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    消腫方對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細胞OPG及RANKL mRNA表達的影響

    2016-01-26 08:54:07劉安平周正新周章武徐盛文李文華
    關(guān)鍵詞:成骨細胞骨關(guān)節(jié)炎

    李 亮,劉安平,周正新,周章武,徐盛文,李文華

    (安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科,安徽 合肥 230031)

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    消腫方對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細胞OPG及RANKL mRNA表達的影響

    李亮,劉安平,周正新,周章武,徐盛文,李文華

    (安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科,安徽 合肥230031)

    [摘要]目的觀察消腫方對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細胞骨保護素(osteoprotegerin,OPG)及核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)mRNA表達的影響。方法將30只新西蘭大耳白兔隨機分為空白對照組,模型組,消腫方低、中、高劑量組,每組6只。采用改良Hulth法復(fù)制膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型,消腫方低、中、高劑量組分別給予40、80、160 g/kg消腫方煎劑灌胃,空白對照組和模型組分別以等容積生理鹽水灌胃,共28 d。光鏡下觀察兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨下骨成骨細胞形態(tài),采用RT-PCR法檢測OPG、RANKL mRNA的表達。結(jié)果空白對照組與模型組OPG mRNA表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);消腫方高、中、低劑量組OPG mRNA表達水平均較模型組顯著升高(P<0.05),具有明顯的劑量依賴性。模型組RANKL mRNA表達水平低于空白對照組,消腫方低、中、高劑量組RANKL mRNA表達水平較模型組逐漸降低,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);消腫方高劑量組RANKL mRNA表達水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。結(jié)論消腫方可上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎動物模型軟骨下骨成骨細胞OPG mRNA表達,下調(diào)RANKL mRNA表達。

    [關(guān)鍵詞]消腫方;骨關(guān)節(jié)炎;補腎活血利水法;成骨細胞;骨保護素;RANKL

    消腫方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科國家級名老中醫(yī)丁鍔教授的經(jīng)驗方,以補腎活血利水為主,對骨關(guān)節(jié)炎具有較好的療效[1]。前期研究顯示,補腎活血利水法可促進軟骨細胞增殖,抑制骨細胞凋亡,調(diào)控滑膜組織基因表達譜,其作用機制與多種細胞信號通路有關(guān)[2]。其中骨保護素/核因子-κB受體活化因子配體(osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-kappa-B ligand,OPG/RANKL)通路對骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨重建的調(diào)控作用已成為研究熱點之一[3]。本研究通過復(fù)制兔骨關(guān)節(jié)炎動物模型,觀察不同濃度消腫方對骨關(guān)節(jié)炎動物的軟骨下骨成骨細胞OPG及RANKL mRNA表達的影響,以探究消腫方治療骨關(guān)節(jié)炎的機制。

    1材料

    1.1實驗動物7月齡新西蘭大耳白兔30只,體質(zhì)量2.6~3.2 kg,雌雄各半,購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,普通級。

    1.2實驗藥物與試劑OPG、RANKL多克隆抗體:武漢博士德試劑公司;實時定量PCR擴增儀:美國Roche公司;TRIzol試劑:美國Life Technologies公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:美國Qiagen公司;DNA marker:北京天為時代公司;引物:上海滬晶生物芯片公司。

    消腫方(茯苓皮20 g,懷牛膝、黃芪各15 g,當(dāng)歸、萆薢各10 g,莪術(shù)8 g,等)生藥飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供,制備成不同濃度的水煎劑。

    1.3儀器石蠟切片機:Leica2135;BM-Ⅱ型病理組織包埋機:安徽省電子科學(xué)研究所;ZT-RP生物組織脫水機、QP切片漂烘溫控儀:湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司;Nikon80熒光顯微鏡:新飛達光學(xué)儀器公司。

    2方法

    2.1動物模型復(fù)制及分組將30只新西蘭大耳白兔隨機分為5組:空白對照組,模型組,消腫方低劑量(40 g/kg,相當(dāng)于臨床劑量3倍)、中劑量(80 g/kg)、高劑量(160 g/kg)組,每組6只。除空白對照組外,其余各組動物采用改良Hulth法[4]復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型。3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg靜脈注射麻醉,麻醉生效后,常規(guī)無菌操作、鋪巾,取兔膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)髕旁入路,切開皮膚及皮下組織、內(nèi)側(cè)支持帶及關(guān)節(jié)囊后,將髕骨向外側(cè)脫位,顯露膝關(guān)節(jié)腔,顯露內(nèi)側(cè)半月板及前交叉韌帶,依次切除內(nèi)側(cè)半月板,切斷內(nèi)側(cè)副韌帶,切斷前交叉韌帶,再逐層關(guān)閉關(guān)節(jié)囊、皮下組織、皮膚,敷料包扎切口,不予外固定,復(fù)制模型后連續(xù)4 d用青霉素3萬U肌肉注射,10 d后開始每天強迫兔活動40 min,連續(xù)6周。對消腫方低、中、高劑量組兔分別灌胃給予40、80、160 g/kg消腫方煎劑,對空白對照組和模型組兔灌胃給予生理鹽水,連續(xù)28 d。

