香茯顆粒質(zhì)量控制研究

俞　娟，王國凱

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230012)

?

香茯顆粒質(zhì)量控制研究

俞娟，王國凱

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230012)

[摘要]目的建立香茯顆粒質(zhì)量控制的方法。方法采用薄層色譜法對香茯顆粒中茯苓、山楂、廣藿香、木香進行鑒別，采用高效液相色譜法對香茯顆粒石榴皮中沒食子酸含量進行測定。色譜條件：十八烷基鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.2%磷酸溶液(4∶96)為流動相；流速1.0 mL/min；檢測波長為270 nm。結(jié)果薄層色譜法能定性檢出茯苓、山楂、廣藿香、木香，斑點清晰，分離度好，且陰性對照無干擾。沒食子酸濃度在5.349～213.962 μg/mL范圍內(nèi)，與峰面積的線性關(guān)系良好(r=0.999 8)，平均加樣回收率為98.48%(RSD=0.80%)。結(jié)論本研究所建立的定性、定量檢測方法操作簡便,結(jié)果準確可靠,重現(xiàn)性好。

[關(guān)鍵詞]香茯顆粒；薄層色譜法；沒食子酸；高效液相色譜法

香茯顆粒處方來源于臨床經(jīng)驗方，有近30年的臨床實踐經(jīng)驗，其處方由廣藿香、蒼術(shù)、車前子、澤瀉、茯苓、薏苡仁、石榴皮、山楂、木香、馬齒莧共10味中藥組成。臨床實踐表明，本方具有健脾和胃、化濕止瀉的功效，用于治療小兒脾胃失調(diào)、水濕不運所致的胸腹脹滿、大便泄瀉、小便不利、腹痛下墜、嘔逆惡心。石榴皮中主要有效成分沒食子酸是可水解鞣質(zhì)的組成部分，具有較強的抗病毒、抗菌、抗癌、抗氧化等作用[1]。為了更好地控制香茯顆粒的質(zhì)量，本研究采用薄層色譜法(thin-layer chromatography, TLC)對香茯顆粒中茯苓、山楂、廣藿香、木香進行鑒別研究，并將石榴皮中沒食子酸作為含量測定的指標性成分，建立了沒食子酸的高效液相色譜測定方法。

1儀器和試藥

1.1儀器島津LC-10ADvp高效液相色譜儀，島津SPD-M10Avp檢測器，SIL-10A自動進樣器，島津LCsolution色譜工作站；METTLER TOLEDO (AB135-S)電子天平(十萬分之一)。

1.2試藥實驗藥材均購于渦陽縣天潤康藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定均符合2010年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定。香茯顆粒樣品(自制，批號分別為130121、130122、130123)、沒食子酸對照品(批號 110831-201204)、百秋李醇對照品(批號 110772-200404)、山楂對照藥材(批號 121138-200905)、木香對照藥材(批號 120921-200607)、茯苓對照藥材(批號 121117-200504)均購于中國食品藥品檢定研究院。

2方法與結(jié)果

2.1香茯顆粒制劑工藝流程取廣藿香、蒼術(shù)、木香3味藥，加8倍量水浸漬2 h，蒸餾4 h提取揮發(fā)油，備用，蒸餾后的水溶液另器收集。藥渣與車前子、茯苓、薏苡仁、石榴皮、山楂、馬齒莧、澤瀉7味藥合并，加水煎煮2次，每次10倍量，分別煎煮2 h，濾過，合并，濃縮(60 ℃)至相對密度為1.20，加乙醇使含醇量達到70%，充分攪拌，靜置12 h，取上清液回收乙醇，并濃縮(60 ℃)至相對密度為1.20的稠膏，加入相當藥材總量10%的糊精，混合均勻后，減壓干燥，粉碎成細粉；再加入剩余量的糊精及蔗糖，混勻，加乙醇制粒，鼓風干燥2 h(70～80 ℃)，整粒，將揮發(fā)油用無水乙醇(1∶3)溶解并均勻噴入干燥顆粒中密閉2 h，制成1 000 g，即得。

2.2薄層鑒別

2.2.1茯苓薄層鑒別取本品顆粒30 g，研細，加乙醚100 mL回流40 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。取茯苓對照藥材4 g，用供試品制備方法同法制成對照品溶液。按TLC(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，乙醚-石油醚(1∶1)(60～90 ℃)為展開劑[2-3]，展開，紫外燈365 nm波長下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖1。

2.2.2山楂薄層鑒別取本品顆粒10 g，研細，甲醇100 mL回流40 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加20 mL使溶解，乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取山楂對照藥材2 g，加水100 mL煎煮40 min，濾過，濃縮至約20 mL，加稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為1～2，乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并，蒸干，加甲醇1 mL溶解，作為對照品溶液。按TLC(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(20∶20∶1)為展開劑，展開，10%硫酸乙醇顯色，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖2。

2.2.3廣藿香薄層鑒別取本品顆粒30 g，研細，乙醚100 mL回流40 min，濾過，蒸干，加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取百秋李醇對照品適量，加甲醇制成約1 mg/mL的對照品溶液。按TLC(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液5 μL、對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(95∶5∶0.2)為展開劑[4]，展開，1%香草醛硫酸溶液顯色，105 ℃加熱至斑點清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖3。

2.2.4木香薄層鑒別取本品顆粒30 g，研細，乙醚100 mL回流40 min，濾過，蒸干，加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取木香對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。按TLC(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液10 μL、對照藥材溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，1%香草醛硫酸溶液顯色，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖4。

