濾管凈化處理的樣品干擾減少，降低了基質(zhì)效應(yīng)，達(dá)到了凈化目的。

2.2液相色譜條件的選擇

對比了以乙腈和0.1%甲酸、甲醇和0.1%甲酸、乙腈和水、甲醇和水作為流動相時(shí)對待測物質(zhì)色譜分離的影響。結(jié)果顯示，流動相中加入0.1%甲酸可以提高待測物質(zhì)的信號強(qiáng)度；采用甲醇和乙腈為流動相時(shí)，信號強(qiáng)度的差別不大，但采用甲醇時(shí)的基線噪音較大，因此選用乙腈作流動相。為了達(dá)到滿意的峰形和分離效果，采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。在色譜柱的選擇中，比較了Agilent Zorbax SB-C18，XDB-C18和Waters Xbridge C183種色譜柱的分離效果，實(shí)驗(yàn)最終選用分離效果最佳的Waters Xbridge C18色譜柱進(jìn)行分離。

2.3質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

選擇ESI+模式，采用針泵進(jìn)樣方式分別對分析物進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，每種分析物選取豐度較高的3~4個碎片離子作為子離子，配制不同種類空白樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，剔除易受基質(zhì)干擾的子離子。在MRM模式下優(yōu)化各種質(zhì)譜條件，最終選定的特征離子及優(yōu)化的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。10種喹諾酮添加水平為5.0 μg/kg的牛肉樣品的MRM譜圖見圖2。

2.4方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性范圍、檢出限與定量下限按“1.5”方法制備不含待測組分的空白基質(zhì)溶液，配制濃度分別為5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/kg的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測定，以峰面積(y)對相應(yīng)的喹諾酮濃度(x，μg/kg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在5.0~100 μg/kg(相當(dāng)于樣品)濃度范圍內(nèi)，10種喹諾酮的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)采用向空白樣品中逐級降低加標(biāo)濃度的方法來確定。以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限，以S/N=10對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為定量下限。10種喹諾酮類藥物的LOD為0.15~0.75 μg/kg，LOQ為0.49~2.59 μg/kg(見表2)。

表2　10種喹諾酮的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限

2.4.2回收率與精密度選用不同基質(zhì)(豬肝、牛肉、魚肉)的空白樣品，分別添加5.0,10,50 μg/kg 3個不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.5”方法進(jìn)行前處理，每個水平重復(fù)測定6次，計(jì)算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。測得平均回收率為71.4%~85.9%，RSD為3.9%~10.7%。該方法具有較好的回收率和重復(fù)性，可以滿足動物源性食品中10種喹諾酮類藥物殘留的日常檢測要求。

表3　豬肝、牛肉和魚肉中10種喹諾酮的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5實(shí)際樣品的測定

從市面上購得豬肝、牛肉、魚肉等10份以及本實(shí)驗(yàn)室保留的陽性樣品3份，分別采用本方法和《GB/T 21312-2007 動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》進(jìn)行檢測，10份市售樣品皆未檢出10種喹諾酮藥物殘留，3份陽性樣品中分別檢出恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星，將對本方法陽性樣品的測定結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果進(jìn)行對比，測定值的相對偏差在±10%以內(nèi)(見表4)，說明本方法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表4　陽性樣品中10種喹諾酮的檢測數(shù)據(jù)和相對偏差

*no detected

3結(jié)論

本研究通過優(yōu)化超濾管體積、截留分子量、離心條件等參數(shù)，建立了超濾管凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定動物源食品中10種喹諾酮類藥物殘留的新方法。該方法采用超濾管凈化，凈化效果理想，能夠?qū)崿F(xiàn)大分子物質(zhì)與殘留目標(biāo)物的有效分離。與傳統(tǒng)的液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)相比，超濾管凈化技術(shù)簡便快捷、無需使用大量的有機(jī)溶劑，超濾透過的物質(zhì)僅與分子量有關(guān)，與物質(zhì)的其它性質(zhì)無關(guān)，可去除任何樣品中的生物大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)，有效降低樣品干擾，在復(fù)雜基質(zhì)中的應(yīng)用效果更明顯。本方法可擴(kuò)展到其它獸藥殘留的檢測，為改進(jìn)動物源食品中獸藥殘留檢測的前處理方法提供了新的契機(jī)。

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摘要：建立了超濾管凈化技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定動物源食品中10種喹諾酮類藥物殘留的新方法。樣品經(jīng)酸化乙腈提取后，采用50 mL Millipore超濾管(截留分子量3 kD)凈化，離心液氮吹復(fù)溶后，經(jīng)Waters Xbridge C18色譜柱進(jìn)行分離，以0.1%甲酸-乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧正離子(ESI+)模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，10種喹諾酮類藥物在5.0~100 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法的檢出限為0.15~0.75 μg/kg，定量下限為0.49~2.59 μg/kg，在5.0,10,50 μg/kg 3個加標(biāo)水平下的回收率為71.4%~85.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為3.9%~10.7%。方法簡便快速、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于動物源食品中10種喹諾酮類藥物殘留的快速確證和定量分析。

關(guān)鍵詞：超濾管；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；動物源食品；喹諾酮類藥物

Determination of Quinolones Residues in Animal-originated Foodstuffs by Ultrafiltration Tube Cleaning and High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryJU Ling-yan，SONG Xiao-hua，GU Jie，XU Cheng-gang，YANG Li-jun*

(Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weihai264200,China)

Abstract：A new method was established for the simultaneous determination of 10 quinolone(QN) residues in animal-originated foodstuffs by ultrafiltration tube cleaning with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).After extraction with acetonitrile (containing 1%acetic acid),the extract was purified with 50 mL Millipore ultrafiltration tube (Molecular Weight Cut-Off，MWCO:3 kD),and then the centrifugal liquid was evaporated to dryness under a stream of nitrogen,and redissolved.The analytes were separated on a Waters Xbridge C18column using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase.The identification and quantification of 10 quinolone residues were carried out under positive electrospray ionization (ESI+) in multiple reaction monitoring (MRM) mode，the quantification analysis was performed by the external standard method.The calibration curves showed good linearities in the range of 5.0-100 μg/kg for all QNs.The limits of detection for all QNs were in the range of 0.15-0.75 μg/kg,and the limits of quantitation were 0.49-2.59 μg/kg.The recoveries of these analytes varied from 71.4%to 85.9%at spiked levels of 5.0,10,50 μg/kg,with relative standard deviations of 3.9%-10.7%.This method was simple,rapid,sensitive and reproducible,and could be applied in the determination of 10 quinolone residues in animal-originated foodstuffs．

Key words：ultrafiltration tube；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);animal-originated foodstuffs;quinolones

中圖分類號：O657.63；TQ460.72

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0042-06

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.007

通訊作者：*楊麗君，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全，Tel:0631-3807680，E-mail:18663136117@163.com

基金項(xiàng)目：國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013IK178)；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310143)；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAK08B01)

收稿日期：2015-07-01；修回日期：2015-07-31