    2.2膝關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)學(xué)觀察在相對無菌條件下于膝關(guān)節(jié)負重區(qū)用骨刀垂直于股骨髁關(guān)節(jié)面切取骨軟骨組織塊,并去除關(guān)節(jié)軟骨周圍的軟組織及骨組織,磷酸鹽緩沖液漂洗,用無水乙醇固定,脫鈣處理,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細胞。

    2.3軟骨下骨成骨細胞總RNA提取及測定采用TRIzol一步法,按產(chǎn)品操作說明提取軟骨下骨成骨細胞總RNA。采用紫外分光光度計測定總RNA的光密度(optical density,OD),計算OD260/OD280比值,測定其濃度和純度。RNA完整性的檢測采用普通瓊脂糖凝膠電泳法,提取的總RNA于-70 ℃保存。

    2.4兔軟骨下骨成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達采用RT-PCR法,以β-actin基因為內(nèi)參。OPG反應(yīng)條件[5]:95 ℃高溫變性1 min,54 ℃降溫退火40 s,71 ℃升溫延伸1 min,共30個循環(huán),最后71 ℃升溫延伸7 min。RANKL反應(yīng)條件:95 ℃高溫變性1 min,54 ℃降溫退火40 s,71 ℃升溫延伸1 min,共30個循環(huán),最后71 ℃升溫延伸7 min。引物序列:OPG上游引物:5′-TGTGGCCATGCGTTCTAGTCACCT-3′,下游引物:5′-TAGGGACCCAAGCCTTGCATCGGA-3′,擴增長度為478 bp;RANKL上游引物:5′-TTCCTCGAACTCAGTGCGAGAG-3′,下游引物:5′-CCGACCTGAGGTAATTCGCGTC-3′,擴增長度為449 bp;β-actin上游引物:5′-GAAGGCAGACGTTCAACACGGC-3′,下游引物:5′-GTGGCCATCTCACTTGCTGCAACAG-3′,擴增長度為310 bp。以15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳并拍照,對條帶的OD值進行檢測,計算條帶OD值與β-actin OD值的比值。

    3結(jié)果

    3.1兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)學(xué)變化空白對照組兔關(guān)節(jié)軟骨厚度正常,關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)正常,排列均勻(見圖1A);模型組兔關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄,關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)不規(guī)則,排列較散亂(見圖1B);各治療組可見關(guān)節(jié)軟骨厚度明顯改善,關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)不規(guī)則,排列散亂,隨治療藥物劑量增加,軟骨細胞數(shù)量增加(見圖1C—1E)。

    圖1各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)(HE染色,10×40倍)

    3.2兔軟骨下骨成骨細胞總RNA質(zhì)量鑒定提取軟骨下骨成骨細胞的總RNA,經(jīng)分光光度計分別在260 nm和280 nm波長測定OD值,計算OD260/OD280比值,所有樣品總RNA的OD260/OD280比值均在1.80~2.10之間。經(jīng)普通瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果提示RNA未被降解。

    3.3各組兔軟骨下骨成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達比較空白對照組與模型組OPG、RANKL mRNA表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);消腫方高、中、低劑量組OPG mRNA表達水平均較模型組顯著升高(P<0.05),RANKL mRNA表達水平均較空白對照組顯著降低(P<0.05);隨著消腫方劑量升高,OPG mRNA表達水平顯著升高(P<0.05),RANKL mRNA表達水平逐漸降低,其中消腫方高劑量組RANKL mRNA表達水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖2、表1。

    注:1. Marker;2. 空白對照組;3. 模型組;4. 消腫方低劑量組;5. 消腫方中劑量組;6. 消腫方高劑量組。

    表1 各組兔軟骨下骨成骨細胞OPG、RANKL mRNA相對表達水平比較

    注:同列含有相同右上標(biāo)符號的組別相比較,P>0.05;同列不含相同右上標(biāo)符號的組別相比較,P<0.05。

    4討論

    有研究[6]表明,OPG/RANKL系統(tǒng)是破骨細胞與成骨細胞之間發(fā)生互相作用的信號通道,OPG最初于1997年被兩個獨立的實驗室同時發(fā)現(xiàn)。RANKL分子由317個氨基酸組成,有一個細胞外結(jié)構(gòu)域(其中包含一個配基結(jié)合位點)、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個N端胞漿結(jié)構(gòu)域組成,可由T、B淋巴細胞、骨髓干細胞、成骨細胞前體細胞以及成熟的成骨細胞等分泌。