2.3含量測定

2.3.1色譜條件采用漢邦C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.2 %磷酸溶液(4∶96)為流動相[5]；檢測波長：270 nm，柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min，進樣量：20 μL。按沒食子酸峰計理論板數(shù)應(yīng)不低于3 000。

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對照品11.90 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取1 mL,置50 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3供試品溶液的制備取本品顆粒研細，稱取2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4陰性樣品制備按“2.1”和“2.3.3”項下方法，同法制成不含石榴皮的陰性樣品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進行分析。在對照品相應(yīng)的位置上，無明顯其他峰出現(xiàn)，結(jié)果證明陰性樣品對沒食子酸測定無干擾。結(jié)果見圖5。

圖5香茯顆粒對照品(A)、樣品(B)、陰性對照品(C)的高效液相色譜圖

2.3.5標準曲線繪制分別精密量取對照品貯備液1 mL，加甲醇分別稀釋至200、100、50、25、10、5 mL，搖勻。分別吸取20 μL進樣，記錄峰面積，以沒食子酸對照品的峰面積(y)對沒食子酸對照品濃度(x)進行回歸，得回歸方程y=62 395x-37 197，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8(n=6)。試驗結(jié)果表明，沒食子酸對照品濃度在5.95～238.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.3.6精密度試驗分別吸取同一份供試品溶液，測定6次，結(jié)果RSD=0.80%。試驗結(jié)果表明精密度良好。

2.3.7穩(wěn)定性試驗取供試品溶液分別于0、2、4、8、12 h進樣，記錄峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果RSD=1.43%。試驗結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8重復(fù)性試驗取同一批樣品(批號 130121)，按照含量測定項下的測定方法，測定6次，結(jié)果含量的RSD=0.80 %。試驗結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.9加樣回收率試驗取同一批號(批號 130121)樣品(每袋含量為4.25 mg)，取6份，每份稱取1.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入沒食子酸對照品適量，置相應(yīng)錐形瓶中，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液。分別吸取20 μL進樣，計算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明本法回收率良好。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果

2.4樣品的含量測定取香茯顆粒樣品，按上述確定的色譜條件和測定方法進行含量測定，結(jié)果見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果

3討論

香茯顆粒中茯苓、山楂、廣藿香、木香的TLC鑒別研究，分別以對照品、對照藥材為對照，經(jīng)方法學(xué)考察，薄層斑點分離良好，陰性無干擾，方法具有專屬性和重現(xiàn)性，可作為質(zhì)量控制定性指標。

高效液相色譜法測定香茯顆粒含量的研究中，流動性選擇上曾采用甲醇-0.5%磷酸(5∶95)、甲醇-0.05%磷酸(5∶95)、乙腈-0.5%冰醋酸(10∶90)、甲醇-0.1%磷酸溶液(4∶96)、乙腈-0.2%磷酸溶液(4∶96)等為流動相分離沒食子酸，結(jié)果流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(4∶96)時保留時間適宜，分離效果最佳。因此選用乙腈-0.2%磷酸溶液(4∶96)為流動相。供試品溶液提取條件的選擇時，分別考察了回流、超聲和索氏提取的制備方法、不同溶媒以及提取時間，確定最佳提取工藝為取本品顆粒研細，稱取2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

參考文獻：

[1]馮立娟，尹燕雷，招雪晴，等.石榴沒食子酸代謝與保健功能研究進展[J].果樹學(xué)報，2014，31(4):710-716.

[2]寇昆明，張超.藿香正氣片中白芷、陳皮、茯苓的薄層色譜鑒別[J].基層中藥雜志，2001，15(2):28.

[3]馬瑩.六味地黃膠囊中3種藥材的薄層色譜鑒別[J].藥物鑒定，2010，20(19):31-32.

[4]姜靜，王彬彬，鄭越中.藿香正氣片中百秋李醇的薄層鑒別[J].航空航天醫(yī)藥，2003，14(1):44.

[5]張朔生.HPLC測定炮制前后石榴皮中沒食子酸的含量[J].藥物分析雜志，2010，30(6)：1104-1106.

Study on Quality Control of Xiangfu Granule

YUJuan,WANGGuo-kai

(AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo develop a quality control method for Xiangfu Granule. MethodsThe qualitative identification of Poria cocos (Schw.) Wolf, Crataegus pinnatifida Bunge, Pogostemon cablin (Blanco) Benth, and Radix Dolomiaeae, all of which are ingredients of Xiangfu Granule, was carried out using thin-layer chromatography (TLC). The content of gallic acid, which is the principal component in Punica granatum L., another ingredient of Xiangfu Granule, was determined by high-performance liquid chroma-tography. For chromatography, octadecyl silane was used as the filler; a mixture of acetonitrile and phosphoric acid (0.2%) was applied as the mobile phase (4∶96); the flow rate was 1.0 mL/min; the detection wavelength was 270 nm. ResultsThe results of TLC showed that the relevant spots were clear and well-defined without interference in the negative controls. The concentration of gallic acid showed a good linear relationship with peak area within 5.349-213.962 μg/mL (r=0.999 8). The average recovery rate was 98.48% (relative standard deviation 0.80%). ConclusionThe qualitative and quantitative methods developed in this study are simple, accurate, reliable, and repeatable.

[Key words]Xiangfu Granule; thin-layer chromatography; gallic acid; high-performance liquid chromatography

收稿日期：(2014-09-22；編輯：曹健)

[中圖分類號]R927.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.025

作者簡介：俞娟(1981-)，女，講師