    最近研究[7]發(fā)現(xiàn),成骨細胞能產(chǎn)生巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)和RANKL,能夠與位于破骨細胞前體上的受體相結(jié)合,從而能刺激破骨細胞的增殖和分化,并能增加破骨細胞活力;而成骨細胞則能產(chǎn)生一種名為OPG的蛋白,與RANKL相結(jié)合,從而阻止RANKL與破骨細胞的相互作用。RANKL和OPG的平衡對于骨破壞速度起著關(guān)鍵性的作用。在雌激素缺乏的人群中,其體內(nèi)RANKL水平增加[8],當(dāng)RANKL水平過高或者OPG水平不足,將會引起骨丟失,但血液中RANKL和OPG的含量測量結(jié)果卻不支持該理論。在骨折及低骨量患者中,OPG水平升高,RANKL水平降低[9-10]。有關(guān)大鼠骨關(guān)節(jié)炎動物實驗表明,關(guān)節(jié)軟骨退變程度增加時,RANKL及runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcripttion factor,RUNX)、MCSF、血管內(nèi)皮生長因子等多種物質(zhì)顯著增加,而OPG的表達卻降低[11]。

    骨關(guān)節(jié)炎相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)“痹證”,其為本虛標(biāo)實之病。腎主骨、主水,腎虛則骨關(guān)節(jié)失養(yǎng)、水無所主,可致局部腫脹;外傷或勞損可致局部氣血運行不暢,形成瘀血,則出現(xiàn)疼痛。故本病以肝腎虧虛為本,氣滯血瘀、筋脈痹阻為標(biāo),通過中藥內(nèi)服外用以補肝腎、強筋骨、疏經(jīng)絡(luò),達到標(biāo)本兼治的目的[12]。消腫方重用牛膝以補肝腎、強筋骨、利水祛濕、活血化瘀、引血下行,用于痹痛日久、腰膝酸痛等癥,為君藥;茯苓健脾利水、滲濕消腫,黃芪健脾補中益氣,為治療氣虛水腫之要藥,兩者合為臣藥;莪術(shù)行氣破血、消積止痛,偏于行氣通絡(luò)止痛,用于痰濕阻滯所致的肢體關(guān)節(jié)疼痛;萆薢利水滲濕、祛風(fēng)除痹、通絡(luò)止痛,善治腰膝痹痛、筋脈屈伸不利,兩藥同為佐使藥。全方配伍,共奏補腎利水、活血化瘀之功,對痰、瘀、水互阻所致的骨關(guān)節(jié)炎能起較好的治療作用。本研究結(jié)果表明,消腫方中藥煎劑可顯著提高骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細胞OPG mRNA的表達水平,同時可降低成骨細胞RANKL mRNA的表達水平。由此可見,消腫方可能通過上調(diào)OPG mRNA的表達和下調(diào)RANKL mRNA的表達,抑制破骨細胞的活化,從而抑制破骨細胞的骨吸收功能。

    參考文獻:

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    Effects of Detumescence Prescription on mRNA Expression of Osteoprotegerin and Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B Ligand in Subchondral Bone Osteoblasts in Rabbits with Osteoarthritis

    LILiang,LIUAn-ping,ZHOUZheng-xin,ZHOUZhang-wu,XUSheng-wen,LIWen-hua

    (DepartmentofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China)

    [Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of detumescence prescription on the mRNA expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) in subchondral bone osteoblasts in the rabbit model of osteoarthritis. MethodsThirty New Zealand big-eared white rabbits were randomly and equally divided into blank control group, model group, and low-, middle-, and high-dose detumescence prescription groups. A model of knee osteoarthritis was established with the modified Hulth method. The low-, middle, and high-dose detumescence prescription groups received decoction of detumescence prescription (40, 80, and 160 g/kg, respectively) by gavage, while the blank control group and model group received an equal volume of normal saline by gavage. The course of treatment was 28 d for each group. The morphology of subchondral bone osteoblasts of the knee joint was observed under a light microscope. The mRNA expression of OPG and RANKL was measured by RT-PCR.ResultsThere was no significant difference in OPG mRNA expression between the blank control group and the model group (P>0.05); the high-, middle-, and low-dose detumescence prescription groups had significantly increased OPG mRNA expression compared with the model group (P<0.05), showing a significant dose dependence. The model group had lower RANKL mRNA expression than the blank control group, and the low-, middle-, and high-dose detumescence prescription groups had gradually reduced RANKL mRNA expression compared with the model group (P>0.05); the RANKL mRNA expression was significantly lower in the high-dose detumescence prescription group than in the low-dose detumescence prescription group (P<0.05). ConclusionDetumescence prescription can up-regulate the OPG mRNA expression and down-regulate the RANKL mRNA expression in subchondral bone osteoblasts in the rabbit model of osteoarthritis.

    [Key words]detumescence prescription; osteoarthritis; kidney-tonifying, blood-activating, and diuresis-promoting therapy; osteoblast; osteoprotegerin; receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand

    收稿日期:(2014-09-24;編輯:曹健)

    [中圖分類號]R684.3[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.019

    作者簡介:李亮(1979-),男,碩士,主治醫(yī)師

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